준비 번데기 기간 및 초파리 guttifera 의 날개 색소 측정 방법
Summary
번데기 기간 및 측정 초파리 guttifera 의 날개 염색의 준비에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 준비와 염색의 정량화 성인 특성의 발달 기계 장치를 공부에 대 한 견고한 기초를 제공 하 고 특성 개발의 interspecific 비교 사용.
Abstract
다양 한 종의 초파리 (과일 파리) 개발 및 유전자 변화 진화 변화에 대 한 책임의 메커니즘을 연구 하는 기회를 제공 합니다. 특히, 성인 무대 날개 착 색 비교를 포함 하 여 interspecific 비교 형태학 상 특성의 풍부한 원천입니다. 공부 하 고 종 간의 발달 차이, 자세한 관찰과 적절 한 준비는 정확한 비교 필요 합니다. 여기 우리가 번데기 기간의 준비 및 폴카 점 과일 파리, 초파리 guttifera착 색 날개의 정량화에 대 한 프로토콜을 설명합니다. 첫째, 자세한 형태 관찰 및 형태학에 따라 번데기 단계의 정의 방법을 설명 합니다. 이 방법은 외부 chitinous 사건의 번데기, 번데기 형태학의 상세한 관측을 사용 하는 puparium를 제거 하기 위한 기술을 포함 합니다. 둘째, 우리는 정의 된 번데기 단계 기간을 측정 하기 위한 방법을 설명 합니다. 마지막으로, 디지털 이미지 및 ImageJ 소프트웨어를 사용 하 여 이미지 분석에 따라 날개 염색의 정량화에 대 한 방법을 설명 합니다. 이러한 방법으로, 우리는 번데기 단계 동안 성인 특성의 발달 과정을 비교 하기 위한 견고한 기초를 설정할 수 있습니다.
Introduction
초파리 의 형태학 특성 중 일부는 종1,2,3,,45중 다양. 우리는 질문에 접근할 수 있다 어떻게 형태학 상 다양성의이 형태학의 세대의 메커니즘을 비교 하 여 발생. 이러한 형태학의 예로 애벌레 trichomes, 성인 섹스 빗, 외부 생식 기 기구, 복 부 착 색, 및 날개 염색6,7,,89, 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15. 성인 간의 형태학 적 차이 연구, 관찰 및 번데기 단계 분석, 때문에 중요 하다 성인 특성의 운명을 후반 애벌레 단계에서 결정 되 고 후속 morphogenesis 번데기 기간 동안 진행.
초파리 melanogaster의 발달 생물학 연구에서 “시간 APF” (번데기 형성 후 시간)16번데기 단계 표시 하는 일반적인 방법입니다. 이 시스템 번데기 형성 후 절대 시간을 고용 하 고 일상적인 실험에 대 한 매우 편리 하다. 그러나, 발달 속도 pupae, 사이 다를 수 있습니다 약간의 유전적, 후 또는 microenvironmental 차이 의해 영향을 받을 수 있고 따라서 같은 데 번데기 형성 후 절대 시간을 보장 하지 않습니다 pupae 동시는 발달 단계입니다. 대부분의 경우, 형태학 상 특징에 의해 정의 하는 단계는 여러 개인 비교를. 특히, 종 사이 비교에 해당 (동종) 단계 중 비교 정확한 준비 필요합니다.
베인 브리지 및 Bownes17 인식 20 번데기 단계 (P15(ii)) P1 초파리 melanogaster pupae의 형태학 적 특징에 따라. 이 발판은 형태학 상 발달 준비18의 가장 널리 사용 되는 시스템 이다. 이전 연구에서 우리는 날개 염색 연구19에 대 한 기초 확립 초파리 guttifera 의 번데기 준비 수행. D. guttifera 그것의 날개에 검은 물방울 패턴 있으며 날개 색소 형성20모델 종 중 하나입니다. 우리가 형태학 기준에 설명 된 간주 브릿지 Bownes’ 연구17, 우리는 직접 직렬 관찰19, 베인 브리지 및 Bownes의 추정 단계 기간을 사용 하는 대신 단계 기간을 측정 주파수를 관찰 했다. 여기 우리가 번데기 준비의 방법 및 측정의 Fukutomi 외19에 사용 되는 초파리 의 번데기 단계의 기간을 설명 합니다.
날개 착 색의 개발 메커니즘 연구, 번데기 또는 성인 단계에서 색소 발생 시 알아야 합니다. Fukutomi 외. 19 날개 이미지의 이미지 분석에 의해 번데기 및 성인 단계 동안 착 색의 광학 밀도 (ODs)을 측정할. 초파리 날개의 착 색 검은 멜 라 닌21의 축적으로 인 한 것으로 생각 된다. ODs의 정량화, 그레이 스케일 이미지와 ImageJ 소프트웨어 (https://imagej.nih.gov/ij/)22 사용 되었다. 인식 하 고 계량 자리 전용 착 색 (ΔOD), 우리는 세 자리 세 자리 내부에서 외부 감. 확인 하려면이 방법을 재현 하 고 객관적인, OD 측정의 랜드마크로 서 날개 정 맥을 사용 하 여 결정 한다. 이 문서에서는, 우리가 자세히 설명 초파리 guttifera착 색 날개의 정량화의이 방법.
