Summary
نقدم هنا، سلبية بروتوكول إلى أقسام البنكرياس البشرية الصورة في الأبعاد الثلاثة (3D) باستخدام الأمثل تطهير الطرق. هذه المخطوطة يوضح هذه الإجراءات لتطهير الضوئية السلبية تليها متعددة الفلورة تلطيخ لتحديد العناصر الرئيسية للشبكات العصبية الحسية واللاارادي إينيرفاتينج الجزر البشرية.
Abstract
استخدام الأساليب التقليدية في غذائها، تعوق الباحثين في قدرتها على الصورة كاملة أنسجة أو أجهزة في 3D على نطاق واسع. مقاطع نسيجية تقتصر عموما على < 20 ميكرومتر الفورمالين الثابتة قسم البارافين على الشرائح الزجاجية أو < 500 ميكرومتر للتعويم الحر الأقسام الثابتة. ولذلك، الجهود المكثفة مطلوبة لتقطيع المسلسل وأساليب إعادة الإعمار صورة واسعة النطاق لإعادة إنشاء 3D لعينات > 500 ميكرومتر باستخدام الأساليب التقليدية. وبالإضافة إلى ذلك، يمنع ينثر الضوء من الجزيئات داخل الأنسجة، وخاصة الدهون، التصوير بعمق > 150 ميكرومتر مع المجاهر الأكثر [كنفوكل]. الحد من تشتت الضوء والسماح لتصوير الأنسجة العميقة باستخدام الفحص المجهري [كنفوكل] بسيطة، وضعت أساليب مسح ضوئي مختلفة أن تكون ذات الصلة لعينات الأنسجة البشرية والقوارض ثابتة بالغمر. ترتبط العديد من الأساليب واستخدام crosslinking البروتين مع الاكريلاميد والأنسجة المقاصة مع دوديسيل كبريتات الصوديوم (الحزب الديمقراطي الصربي). تقنيات مسح ضوئي أخرى تستخدم المذيبات المختلفة ولو كان كل تعديل مختلف المزايا والعيوب. هنا، يتم وصف أسلوب محسن مسح بصري سلبي لدراسات تعصيب البنكرياس البشرية وعلى وجه التحديد للاستجواب من تعصيب الجزيرات البشرية.
Introduction
حتى وقت قريب، قد أنجز التعمير (3D) ثلاثي الأبعاد من الأنسجة الكبيرة أو أجهزة كاملة من خلال تقطيع المسلسل شاقة، وتلطيخ، وإعادة بناء صورة مقاطع متعددة. هذه الأساليب قد عدة عيوب منها الاعتماد على عدد كبير من المقاطع المسلسل، واختراق الأنسجة الفقيرة مع الأجسام المضادة، والضوء تناثر منع التصوير العميق داخل الأنسجة. للسماح لمزيد من الضوء واختراق جسم، طور الباحثون الطرق الكيميائية للحفاظ على البروتين المستضدات أثناء إزالة معظم الدهون تشتت الضوء. عدة تتعلق بأساليب هي تهجين "الاكريلاميد Clear Lipid-Exchanged الأنسجة التصوير جامدة" المائية (الوضوح) وتقنية الوضوح السلبي (ميثاق) التروية-ساعد "الإفراج عن عامل" في الموقع (بارس) (استعرض في 1،2 ،،من34،،من56). ويستند الأسلوب الوضوح الاستقرار للبروتينات باستخدام فورمالدهايد، الاكريلاميد، ومكررا هيدروجيل متبوعاً بإزالة الدهون باستخدام التفريد في حل الحزب الديمقراطي الصربي2. هذا النهج في وقت لاحق تعديل لتطهير السلبي ومتقدمة التصوير7. مزيد من التحسين أدت إلى القضاء مكررا ونسب متفاوتة من بارافورمالدهيد في الحل هيدروجيل (1-4 ٪) للحصول على استقرار مستضد الأمثل مع أقصر وقت التخليص لتقنية تسمى ميثاق 8. المحاولات المبكرة لتطوير هذه التقنيات البصرية المقاصة تشارك العضوية أو غيرها من المركبات التي كان من الصعب العمل مع وتطفئ البروتينات الفلورية الذاتية في نماذج الماوس المحورة وراثيا. شملت هذه الأساليب الإضافية المقاييس، تحليل الكوكتيل الدماغ/الهيئة دون عائق والحسابية (مكعب)، وأساليب التبديل وأجهزة Dimensional Imaging of Solvent-Cleared (ديسكو)، كل ذلك مع مختلف مزايا وعيوب9، 10،،من1112. تم تطوير أسلوب الوضوح الأصلية في أنسجة المخ الماوس الغنية بالدهون وأساليب مسح ضوئي حدت من الاختبار في الأنسجة البشرية7،،من811،13،14 .
