Métodos de estadiamento Pupal períodos e medição de asa pigmentação da Drosophila guttifera
Summary
Protocolos para encenar o período pupal e medição de pigmentação de asa de Drosophila guttifera são descritos. Preparação e quantificação de pigmentação fornecem uma base sólida para estudar os mecanismos do desenvolvimento dos traços adultos e habilitar interespecífica comparação do desenvolvimento de traço.
Abstract
Diversificadas espécies de Drosophila (mosca de fruta) fornecem oportunidades para estudar os mecanismos de desenvolvimento e alterações genéticas responsáveis por mudanças evolutivas. Em particular, a fase adulta é uma fonte rica de traços morfológicos para comparação interespecífica, incluindo comparação de pigmentação de asa. Para estudar as diferenças de desenvolvimento entre as espécies, a observação detalhada e preparo adequado são necessários para comparação precisa. Aqui descrevemos os protocolos para preparo dos períodos pupal e quantificação de pigmentação da asa de uma mosca de fruta bolinhas, Drosophila guttifera. Primeiro, descrevemos o método por observação morfológica detalhada e definição dos estágios pupal baseado em morfologias. Este método inclui uma técnica para remover o casulo, que é o caso de quitinoso exterior da pupa, para permitir a observação detalhada de morfologias pupal. Em segundo lugar, descrevemos o método para medir a duração da fase pupal definido. Finalmente, descrevemos o método para a quantificação de pigmentação de asa com base na análise de imagem usando imagens digitais e o software ImageJ. Com esses métodos, podemos estabelecer uma base sólida para a comparação de processos de desenvolvimento de traços adultos durante estágios pupal.
Introduction
Alguns dos traços morfológicos da drosófila são diversificados entre espécies1,2,3,4,5. Vamos aproximar-na questão da diversidade morfológica como surge, comparando os mecanismos de geração destas morfologias. Exemplos de tais morfologias são tricomas larvas, pentes de sexo adulto, aparelho genital externo, pigmentação abdominal e asa pigmentação6,7,8,9, 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15. para estudar diferenças morfológicas entre os adultos, observação e análise da fase de pupa são importantes, porque o destino dos traços adultos é determinado na fase larval atrasado e subsequente morfogênese continua durante o período pupal.
Em estudos de biologia do desenvolvimento da Drosophila melanogaster, “horas APF” (horas depois da formação de pupa) é o método comum para indicar uma fase de pupa,16. Este sistema emprega o tempo absoluto após formação de pupa e é muito conveniente para experimentos de rotina. No entanto, velocidade do desenvolvimento pode diferir entre pupas e pode ser afectada por pequenas diferenças genéticas, epigenéticas ou microenvironmental, e, portanto, tendo o mesmo tempo absoluto após formação pupal não garante que as pupas são ao mesmo estágio do desenvolvimento. Em muitos casos, estágios definidos por características morfológicas são preferíveis para comparar vários indivíduos. Especialmente, uma comparação entre espécies requer preparo preciso e a comparação entre os estágios (homólogos) correspondentes.
Reconhecido de Bainbridge e Bownes17 20 estágios pupal (P1 a P15(ii)) baseada em características morfológicas das pupas de Drosophila melanogaster . Esta plataforma é o mais utilizado sistema de preparo do desenvolvimento morfológico18. Em um estudo anterior, realizamos encenando pupal de Drosophila guttifera para estabelecer uma base para asa pigmentação estudos19. D. guttifera tem um padrão de bolinhas pretas nas asas e é uma das espécies modelo para asa pigmentação formação20. Embora nós referidos os critérios morfológicos descritos na Bainbridge e ‘Bownes pesquisa17, medimos diretamente durações de palco por observações serial19, em vez de usando Bainbridge e ‘Bownes estimativa de durações de palco observava a frequência. Aqui descrevemos o método de preparo pupal e medição de durações dos estágios pupal de Drosophila usado em Fukutomi et al.19.