Protocol
Representative Results
Discussion
설명 여기 번데기 단계의 정의 대 한 프로토콜 번데기 단계의 기간 및 디 guttifera에서 날개에 검은 반점의 강렬의 측정 측정 자세한 관찰에 대 한 puparium를 제거 합니다. 이러한 프로토콜 많은 초파리 에 대 한 적용할 수 있으며 비행 종, 특히 종 날개 색소와 관련.
깊이 있는 관찰과 자세한 개발 이벤트의 설명 것 하위 단계의 추가 사용. 많은 경우에, 요구 해 부 나?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리 감사 Sean B. Carroll와 토마스 베르너 비행 주식, 장비에 대 한 나 오 유키 퓨즈, 촬영, 멘토링에 대 한 Kiyokazu 아가타와 엘리자베스 나카지마 영어 편집을 위한 그의 지원에 대 한 병 석 진 제공. 이 작품은 KAKENHI에 의해 지원 되었다 17 K 19427와 다케다 과학 재단.
Materials
| Drosophila guttifera | The Drosophila Species Stock Center at the U.C. San Diego | 15130-1971.10 | Drosophila guttifera, a fruit fly species used in this article |
| Plastic vial | Hightech | MKC-30 | Plastic vial, for fly stock maintenance |
| Buzz plugs vial and bottle closures for glass vials | Fisher Scientific | AS-271 | Cellulose plug, for fly stock maintenance |
| White soft sugar | Mitsui Sugar | J-500g | White soft sugar, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Corn flour | Nippon Flour Mills | F | Corn flour, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Corn grits – C | Nippon Flour Mills | GC | Corn grits – C, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Agar powder | Matsuki Kanten Sangyo | No.602 | Agar powder, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Dry beer yeast | Asahi Food & Healthcare | Y2A | Dry beer yeast, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Butyl p-hydroxybenzoate | Nacalai Tesque | 06327-02 | Butyl p-hydroxybenzoate, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Ethanol | Wako | 057-00456 | Ethanol, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Flat bottom microtube | Ina Optica | CF-0150 | 1.5 mL microtube, for collecting pupae |
| CAPSULEFUGE | Tomy | PMC-060 | Mini microcentrifuge, for collecting pupae |
| Sterilized Schale NB | Sansei Medical | 01-013 | Plastic Petri dish (diameter 90 mm x height 15 mm) |
| Serum tube rack | Iwaki | 9796-050 | Used as a moist chamber, for observation of pupa |
| Corning Falcon Easy-Grip tissue culture dish | Corning | 353001 | Plastic Petri dish (diameter 35 mm x height 10 mm) |
| Falcon standard tissue culture dish | Corning | 353002 | Plastic Petri dish (diameter 60 mm x height 15 mm) |
| Push-pin | Kokuyo | 51233709 | Push-pin, for making pinholes on the microtube lid |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | Stereomicroscope, for morphological observation |
| Digital camera | Olympus | DSE-330-A | Digital camera, for imaging |
| NICETACK double sided tape | Nichiban | NW-15SF | Double sided tape, for removing puparium |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | Forceps, for removing puparium |
| Van Gogh VISUAL Paint brush | Talens Japan | GWVR-#5/0 | Paint brush, for removing puparium |
| Greiner CELLSTAR 12 well cell culture plate | Merck | 665-180 | 12-well cell culture plate, for measuring durations of pupal periods |
| NaCl | Wako | 191-01665 | NaCl, for PBS |
| KCl | Nacalai Tesque | 285-14 | KCl, for PBS |
| Na2HPO4·12H2O | Wako | 196-02835 | Na2HPO4·12H2O, for PBS |
| KH2PO4 | Nacalai Tesque | 28721-55 | KH2PO4, for PBS |
| Stepped Neutral Density (ND) Filter 0.04 – 3.0 | Edmund Optics | 64-384 | Stepped density filter, for calibration of pigmentation measurement |
| ImageJ software | NIH | 1.8.0-101 | ImageJ software, for measurement of intensity of black spots on a wing (https://imagej.nih.gov) |
| FINE FROST glass slide | Matsunami Glass Ind | FF-001 | Glass slide, for measurement of intensity of black spots on a wing |
| Square microscope cover glass 18 x 18 | Matsunami Glass Ind | C018181 | Cover slip, for measurement of intensity of black spots on a wing |
References
- Carson, H. L., Hardy, D. E., Spieth, H. T., Stone, W. S., Hecht, M. K., Steere, W. C. The evolutionary biology of the Hawaiian Drosophilidae. Essays in evolution and genetics in honor of Theodosius Dobzhansky. , 437-543 (1970).
- Markow, T. A., O’Grady, P. M. . Drosophila: a guide to species identification and use. , (2006).