أساليب المقاصة الضوئية تعتبر مثالية للأعصاب التتبع عبر مسافات طويلة كما هو الحال في النظام العصبي المركزي الماوس سليمة. البنكرياس هو معصب جيدا من أنظمة العصبي اللاإرادي والحسية على حد سواء. حجرة الغدد الصماء البنكرياس، جزر لانجرهانز، تشمل جزء صغير جداً من الجهاز كامل (1-2 ٪) والجزيرات يعرف التغاير في أحجام (50-250 ميكرومتر)، أبعاد الخلية الغدد الصماء، وكثافة خاصة في مرض السكري (استعرض في 15 ،16). في وضع بروتوكول، تم اختبار عدة أساليب مسح بصري للبنكرياس البشرية وتم العثور على إجراء اتفاق لتوفير التوازن أفضل من الوقت لمسح (~ 2 أسابيع) مع الحفاظ على الخصائص المورفولوجية ممتاز للأعصاب والجزر الصغيرة. ويرد الإجراء الأمثل النهائي هنا في رسم حدود الشبكة العصبية-الجزر لواسعة النطاق (مسافات ملليمتر) وتصوير 3D عالية الدقة متعددة جزيرات البنكرياس سليمة. الأسلوب مناسبة للبشرية البنكرياس مباشرة بعد التثبيت أو بعد التخزين، فضلا عن عينات ثابتة في الفورمالين مخزنة محايدة وجزءاً لا يتجزأ من شمع البارافين. العينات التي تصلح للتصوير بواسطة [كنفوكل] أو لايتشيت المجهري.
Protocol
جميع التجارب التي أجريت وفقا للمبادئ التوجيهية الاتحادية ومجلس المراجعة المؤسسية في جامعة فلوريدا.
تنبيه: بارافورمالدهيد واكريلاميد من المهيجات السامة. التعامل مع المواد الكاشفة في غطاء دخان مع معدات الحماية الشخصية المناسبة (معطف مختبر، والقفازات، وحماية العين).
1-ديبارافينيزيشن أنسجة الثابتة فورمالدهايد (إذا كان يعمل مع أنسجة جديدة، انتقل إلى الخطوة 2)
- استخدام شفرة حلاقة جديدة أو مشرط لقطع طريق البارافين عمودياً على سطح النسيج. قص البارافين في الحافة من الأنسجة للانتهاء من تخفيف ذلك. استخدام الملقط أو ملعقة لتخفيف بلطف وإزالة الأنسجة بمسح بصريا. بلطف كشط البارافين الزائدة من الأنسجة باستخدام ملعقة (الشكل 1A).
- ملء حاوية زجاج مع زيلين نفط (حوالي 30 مل 3 × 3 × 3 مم قسم الأنسجة) واحتضان الأنسجة في هذا الحل على 24 ساعة في درجة حرارة الغرفة (RT).
- ملء حاوية زجاجية أخرى مع زيلين نفط جديدة مع نفس وحدة التخزين ك 1.2.1. نقل واحتضان الأنسجة في هذا الحل ح 24 في الرايت
- ضع الإيثانول 100% في أنبوب مخروطي مع نفس وحدة التخزين ك 1.2.1. نقل واحتضان الأنسجة في هذا الحل ح 24 في الرايت
- ضع الإيثانول 95% في أنبوب مخروطي مع نفس وحدة التخزين ك 1.2.1. نقل واحتضان الأنسجة في هذا الحل ح 24 في الرايت
- ضع الإيثانول 70% في أنبوب مخروطي مع نفس وحدة التخزين ك 1.2.1. نقل واحتضان الأنسجة في هذا الحل ح 24 في الرايت
- شطف الأنسجة في الفوسفات 0.01 م مخزنة المالحة (PBS) ومكان في برنامج تلفزيوني م 0.01 في أنبوب مخروطي حجته على 24 ساعة في ضمان الرايت أن الأنسجة مجاني من البارافين (الشكل 1B، اللوحة اليمنى).
2-إعداد مثبت بارافورمالدهيد (PFA) 4%
- "الماصة؛" 10 مل 16% منهاج العمل في أنبوب 50 مل مخروطية، إضافة 4 مل م 0.1 برنامج تلفزيوني، وإضافة مل 26 المقطر المياه (ddH2س). قم بإغلاق الغطاء وتخلط بإيجاز.
- وحدات التخزين أكبر من 4% ويمكن إجراء منهاج العمل قدما والمجمدة في مختبرين. مختبرين جيدة لمدة يوم واحد في درجة حرارة الغرفة (RT)، أسبوع واحد في 4 درجات مئوية، وشهر 1 في-20 درجة مئوية.
3-البنكرياس التثبيت
- إصلاح العينة البنكرياس (≤ 1 × 1 × 2 سم) في طازجة 4% منهاج عمل بيجين في 4 درجات مئوية عن 48 ساعة. إذا كانت العينة أكبر من 1 × 1 × 2 سم، استخدام مشرط أو شفرة حلاقة تشريح في أصغر قطعة لا يزيد عن 1 سم. يغسل عينة الأنسجة في ثلاثة تغييرات في برنامج تلفزيوني 0.01 متر لمدة 15 دقيقة على الأقل كل الغسيل وتخزينها في أنبوب الطرد المركزي 15 مل في 0.01 ٪ PFA/0.01 M برنامج تلفزيوني أو 0.5% الصوديوم أزيد/0.01 M برنامج تلفزيوني حتى الاستخدام.
- بعد التثبيت، قسم الأنسجة إلى أقسام 1-2 مم سميكة لمزيد من المعالجة. استخدام فيبرتوم للمساعدة في تقطيع حتى.
ملاحظة: العدد النهائي للمقاطع سيعتمد على حجم العينة الانطلاق.
4-تضمين الأنسجة في المائية
- إعداد 200 مل الحل مونومر هيدروجيل بارافورمالدهيد (A4P1) الاكريلاميد/1% 4% على النحو التالي:
- مكان قارورة على الجليد في دلو على رأس لوحة إثارة مغناطيسية. تأكد من أن يجلس قارورة شقة وإضافة شريط إثارة مغناطيسية.
