Métodos para pupa períodos de prueba y medición de pigmentación de ala de Drosophila guttifera
Summary
Se describen los protocolos de presentar períodos de pupas y medición de la pigmentación de ala de Drosophila guttifera . Puesta en escena y cuantificación de pigmentación proporcionan una base sólida para el estudio de los mecanismos del desarrollo de rasgos adultos y permiten la comparación interespecífica de desarrollo rasgo.
Abstract
Diversificada especies de Drosophila (mosca de la fruta) proporcionan oportunidades para el estudio de mecanismos de desarrollo y los cambios genéticos responsables de cambios evolutivos. En particular, la etapa adulta es una rica fuente de caracteres morfológicos para la comparación interespecífica, incluyendo ala pigmentación comparación. Para estudiar las diferencias del desarrollo entre especies, observación detallada y adecuada puesta en escena se requiere para la comparación exacta. Aquí describimos protocolos de puesta en escena de períodos pupas y cuantificación de la pigmentación de ala en una lunares mosca de la fruta Drosophila guttifera. En primer lugar, describimos el método de observación morfológica detallada y definición de etapas de pupal basadas en morfologías. Este método incluye una técnica para quitar del pupario, que es la carcaza externa quitinosa de la pupa, para permitir la observación detallada de la morfología pupal. En segundo lugar, describimos el método para medir la duración de etapas pupas definidas. Finalmente, describimos el método para la cuantificación de la pigmentación ala basada en análisis de imágenes mediante imágenes digitales y el software ImageJ. Con estos métodos, podemos establecer una base sólida para comparar procesos de desarrollo de rasgos adultos durante etapas de pupal.
Introduction
Algunos de los rasgos morfológicos de Drosophila se diversifican entre especies1,2,3,4,5. Podemos abordar la cuestión de la diversidad morfológica cómo surge mediante la comparación de los mecanismos de generación de estas morfologías. Ejemplos de tales morfologías son tricomas larvarias, peines sexuales para adultos, aparato genital externo, pigmentación abdominal y ala pigmentación6,7,8,9, 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15. para estudiar las diferencias morfológicas entre los adultos, observación y análisis de las etapas de pupas son importantes, porque el destino de rasgos adultos se determina en las últimas etapas larvales y morfogénesis posterior procede durante el período de pupa.
En estudios de Biología del desarrollo de Drosophila melanogaster, ‘horas APF’ (horas después de la formación pupal) es el método común para indicar una etapa pupal16. Este sistema emplea tiempo absoluto después de la formación pupal y es muy conveniente para los experimentos de la rutina. Sin embargo, velocidad de desarrollo puede diferir entre pupas, puede verse afectada por pequeñas diferencias genéticas, epigenéticas o microambiental, y por lo tanto, con el mismo tiempo absoluto después de la formación pupal no garantiza que las pupas son al mismo etapa de desarrollo. En muchos casos, son preferibles para comparar a varios individuos etapas definidas por características morfológicas. Sobre todo, una comparación entre especies requiere precisa puesta en escena y la comparación entre correspondientes (homólogos).
Bainbridge y Bownes17 reconoce 20 etapas de pupal (P1 a P15(ii)) basado en las características morfológicas de pupas de Drosophila melanogaster . Esta puesta en escena es el sistema más ampliamente utilizado de la puesta en escena del desarrollo morfológico18. En un estudio anterior, se realizó estadificación pupal de Drosophila guttifera para establecer una base para ala pigmentación estudios19. D. guttifera tiene un patrón de lunares negros en sus alas y es una de las especies modelo de ala pigmentación formación20. Aunque nos referimos a los criterios morfológicos descritos en el Bainbridge y ‘Bownes investigación17, directamente midiendo duraciones de etapa observaciones serie19, en lugar de utilizar Bainbridge y ‘Bownes estimación de las duraciones de la fase de de frecuencia observada. Aquí describimos el método de puesta en escena pupal y medición de duración de etapas de pupal de Drosophila en Fukutomi et al19.
Para estudiar el mecanismo del desarrollo de la pigmentación de ala, que necesitamos saber cuando en estadios de pupas o adulto se produce la pigmentación. Fukutomi et al. 19 había cuantificado densidades ópticas (ODs) de la pigmentación durante etapas de pupas y adulto por análisis de imágenes de imágenes de ala. La pigmentación de las alas de Drosophila se piensa para ser causado por la acumulación de melanina negra21. Para la cuantificación de Sao, se utilizaron imágenes de escala de grises y ImageJ software (https://imagej.nih.gov/ij/)22 . Para reconocer y cuantificar la pigmentación específica de lugar (ΔOD), restamos el OD fuera de un lugar de la do dentro de un lugar. Para hacer este método reproducible y objetiva, se deben determinar los lugares de medición de OD con venas de las alas como puntos de referencia. En este artículo, describimos en detalle este método de cuantificación de la pigmentación de ala de Drosophila guttifera.