- Patterson, J. T. . The Drosophilidae of the southwest. 4313, 7-216 (1943).
- Setoguchi, S., Takamori, H., Aotsuka, T., Sese, J., Ishikawa, Y., Matsuo, T. Sexual dimorphism and courtship behavior in Drosophila prolongata. J Ethol. 32 (2), 91-102 (2014).
- Werner, T., Jaenike, J. . Drosophilids of the Midwest and Northeast. , (2017).
- Arnoult, L., et al. Emergence and diversification of fly pigmentation through evolution of a gene regulatory module. Science. 339 (6126), 1423-1426 (2013).
- Camino, E. M., Butts, J. C., Ordway, A., Vellky, J. E., Rebeiz, M., Williams, T. M. The evolutionary origination and diversification of a dimorphic gene regulatory network through parallel innovations in cis and trans. PLoS Genet. 11 (4), e1005136 (2015).
- Gompel, N., Prud’homme, B., Wittkopp, P. J., Kassner, V. A., Carroll, S. B. Chance caught on the wing: cis-regulatory evolution and the origin of pigment patterns in Drosophila. Nature. 433 (7025), 481-487 (2005).
- Glassford, W. J., et al. Co-option of an ancestral Hox-regulated network underlies a recently evolved morphological novelty. Dev. Cell. 34 (5), 520-531 (2015).
- Koshikawa, S. Enhancer modularity and the evolution of new traits. Fly. 9 (4), 155-159 (2015).
- Koshikawa, S., et al. Gain of cis-regulatory activities underlies novel domains of wingless gene expression in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (24), 7524-7529 (2015).
- McGregor, A. P., et al. Morphological evolution through multiple cis-regulatory mutations at a single gene. Nature. 448 (7153), 587-590 (2007).
- Tanaka, K., Barmina, O., Kopp, A. Distinct developmental mechanisms underlie the evolutionary diversification of Drosophila sex combs. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (12), 4764-4769 (2009).
- Werner, T., Koshikawa, S., Williams, T. M., Carroll, S. B. Generation of a novel wing colour pattern by the Wingless morphogen. Nature. 464 (7292), 1143-1148 (2010).
- Wittkopp, P. J., et al. Intraspecific polymorphism to interspecific divergence: genetics of pigmentation in Drosophila. Science. 326 (5952), 540-544 (2009).
- Lawrence, P. A., Morata, G. Compartments in the wing of Drosophila: a study of the engrailed gene. Dev Biol. 50 (2), 321-337 (1976).
- Bainbridge, S. P., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. J. Embryol. Exp. Morphol. 66, 57-80 (1981).
- Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, R. S. . Drosophila: A Laboratory Handbook. , (2005).
- Fukutomi, Y., Matsumoto, K., Agata, K., Funayama, N., Koshikawa, S. Pupal development and pigmentation process of a polka-dotted fruit fly, Drosophila guttifera (Insecta, Diptera). Dev Genes Evol. 227 (3), 171-180 (2017).
- Koshikawa, S., Fukutomi, Y., Matsumoto, K., Sekimura, T., Nijhout, H. F. Drosophila guttifera as a model system for unraveling color pattern formation. Diversity and evolution of butterfly wing patterns: an integrative approach. , (2017).
- True, J. R., Edwards, K. A., Yamamoto, D., Carroll, S. B. Drosophila wing melanin patterns form by vein-dependent elaboration of enzymatic prepatterns. Curr Biol. 9 (23), 1382-1391 (1999).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Izumitani, H. F., Kusaka, Y., Koshikawa, S., Toda, M. J., Katoh, T. Phylogeography of the Subgenus Drosophila (Diptera: Drosophilidae): evolutionary history of faunal divergence between the Old and the New Worlds. PLoS ONE. 11 (7), e0160051 (2016).
- Resh, V. H., Cardé, R. T. . Encyclopedia of Insects. , (2009).
- DeLean, A., Munson, P. J., Rodbard, D. Simultaneous analysis of families of sigmoidal curves: application to bioassay, radioligand assay, and physiological dose-response curves. Am J Physiol. 235 (2), E97-E102 (1978).
- Robertson, C. W. The metamorphosis of Drosophila melanogaster, including an accurately timed account of the principal morphological changes. J Morphol. 59 (2), 351-399 (1936).
- McKinney, M. L., McNamara, K. . Heterochrony: the evolution of ontogeny. , (1991).
- Hardie, D. C., Gregory, T. R., Hebert, P. D. From pixels to picograms: a beginners’ guide to genome quantification by Feulgen image analysis densitometry. J Histochem Cytochem. 50 (6), 735-749 (2002).
- Koshikawa, S., Miyazaki, S., Cornette, R., Matsumoto, T., Miura, T. Genome size of termites (Insecta, Dictyoptera, Isoptera) and wood roaches (Insecta, Dictyoptera, Cryptocercidae). Naturwissenschaften. 95 (9), 859-867 (2008).