- تضاف العبارة التالية بالترتيب: 147.8 مل الباردة (4-8 درجة مئوية) ddH2O، 20 مل م 0.1 برنامج تلفزيوني، 20 مل الباردة (4-8 درجة مئوية) 40% الاكريلاميد الحل، مل 12.2 16% حل منهاج عمل بيجين، والبادئ 250 ملغ خامسا-044. مزيج الحل المائية كاملة مع شريط إثارة مغناطيسية لمالا يقل عن 10 دقيقة وترك الحل على الجليد للخطوة التالية.
- ضع أنبوب مخروطي 15 مل في الجليد إلى قارورة تحتوي على الحل المائية. "الماصة؛" 14 مل من محلول مونومر في الأنبوب وإضافة قطعة واحدة من العينة سميكة الأنسجة الثابتة 1-2 مم. ثم كاب الأنبوب.
- احتضان العينة في حل مركب لمدة 3 أيام في 4 درجات مئوية وحماية من الضوء. اليكووت أي حل مونومر المتبقية ومخزن في-20 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل.
5-ديغا الحل مونومر وبلمره المائية
- إزالة الأوكسجين من الحل مونومر المائية باستخدام غاز N28.
- تحضير دلو من الجليد ومكان العينة في حل مونومر المائية على الجليد.
- جمع الإبر إبر عيار 18 2-3، كل عينة والفيلم البارافين وجهاز ضبط وقت. توصيل الأنابيب إلى خزان النتروجين بحيث يمكن تدفق النيتروجين. مع الاحتفاظ بالعينة على الجليد، بعناية بيرس الحد الأقصى من أنبوب مخروطي المحتوية على العينة على جانب واحد واضغط على أحد إبرة هيبوديرميك عن طريق حتى يتم تحت سطح السائل مونومر الحل.
- استخدام إبرة حقن أخرى للثقب على الجانب الآخر من عملية النداءات الموحدة، ولكن لا يسمح لها تصبح مغمورة.
ملاحظة: سوف تنفيس الإبرة الثانية الأنبوب. - توصيل الأنبوب من خزان النتروجين إبرة حقن المغمورة تحت المائية وتتحول ببطء في النيتروجين حتى أنه هو السطح باطراد من خلال السائل.
- تسمح النيتروجين إلى فقاعة من خلال السائل لمدة 10 دقائق.
- بمجرد إزالة الأوكسجين، بسرعة إزالة كل الإبر وتغطية الحد الأقصى مع فيلم الكيروسين لمنع أي مزيد من تبادل الغازات بين الأنبوب والبيئة. ضع العينة ديجاسيد في حاضنة في 37 درجة مئوية ح 3 بلمرة المائية.
6-الأنسجة المقاصة
- إعداد 500 مل مسح الحل (4% الحزب الديمقراطي الصربي في الأس الهيدروجيني 8.5). إلى ~ 300 مل من ddH2س، إضافة 50 مل م 0.1 برنامج تلفزيوني و 20 ز الحزب الديمقراطي الصربي مسحوق بينما التحريك مع شريط إثارة مغناطيسية. ضبط الحل باستخدام هيدروكسيد الصوديوم وحمض الهيدروكلوريك إلى pH 8.5. إضافة ddH2س حتى يصل الحجم النهائي 500 مل.
- بعد البلمرة، صب بعيداً من المائية الزائدة وتخلص منه في حاوية نفايات كيميائية. استخدم منشفة ورقية لمسح المائية بعيداً من العينة بلطف وتجاهل في حاوية نفايات كيميائية.
- تغسل العينة في 3-5 تبادل 0.01 M برنامج تلفزيوني (تجاهل الغسيل السائل في النفاية الكيميائية) لمدة 15 دقيقة كل خطوة الغسيل. نقل العينة في أنبوب 50 مل مخروطية مع 40 مل من مسح المخزن المؤقت.
- احتضان العينة في المخزن المؤقت للمقاصة عند 37 درجة مئوية وتغيير العينة إلى المخزن المؤقت لتطهير جديدة كل يوم.
- ترك العينة في المخزن المؤقت للمقاصة لمدة 2-8 أسابيع تبعاً لحجم العينة (~ 8 أسابيع بالنسبة 3 مم × 3 مم × 3 مم عينة) لضمان تطهير مناسب.
- مراقبة إزالة الأنسجة وتوقف عند الانتهاء. ضمان الشفافية على نحو كاف العينة بعقد تصل إلى الضوء للتأكد من تطهير مناسب (عادة بعض تلوين تان ستظل في منطقتي إفرازات).
ملاحظة: سوف يظهر نموذج مسح الإفراط المتوترة في الحواف والنسيج لينة جداً عندما التقطت بالملقط. ومن الشائع للعينة لمسح غير متكافئ. أيضا، لن تكون الأنسجة شفافة تماما حتى توضع في تركيب وسائط (إدراج، الشكل 1).
7-متعددة الفلورة
- تغسل العينات على شاكر لفة في الدقيقة 60 في RT لمدة يوم واحد مع 40 مل م 0.01 PBS المتغيرة إلى الطازجة من المخزن المؤقت غالباً (المخزن المؤقت 4-5 التغييرات في مجموع 40 مل كل غسل، تغيير كل ح حتى الغسيل النهائي). واسمحوا الغسيل النهائي تستمر طوال الليل في الرايت
- إعداد ميثاق تلطيخ المخزن المؤقت. إلى 500 مل م 0.01 PBS، إضافة أزيد الصوديوم 50 ملغ و 0.5 مل تريتونكس-100. مزيج جيد.