Protocol
Representative Results
Discussion
Describimos aquí los protocolos para la definición de etapas de pupal, eliminación del pupario de observación detallada, duración de etapas de pupal de medición medición de la intensidad de manchas negras sobre un ala en D. guttifera. Estos protocolos pueden ser aplicados para muchos Drosophila y relacionados con mosca de especies, especialmente con la pigmentación de la mariposa.
Profunda observación y descripción de los eventos del desarrollo más detallados permi…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Sean B. Carroll y Thomas Werner para proporcionar acciones mosca, Naoyuki fusible para el equipo, Byung Seok Jin para su asistencia en rodaje, Kiyokazu Agata para tutoría y Elizabeth Nakajima para la edición de inglés. Este trabajo fue apoyado por KAKENHI 17K 19427 y Takeda Science Foundation.
Materials
| Drosophila guttifera | The Drosophila Species Stock Center at the U.C. San Diego | 15130-1971.10 | Drosophila guttifera, a fruit fly species used in this article |
| Plastic vial | Hightech | MKC-30 | Plastic vial, for fly stock maintenance |
| Buzz plugs vial and bottle closures for glass vials | Fisher Scientific | AS-271 | Cellulose plug, for fly stock maintenance |
| White soft sugar | Mitsui Sugar | J-500g | White soft sugar, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Corn flour | Nippon Flour Mills | F | Corn flour, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Corn grits – C | Nippon Flour Mills | GC | Corn grits – C, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Agar powder | Matsuki Kanten Sangyo | No.602 | Agar powder, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Dry beer yeast | Asahi Food & Healthcare | Y2A | Dry beer yeast, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Butyl p-hydroxybenzoate | Nacalai Tesque | 06327-02 | Butyl p-hydroxybenzoate, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Ethanol | Wako | 057-00456 | Ethanol, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Flat bottom microtube | Ina Optica | CF-0150 | 1.5 mL microtube, for collecting pupae |
| CAPSULEFUGE | Tomy | PMC-060 | Mini microcentrifuge, for collecting pupae |
| Sterilized Schale NB | Sansei Medical | 01-013 | Plastic Petri dish (diameter 90 mm x height 15 mm) |
| Serum tube rack | Iwaki | 9796-050 | Used as a moist chamber, for observation of pupa |
| Corning Falcon Easy-Grip tissue culture dish | Corning | 353001 | Plastic Petri dish (diameter 35 mm x height 10 mm) |
| Falcon standard tissue culture dish | Corning | 353002 | Plastic Petri dish (diameter 60 mm x height 15 mm) |
| Push-pin | Kokuyo | 51233709 | Push-pin, for making pinholes on the microtube lid |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | Stereomicroscope, for morphological observation |
| Digital camera | Olympus | DSE-330-A | Digital camera, for imaging |
| NICETACK double sided tape | Nichiban | NW-15SF | Double sided tape, for removing puparium |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | Forceps, for removing puparium |
| Van Gogh VISUAL Paint brush | Talens Japan | GWVR-#5/0 | Paint brush, for removing puparium |
| Greiner CELLSTAR 12 well cell culture plate | Merck | 665-180 | 12-well cell culture plate, for measuring durations of pupal periods |
| NaCl | Wako | 191-01665 | NaCl, for PBS |
| KCl | Nacalai Tesque | 285-14 | KCl, for PBS |
| Na2HPO4·12H2O | Wako | 196-02835 | Na2HPO4·12H2O, for PBS |
| KH2PO4 | Nacalai Tesque | 28721-55 | KH2PO4, for PBS |
| Stepped Neutral Density (ND) Filter 0.04 – 3.0 | Edmund Optics | 64-384 | Stepped density filter, for calibration of pigmentation measurement |
| ImageJ software | NIH | 1.8.0-101 | ImageJ software, for measurement of intensity of black spots on a wing (https://imagej.nih.gov) |
| FINE FROST glass slide | Matsunami Glass Ind | FF-001 | Glass slide, for measurement of intensity of black spots on a wing |
| Square microscope cover glass 18 x 18 | Matsunami Glass Ind | C018181 | Cover slip, for measurement of intensity of black spots on a wing |
References
- Carson, H. L., Hardy, D. E., Spieth, H. T., Stone, W. S., Hecht, M. K., Steere, W. C. The evolutionary biology of the Hawaiian Drosophilidae. Essays in evolution and genetics in honor of Theodosius Dobzhansky. , 437-543 (1970).
- Markow, T. A., O’Grady, P. M. . Drosophila: a guide to species identification and use. , (2006).
- Patterson, J. T. . The Drosophilidae of the southwest. 4313, 7-216 (1943).