Para estudar o mecanismo do desenvolvimento de pigmentação de asa, precisamos saber quando nas fases de pupa ou adultos a pigmentação ocorre. Fukutomi et al. 19 quantificada densidades ópticas (ODs) de pigmentação durante estágios pupal e adultos por análise de imagem de imagens de asa. A pigmentação da drosófila asas é pensada para ser causado pelo acúmulo de melanina negra21. Para quantificação de ODs, foram utilizadas imagens de escala de cinza e ImageJ software (https://imagej.nih.gov/ij/)22 . Para reconhecer e quantificar a pigmentação local-específicos (ΔOD), subtraímos o OD fora de um local o OD dentro de um lugar. Para tornar este método reprodutível e objetiva, os locais de medição de OD devem ser determinados utilizando as veias da asa como Marcos. Neste artigo, descrevemos detalhadamente este método de quantificação de pigmentação de asa em Drosophila guttifera.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui descrevemos os protocolos para definição dos estágios pupal, removendo o casulo para observação detalhada, medindo durações dos estágios pupal e a medida da intensidade das manchas de preto em uma ala em d. guttifera. Esses protocolos podem ser aplicados para muitos Drosophila e relacionados a moscas espécies, especialmente com pigmentação de asa.
Observação em profundidade e descrição de eventos mais detalhados do desenvolvimento permitiria mais subdivis?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Sean B. Carroll e Thomas Werner para fornecer estoques voar, Naoyuki fusível para equipamentos, Byung Seok Jin por sua assistência na filmagem, Kiyokazu Agata para tutoria e Elizabeth Nakajima para edição inglesa. Este trabalho foi financiado pelo KAKENHI 17K 19427 e Takeda Science Foundation.
Materials
| Drosophila guttifera | The Drosophila Species Stock Center at the U.C. San Diego | 15130-1971.10 | Drosophila guttifera, a fruit fly species used in this article |
| Plastic vial | Hightech | MKC-30 | Plastic vial, for fly stock maintenance |
| Buzz plugs vial and bottle closures for glass vials | Fisher Scientific | AS-271 | Cellulose plug, for fly stock maintenance |
| White soft sugar | Mitsui Sugar | J-500g | White soft sugar, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Corn flour | Nippon Flour Mills | F | Corn flour, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Corn grits – C | Nippon Flour Mills | GC | Corn grits – C, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Agar powder | Matsuki Kanten Sangyo | No.602 | Agar powder, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Dry beer yeast | Asahi Food & Healthcare | Y2A | Dry beer yeast, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Butyl p-hydroxybenzoate | Nacalai Tesque | 06327-02 | Butyl p-hydroxybenzoate, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Ethanol | Wako | 057-00456 | Ethanol, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Flat bottom microtube | Ina Optica | CF-0150 | 1.5 mL microtube, for collecting pupae |
| CAPSULEFUGE | Tomy | PMC-060 | Mini microcentrifuge, for collecting pupae |
| Sterilized Schale NB | Sansei Medical | 01-013 | Plastic Petri dish (diameter 90 mm x height 15 mm) |
| Serum tube rack | Iwaki | 9796-050 | Used as a moist chamber, for observation of pupa |
| Corning Falcon Easy-Grip tissue culture dish | Corning | 353001 | Plastic Petri dish (diameter 35 mm x height 10 mm) |
| Falcon standard tissue culture dish | Corning | 353002 | Plastic Petri dish (diameter 60 mm x height 15 mm) |
| Push-pin | Kokuyo | 51233709 | Push-pin, for making pinholes on the microtube lid |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | Stereomicroscope, for morphological observation |
| Digital camera | Olympus | DSE-330-A | Digital camera, for imaging |
| NICETACK double sided tape | Nichiban | NW-15SF | Double sided tape, for removing puparium |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | Forceps, for removing puparium |
| Van Gogh VISUAL Paint brush | Talens Japan | GWVR-#5/0 | Paint brush, for removing puparium |
| Greiner CELLSTAR 12 well cell culture plate | Merck | 665-180 | 12-well cell culture plate, for measuring durations of pupal periods |
| NaCl | Wako | 191-01665 | NaCl, for PBS |
| KCl | Nacalai Tesque | 285-14 | KCl, for PBS |
| Na2HPO4·12H2O | Wako | 196-02835 | Na2HPO4·12H2O, for PBS |
| KH2PO4 | Nacalai Tesque | 28721-55 | KH2PO4, for PBS |
| Stepped Neutral Density (ND) Filter 0.04 – 3.0 | Edmund Optics | 64-384 | Stepped density filter, for calibration of pigmentation measurement |
| ImageJ software | NIH | 1.8.0-101 | ImageJ software, for measurement of intensity of black spots on a wing (https://imagej.nih.gov) |
| FINE FROST glass slide | Matsunami Glass Ind | FF-001 | Glass slide, for measurement of intensity of black spots on a wing |
| Square microscope cover glass 18 x 18 | Matsunami Glass Ind | C018181 | Cover slip, for measurement of intensity of black spots on a wing |
References
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