- احتضان العينة مع الأجسام المضادة الأولية.
- إضافة 2% المصل العادي (نفس الأنواع كجسم الثانوي) للميثاق قاعدة تلطيخ المخزن المؤقت في أنبوب 2 مل مسطحة قاع (مستحسن على الأقل 1 مل إجمالي حجم كل عينة/أنبوب).
- إضافة جسم الأساسي للميثاق/2% المصل تلطيخ المخزن المؤقت. استخدام حوالي 5 × كمية الأجسام المضادة الأولية لتلطيخ الميثاق كما ستستخدم immunohistochemistry القياسية (أي إذا كان جسم المخفف 1: 500 لمعيار إيمونوهيستوتشيميستري، استخدام 1: 100 لتلطيخ ميثاق).
- استخدام ملعقة لإزالة العينة من المخزن المؤقت الغسيل والدأب المخزن المؤقت الزائدة قبالة على منشفة ورقية، ثم ضع في الأنبوب مع حل جسم الأولية.
- احتضان 2-4 أيام في RT على شاكر 60 لفة في الدقيقة. غسل العينات جيدا في RT على شاكر لفة في الدقيقة 60 في برنامج تلفزيوني 0.01 م المتغيرة إلى المخزن المؤقت الطازجة 4-5 مرات وترك الغسيل النهائي في ليلة وضحاها كما في الخطوة 7، 1.
- احتضان عينات مع الأجسام المضادة الثانوية.
- إضافة 2% المصل العادي (نفس الأنواع كجسم الثانوي) للميثاق قاعدة تلطيخ المخزن المؤقت في أنبوب 2 مل مسطحة قاع (من المستحسن 1 مل إجمالي حجم كل عينة/أنبوب).
- إضافة الأجسام المضادة الثانوية بتركيز 1: 200 (5 ميليلتر في المخزن المؤقت لمل 1).
ملاحظة: تنسيق صغيرة الأضداد: أضداد المفضل، فضلا عن شدة تمتز الصليب إذا كان استخدام واحد أو أكثر من الأجسام المضادة الأولية. - استخدام ملعقة لإزالة العينة من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي والدأب المخزن المؤقت الزائدة قبالة على منشفة ورقية، ثم ضع في الأنبوب مع حل جسم ثانوية.
- احتضان في RT على شاكر 60 لفة في الدقيقة لمدة يومين وحماية العينة من الضوء.
- غسل العينات جيدا، كما هو الحال في الخطوة 7-1، في RT على شاكر لفة في الدقيقة 60 في برنامج تلفزيوني 0.01 م المتغيرة إلى المخزن المؤقت الطازجة 4-5 مرات وترك النهائي تغسل في ليلة وضحاها، حماية من الضوء خلال يغسل.
8-تركيب عينات لتصوير
- إعداد المخزن المؤقت حل المتطابقة (دواليب) الانكسار.
- تزن بها 11 غ متوسطة الكثافة غير الأيونية التدرج (مثلاً، هيستودينز) ونقلها بعناية إلى أنبوب مخروطي 50 مل.
- إضافة ~ 5 مل م 0.02 الفوسفات المخزن المؤقت (PB)8 باستخدام ملعقة للإفراج عن الهواء من مسحوق غير الأيونية الكثافة المتوسطة التدرج.
ملاحظة: سوف تكون لزجة جداً الحل، ومزيج جيد. - إحضار وحدة التخزين إلى 10 مل باستخدام أكثر من الجريدة الرسمية، وتخلط مع ملعقة وكشط الزائد قبالة الملعقة في الأنبوب.
- احتضان الحافات عند 37 درجة مئوية حتى يذوب وعكس وتخلط برفق حسب الحاجة.
- نقل العينات إلى الحافات. للقيام بذلك، "الماصة؛" 1 مل دواليب في أنبوب مسطحة القاع 2 مل. استخدام ملعقة لإزالة العينة من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي والدأب المخزن المؤقت الزائدة قبالة على منشفة ورقية، ثم ضعه في الأنبوب مع دواليب الحل.
- اضغط برفق الأنبوب إلى غمر العينة في الحافات. وضع العينات في دواليب على مقاعد البدلاء محمية من الضوء على RT لمدة 2-4 أيام قبل التصوير.
- للصورة، ضع كمية صغيرة من الحافات إلى شريحة دائرة السفلي ساترة 8-جيدا. إضافة فقط ما يكفي لمعطف الأسفل، وأكثر سوف تتسبب في العينة لتعويم مما يجعل من الصعب أكثر الصور المتعلقة نطاق مقلوب. إضافة النموذج إلى البئر وكاب الشريحة للتصوير.
9-التصوير
- [كنفوكل] مجهرية وبرامج التصوير
- حدد الليزر المناسبة للإثارة وأطياف الانبعاث من فلوروفوريس المستخدمة لوصمة عار في نماذج ميثاق. ضبط إعدادات البرنامج اقتناء حتى أن يتم التخلص من أي تداخل بين القنوات. استخدام مسارات منفصلة إذا لزم الأمر (عندما fluorophores اثنين مماثلة الإثارة الأطياف).
- قم بإعداد الحصول على الصور
- اختر سرعة اكتساب الحد الأقصى 16 بت، والمتوسطات 4 أو أكثر ودقة 1024 × 1024 بكسل أو أفضل.
- تكبير/تصغير إلى الكائن إلى تصويرها.