- Setoguchi, S., Takamori, H., Aotsuka, T., Sese, J., Ishikawa, Y., Matsuo, T. Sexual dimorphism and courtship behavior in Drosophila prolongata. J Ethol. 32 (2), 91-102 (2014).
- Werner, T., Jaenike, J. . Drosophilids of the Midwest and Northeast. , (2017).
- Arnoult, L., et al. Emergence and diversification of fly pigmentation through evolution of a gene regulatory module. Science. 339 (6126), 1423-1426 (2013).
- Camino, E. M., Butts, J. C., Ordway, A., Vellky, J. E., Rebeiz, M., Williams, T. M. The evolutionary origination and diversification of a dimorphic gene regulatory network through parallel innovations in cis and trans. PLoS Genet. 11 (4), e1005136 (2015).
- Gompel, N., Prud’homme, B., Wittkopp, P. J., Kassner, V. A., Carroll, S. B. Chance caught on the wing: cis-regulatory evolution and the origin of pigment patterns in Drosophila. Nature. 433 (7025), 481-487 (2005).
- Glassford, W. J., et al. Co-option of an ancestral Hox-regulated network underlies a recently evolved morphological novelty. Dev. Cell. 34 (5), 520-531 (2015).
- Koshikawa, S. Enhancer modularity and the evolution of new traits. Fly. 9 (4), 155-159 (2015).
- Koshikawa, S., et al. Gain of cis-regulatory activities underlies novel domains of wingless gene expression in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (24), 7524-7529 (2015).
- McGregor, A. P., et al. Morphological evolution through multiple cis-regulatory mutations at a single gene. Nature. 448 (7153), 587-590 (2007).
- Tanaka, K., Barmina, O., Kopp, A. Distinct developmental mechanisms underlie the evolutionary diversification of Drosophila sex combs. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (12), 4764-4769 (2009).
- Werner, T., Koshikawa, S., Williams, T. M., Carroll, S. B. Generation of a novel wing colour pattern by the Wingless morphogen. Nature. 464 (7292), 1143-1148 (2010).
- Wittkopp, P. J., et al. Intraspecific polymorphism to interspecific divergence: genetics of pigmentation in Drosophila. Science. 326 (5952), 540-544 (2009).
- Lawrence, P. A., Morata, G. Compartments in the wing of Drosophila: a study of the engrailed gene. Dev Biol. 50 (2), 321-337 (1976).
- Bainbridge, S. P., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. J. Embryol. Exp. Morphol. 66, 57-80 (1981).
- Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, R. S. . Drosophila: A Laboratory Handbook. , (2005).
- Fukutomi, Y., Matsumoto, K., Agata, K., Funayama, N., Koshikawa, S. Pupal development and pigmentation process of a polka-dotted fruit fly, Drosophila guttifera (Insecta, Diptera). Dev Genes Evol. 227 (3), 171-180 (2017).
- Koshikawa, S., Fukutomi, Y., Matsumoto, K., Sekimura, T., Nijhout, H. F. Drosophila guttifera as a model system for unraveling color pattern formation. Diversity and evolution of butterfly wing patterns: an integrative approach. , (2017).
- True, J. R., Edwards, K. A., Yamamoto, D., Carroll, S. B. Drosophila wing melanin patterns form by vein-dependent elaboration of enzymatic prepatterns. Curr Biol. 9 (23), 1382-1391 (1999).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Izumitani, H. F., Kusaka, Y., Koshikawa, S., Toda, M. J., Katoh, T. Phylogeography of the Subgenus Drosophila (Diptera: Drosophilidae): evolutionary history of faunal divergence between the Old and the New Worlds. PLoS ONE. 11 (7), e0160051 (2016).
- Resh, V. H., Cardé, R. T. . Encyclopedia of Insects. , (2009).
- DeLean, A., Munson, P. J., Rodbard, D. Simultaneous analysis of families of sigmoidal curves: application to bioassay, radioligand assay, and physiological dose-response curves. Am J Physiol. 235 (2), E97-E102 (1978).
- Robertson, C. W. The metamorphosis of Drosophila melanogaster, including an accurately timed account of the principal morphological changes. J Morphol. 59 (2), 351-399 (1936).
- McKinney, M. L., McNamara, K. . Heterochrony: the evolution of ontogeny. , (1991).
- Hardie, D. C., Gregory, T. R., Hebert, P. D. From pixels to picograms: a beginners’ guide to genome quantification by Feulgen image analysis densitometry. J Histochem Cytochem. 50 (6), 735-749 (2002).
- Koshikawa, S., Miyazaki, S., Cornette, R., Matsumoto, T., Miura, T. Genome size of termites (Insecta, Dictyoptera, Isoptera) and wood roaches (Insecta, Dictyoptera, Cryptocercidae). Naturwissenschaften. 95 (9), 859-867 (2008).