ملاحظة: هذا إنقاص وقت الامتلاك للحد من تبييض الصورة وأيضا تقليل حجم الملف وتحرير المتلقين للمعلومات.
- الإعداد z-المكدس.
- حدد تمزيقها المثلى لتحقيق الهدف قيد الاستخدام. إذا كان المطلوب هو deconvolution لاحقاً، استخدم z خطوة أصغر من مثلى مثل 1 ميكرومتر.
- استخدام التصحيح z-المكدس.
- تبدأ أقرب سطح الأنسجة وزيادة المكاسب كما يركز الهدف من خلال z-الطائرة وإضافة التصحيحات. لا تغير الإعدادات الليزر للتصحيح!
- الحصول على مكدس اختبار مع واحد في المتوسط، والقرار 512 × 512 وسرعة الحصول على الحد الأقصى. التحقق من الصورة في 3D للتأكد من أن هناك السطوع متساوية في جميع أنحاء المكدس لكل لون قبل الحصول على الاستبانة النهائية z-المكدس.
- تصوير لايتشيت
- ضمان أن العينات قد تم اكويليبراتيد في دواليب للتصوير لمالا يقل عن 24 حاء ومن الناحية المثالية، ونقل العينات إلى دواليب جديدة في قاعة التصوير وتسمح لحجته في الدائرة لمدة يوم واحد على الأقل.
- جبل العينة للتصوير
- حدد الشعرية (أسود) أصغر جبل عينة
- استخدام المعجون أو طبق لعقد العينة أثناء تطبيق الغراء سوبر إلى نهاية شعري. الصق الأنسجة إلى الشعرية لمس القليل على سطح النسيج قدر الإمكان.
- إدراج نموذج للتصوير.
- صورة باستخدام 5 X أو 25 X أهداف مناسبة لفحص عينات تم مسحها ضوئياً باستخدام المحور الخيار. في حالة حدوث النسخ المتماثل أو طمس، تدوير العينة وحاول مرة أخرى، أو ترك العينة لا تزال حجته في دواليب.
ملاحظة: كومة 1 مم يمكن عادة الحصول عليها في أقل من خمس دقائق، اعتماداً على إعدادات. - عرض وتحرير رصات الصور باستخدام برمجيات تحليل الصورة.
Representative Results
ووضعت هذه الإجراءات المصبوغة لتقديم دراسة واسعة النطاق للبنكرياس البشرية دراسة الجزر الصغيرة وشبكات اللاإرادي والحسية المرتبطة بها. تم اختبار العديد من الإجراءات بما في ذلك الوضوح7، إيديسكو17، و ميثاق8 مع أسلوب ميثاق العثور على أفضل ملاءمة للبشرية البنكرياس وتصوير [كنفوكل].
تم اختبار الأجسام المضادة الأولية في البداية على ثابت عينات البنكرياس البشرية مع عينات مناسبة الرقابة الإيجابية والسلبية (الماوس الدماغ، وغيرها). الأجسام المضادة الأولية واقترح تخفيف ترد في الجدول للمواد، على الرغم من أن يمكن أن نتوقع كل مختبر لتحسين تخفيف جسم تبعاً لمصدر الكثير العدد والأنسجة. جسم الابتدائي الكثير-الكثير الاختلاف يمكن أن تؤثر على كثافة المصبوغة والخصوصية، وتتطلب التحقق من الصحة لتحقيق نفس الدرجة من الكثافة وصمة عار كما هو الحال مع الكواشف السابقة.
كانت رسمتها جزيرات في البنكرياس البشري، الأنسولين والجلوكاجون وسيكريتوجرانين 3 (الشكل 2). تم تحديد خلايا شوان استخدام البروتين حمض فيبريلاري الدبقية (توصيني، الشكل 2 و الشكل 3 ألف). تم تصويرها الأعصاب ملطخة بأضداد الببتيد المعوي علامة الجهاز السمبتاوي فعال في الأوعية (VIP) في لايتشيت (الشكل 3B). يمكن رؤية الأعصاب متعاطفة مع تلطيخ ل hydroxylase التيروزين (غير معروضة).
رقم 1. مسح بصري البنكرياس البشرية. (أ) يتم استخدام شفرة حلاقة لخفض وتخفيف جزء من النسيج جزءا لا يتجزأ من البارافين (لوحات أعلى) قبل إزالة المقطع الأنسجة وكشط بعيداً البارافين الزائدة من الأنسجة (الألواح السفلي). يتم عرض عينات الأنسجة التمثيلية قبل (ب أعلى اليسار، ج) ، وبعد تطهير الضوئية (ب الحق، الأوسط ج) جزءا لا يتجزأ من البارافين الأنسجة، كما هو موضح في المقطع بروتوكول. الأنسجة الثابتة المطهرة، وليست شفافة تماما بعد مسح (ب حق، أعلى ج) وكثيراً ما الأنسجة تورم يمكن أن يكون موضع تقدير (ج، الفريق الأوسط). الأنسجة المطهرة يصبح شفافاً تماما بعد الموازنة في دواليب (ج، لوحة أقل). تغيير حجم أشرطة: 500 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2. الشبكة العصبية الجزر البشرية. وتم تطهير عينات البنكرياس البشرية كما هو موضح من نبود الجهاز الجهات المانحة أو من الأنسجة جزءا لا يتجزأ من البارافين المحفوظات. (أ-د) خلايا شوان (توصيني + أبيض) وتظهر خلايا الغدد الصماء ملطخة بالانسولين (أحمر) والجلوكاجون (أخضر). (أ) كونفوكال يظهر الفحص المجهري وأقصى كثافة الإسقاط (MIP) تتبع خلايا شوان (توصيني +) على الأعصاب التعقيب بجوار الأوعية الدموية في محيط جزيرة ليلى وتمتد إلى الجزر. يوضح اقحم عالية الدقة التي تم الحصول عليها، ويظهر الاتصال بين خلايا "شوان" توصيني + وخلايا الغدد الصماء. (ب) صورة ثلاثية الأبعاد للوحة (الحجم: x = 50 ميكرومتر، y = 20 ميكرومتر، z = 25 ميكرومتر) ألف ويرد عينة بارافين-ميثاق المصورة عن طريق الفحص المجهري [كنفوكل] وقدم إسقاطاً كثافة ماكس (ج) وثلاثي الأبعاد (D)، مقياس: x, y = 50 ميكرومتر، z = 25 ميكرومتر). مقياس أشرطة أ، ج: 50 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3-3D التصور وخياطة. اقتنيت ثلاث رصات الصور مخيط خلايا شوان الملون استخدام توصيني والفحص المجهري [كنفوكل] وتتبع باستخدام البرنامج المساعد الراسم نورت في برمجيات تحليل الصورة. (أ) التعبئة 3D للتتبع ويرد (مقياس أشرطة: x = 150 ميكرومتر، y = 200 ميكرومتر (0.2 مم)، z = 120 ميكرومتر) عينة ميثاق A (ب) كانت ملطخة بجسم كبار الشخصيات وتصويرها باستخدام مجهر لايتشيت. المكدس > 1 مم في العمق والألياف العصبية، ويتم رؤيتها بوضوح في دقة عالية. يمكن رؤية الألياف التفاف مجرى هواء (د، المقدمة)، والعقدة (ز، الخلفية) (شبكة كبيرة: x, y, z = 200 ميكرومتر؛ علامات التجزئة: x, y, z = 40 ميكرومتر). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Discussion
وأتاح توافر أساليب مسح ضوئي جديد الامتحانات واسعة النطاق لم يسبق لها مثيل من المركزية وأنظمة العصبي المحيطي في نماذج حيوانية. أنماط تعصيب عموما في البنكرياس البشري غير مستكشفة إلى حد كبير بسبب كثافة الأنسجة والصعوبات في الحصول على بيوسبيسيمينس عالية الجودة. ويوفر هذا البروتوكول أنسجة أمثل إزالة البروتوكول للأنسجة البشرية البنكرياس من العينات الأرشيفية سواء الثابتة أو جزءا لا يتجزأ من البارافين.
مسح الوقت يعتمد على حجم العينة، ونوع مثبت، ومدة، ومدة التخزين وقد تتطلب 1-8 أسابيع، حيث الاعتبارات التالية ضرورية. فمن الأفضل لمسح أنسجة قريبا بعد تثبيت البرنامج منهاج العمل 4% إذا أمكن للتخزين طويل الأجل يزيد وقت التخليص. لتقليل وقت التخليص، انخفض بمقدار منهاج عمل بيجين في مونومر المائية من 4% كما هو مستخدم في هذه الخطوة تثبيت % 1 للبنكرياس البشرية. للأنسجة الأخرى، لا سيما الأنسجة الماوس، يجب تحديد مقدار منهاج العمل اللازمة لتوفير صلابة المائية كافية للحفاظ على المستضدات تجريبيا. إزالة كافية ضروري أيضا حيث يتم تقليل اختراق جسم في أنسجة تطهير سيئة وهو زيادة السطح تلطيخ بالأجسام المضادة الثانوية. تغيير الحل إزالة كل يوم (أو أخرى، يوميا حتى) أفضل للحفاظ على درجة الحموضة ثابت والمنظفات الطازجة. على العكس من ذلك، زائداً المقاصة سلبيا يؤثر مورفولوجيا الخلوية ويزيد تنفسها الأنسجة. نظراً لبعض عينات البنكرياس واضحة غير متكافئ بسبب الأمراض الملازمة لمثل مناطق التليف من التهاب البنكرياس المزمن أو الأمراض الأخرى، من المهم كثيرا ما رصد هذه العملية. استخدام المقاطع فيبرتوم سميكة يمكن استخدامها أيضا لجعل سمك موحد حتى الآن غير مطلوبة. رصد عملية المقاصة، حيث تتم إزالة عينات من المنظفات في أقرب وقت بسهولة يمر الضوء من خلال العينة، ويضمن أن يتم مسح العينة بما فيه الكفاية.
اختراق جسم وتلطيخ السطحية من القضايا الهامة للنظر مع عينات الميثاق. لضمان اختراق جسم جيدة، من المهم لاحتضان عينات مع الأجسام المضادة الأولية لمدة يومين على الأقل. معدلات انتشار مختلف الأجسام المضادة المختلفة وينبغي أن يكون الأمثل على حدة، ولكن لمعظم الأجسام المضادة، كان 4 أيام مدة تكفي لاختراق كامل في عينة3 1 مم. إذا تلطيخ السطح مشكلة، خاصة بالنسبة للتصوير لايتشيت، وقد قطع العينة في نصف أو السطح تشريح بعيداً بعد تلطيخ. يمكن توقع أجسام صغيرة الشكل عندما تكون متاحة للمساعدة في اختراق الأنسجة8. لا تظهر الأجسام المضادة بريكونجوجاتيد العمل، فضلا عن استنساخ unconjugated نفسه، ويمكن أن تكون الخلفية أعلى من اختراق الأنسجة الأكثر فقراً والملزمة غير محدد ولاحظ ما إذا كانت تعمل على الإطلاق. لتحسين النجاح مع الأجسام المضادة بريكونجوجاتيد، زيادة مصل وتركيزات تريتونكس-100 في تلطيخ المخزن المؤقت واستخدام إينكوباتيونس أطول (> 4 أيام). بعد تلطيخ، الحضانة للعينة في دواليب لعدة أيام أمر بالغ الأهمية. تضخم الأنسجة تم مسحها في برنامج تلفزيوني ودواليب الحضانة يسبب لهم أن يتقلص إلى الحجم الأصلي. لا سيما مع التصوير لايتشيت، وينبغي أن اكويليبراتيد العينة تماما قبل التصوير.
عند تصوير العينات في المجهر [كنفوكل]، يجب تعيين التصحيح في كل مرة يتم اختيار موقع جديد. مختلف الأعماق اقتناء والتباين في تلطيخ كثافة في جميع أنحاء الأنسجة يتطلب تعديلات لكل منطقة من الأنسجة تصويرها على النحو الأمثل. وبالمثل، يجب النظر بعناية في الأجسام المضادة الثانوية المستخدمة. تحدي الطيفية اتقانا في عينات الميثاق، ولذلك يجب اختيار فلوروفوريس المناسب التداخل الإثارة أو انبعاثات منخفضة لضمان إشارة ساطعة عند تصفية الانبعاثات في المجهر [كنفوكل]. لكل تطبيق، يجب أن توازن بين القرار وسرعة التصوير، والحد من الضوضاء حتى أنه يمكن الحصول على أفضل جودة صورة دون تبييض الصورة. القرار أكبر من 1024 × 1024 لا يمكن كشفها بالعين البشرية، لكن قد يكون من الضروري لبعض التطبيقات إذا كان هناك حاجة للتحديد الكمي لوصمة عار.
وهناك العديد من الأشياء في الاعتبار عند اختيار أسلوب مسح ضوئي وعند اختيار مسح بصري على الأساليب التقليدية الأخرى. قد لا يمكن كشفها باستخدام الأسلوب الميثاق وبالتالي هناك قيود على الكشف عن مستضد المستضدات وفرة منخفضة. بعض المستضدات مثل المستضدات المناعية (CD3، خلايا CD4، CD8، إلخ) يتم تدميرها بواسطة الأسلوب الميثاق ولا يمكن الكشف عنها على الرغم من الأجسام المضادة عالية الجودة المتاحة للكشف عليهم. قيد آخر من هذا الأسلوب هو التغير المتأصلة بين البنكرياس الجهات المانحة التي يصعب تمييز حتى بعد تطهير تلطيخ. كل الأنسجة المانحة يميل إلى مسح ووصمة عار وبالمثل بين الإجراءات، ولكن الأنسجة المختلفة المانحة لها أوقات التخليص متباينة على نطاق واسع ونوعية مورفولوجيا الأنسجة بعد المقاصة. القدرة على استخدام الأنسجة المحفوظات قد تخفيف هذا القيد إذا واحد يمكن أن يكون الوصول الكافي إلى عدد كبير من عينات البنكرياس المريض على الرغم من أن هذا ليس تم التحقيق جيدا. تم العثور على بروتوكول الاتفاق ذكرت هنا أن تكون غير مكلفة وسهولة تنفيذها مع معدات المختبرات القياسية. مسح العينات كانت مناسبة للتصوير عن طريق الفحص المجهري [كنفوكل] التقليدية، فضلا عن 2-فوتون والتكنولوجيات لايتشيت وقدمت عالية الدقة صور ثلاثية الأبعاد للأعصاب والجزر الصغيرة في قطاعات كبيرة من البشرية البنكرياس. وتشمل التطبيقات المستقبلية لهذا الإجراء دراسات بشأن تطوير بنكرياس الجنين للدراسات جزيرة ليلى في النوع 1 والمقصورات وافرازات الغدد الصماء وداء السكري من النوع 2.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
يشكر المؤلفون الدكتور Ann فو وجوزيف كانزانو لتقديم المساعدة التقنية، والدكتورة جنيفر تريويك للمشورة لا تقدر بثمن، والدكتورة كريستين أوفرتون والدكتور كارل ديسيروث للتدريب إلى MCT من خلال حلقة العمل "جامعة ستانفورد الوضوح". نبود JDRF و "المنظمات شراء الجهاز" وقدمت عينات الأنسجة. تم تمويل هذا العمل من JDRF (47-2014-1) ونيدك 1OT2 TR001773 إلى MCT هلمسلي الخيرية الثقة (HCT 2015-PG-T1D052).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x phosphate buffered saline (PBS) | Fisher | BP399-1 | Buffers |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous | Fisher | S375-500 | PB buffer (RIMS) |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | 71507-250 | PB buffer (RIMS) |
| 16% paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15714-5 | Immersion fixation, hydrogel, storage solution |
| 40% acrylamide | Bio-Rad | 161-0140 | Hydrogel |
| 2% bis-acrylamide | Bio-Rad | 161-0142 | Hydrogel |
| VA-044 initiator | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | VA044 | Hydrogel |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Fisher | BP166-5 | Clearing buffer |
| Sodium azide | Sigma | S8032 | Sample storage buffer |
| 18 gauge needles | Fisher | 14-840-91 | Degassing hydrogel solution |
| N2 tank | AirGas | various | Degassing hydrogel solution |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 100 ml | Buffers |
| Goat, normal serum | Vector | S-1000 | Use as 2% in blocking buffer |
| Histodenz | Sigma | D2158-100G | RIMS |
| 8-well chamber slides | Ibidi | 80827 | Imaging |
| Laser scanning confocal microscope | Zeiss | 710 | Imaging |
| LightSheet microscope | Zeiss | Z1 | Imaging |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary Antibody | |||
| CD45 | Bioss | bs-4820R-A488 | Host: Rabbit Dilution: 1:100 Comments: Did not work |
| CD45 | DAKO | M0754 | Host: Mouse Dilution: 1:200 Comments: Did not work |
| GFAP | DAKO | Z0334 | Host: Rabbit Dilution: 1:50 Comments: Worked |
| Glucagon | BD Biosciences | 565891 | Host: Mouse Dilution: 1:50 Comments: Worked |
| Glucagon | Cell Signaling | 2760S | Host: Rabbit Dilution: 1:200 Comments: Did not work |
| Glucagon | Abcam | ab10988 | Host: Mouse Dilution: 1:200 Comments: Worked |
| Insulin | DAKO | A0564 | Host: Guinea Pig Dilution: 1:200 Comments: Worked |
| NCAM (CD56) | DAKO | M730429-2 | Host: Mouse Dilution: 1:50 Comments: Did not work |
| NCAM (CD56)-FITC conjugate | DAKO | M730429-2 | Host: Mouse Dilution: 1:50 Comments: Did not work |
| Peripherin | EnCor | RPCA-Peri | Host: Rabbit Dilution: 1:100 Comments: Worked |
| PGP9.5 | DAKO | Z5116 | Host: Rabbit Dilution: 1:50 Comments: Did not work |
| Secretogranin 3 | Sigma | HPA006880 | Host: Rabbit Dilution: 1:200 Comments: Worked |
| Smooth muscle actin | Sigma | A5228; C6198 (Cy5) | Host: Mouse Dilution: 1:200; 1:200 Comments: Worked; Conjugated worked better than unconjugated |
| Substance P | BioRad | 8450-0505 | Host: Rat Dilution: 1:200 Comments: Worked |
| Tyrosine Hydroxylase | Millipore | AB152 | Host: Rabbit Dilution: 1:200 Comments: Worked |
| Tyrosine Hydroxylase | Abcam | Ab76442 | Host: Chicken Dilution: 1:100 Comments: Worked, but weak staining |
| Vasoactive Intestinal Peptide (VIP) | Immunostar | 20077 | Host: Rabbit Dilution: 1:100 Comments: Worked |
| Vesicular Acetylcholine Transporter (VAChT) | Synaptic Systems | 139103 | Host: Rabbit Dilution: 1:50 Comments: Worked |
| Secondary Antibody | |||
| Guinea pig IgG | ThermoFisher Scientific | Various | Host: Goat Dilution: 1:200 Comments: AlexaFluor conjugates |
| Mouse IgG | ThermoFisher Scientific | Various | Host: Goat Dilution: 1:200 Comments: AlexaFluor conjugates |
| Rabbit IgG | ThermoFisher Scientific | Various | Host: Goat Dilution: 1:200 Comments: AlexaFluor conjugates |
| Rat IgG | ThermoFisher Scientific | Various | Host: Goat, Donkey Dilution: 1:200 Comments: AlexaFluor conjugates |
| Chicken IgG | ThermoFisher Scientific | Various | Host: Goat Dilution: 1:200 Comments: AlexaFluor conjugates |
References
- Ariel, P. A beginner's guide to tissue clearing. Int J Biochem Cell Biol. 84, 35-39 (2017).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Orlich, M., Kiefer, F. A qualitative comparison of ten tissue clearing techniques. Histol Histopathol. , 11903 (2017).
- Treweek, J. B., Gradinaru, V. Extracting structural and functional features of widely distributed biological circuits with single cell resolution via tissue clearing and delivery vectors. Curr Opin Biotechnol. 40, 193-207 (2016).
- Hsueh, B., et al. Pathways to clinical CLARITY: volumetric analysis of irregular, soft, and heterogeneous tissues in development and disease. Sci Rep. 7 (1), 5899 (2017).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).
- Treweek, J. B., et al. Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high-resolution intact circuit mapping and phenotyping. Nat Protoc. 10 (11), 1860-1896 (2015).
- Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nat Methods. 13 (10), 859-867 (2016).
- Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nat Neurosci. 18 (10), 1518-1529 (2015).
- Woo, J., Lee, M., Seo, J. M., Park, H. S., Cho, Y. E. Optimization of the optical transparency of rodent tissues by modified PACT-based passive clearing. Exp Mol Med. 48 (12), e274 (2016).
- Murray, E., et al. Scalable Proteomic Imaging for High-Dimensional Profiling of Intact Systems. Cell. 163 (6), 1500-1514 (2015).
- Lee, H., Park, J. H., Seo, I., Park, S. H., Kim, S. Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine. BMC Dev Biol. 14, 48 (2014).
- Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nat Methods. 10 (6), 508-513 (2013).
- Campbell-Thompson, M. Organ donor specimens: What can they tell us about type 1 diabetes? Pediatr Diabetes. 16 (5), 320-330 (2015).
- Kim, A., et al. Computer-assisted large-scale visualization and quantification of pancreatic islet mass, size distribution and architecture. J Vis Exp. (49), (2011).
- Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
