Методы для промежуточной куколки периодов и измерение крыла пигментации Drosophila guttifera
Summary
Описываются протоколы постановка куколки периодов и измерение крыла пигментации Drosophila guttifera . Постановка и количественной оценки пигментации обеспечивают прочную основу для изучения развития механизмов взрослых черты и включить межвидовые сравнения черта развития.
Abstract
Разнообразные виды дрозофилы (плодовая муха) предоставляют возможности для изучения механизмов развития и генетические изменения, ответственных за эволюционных изменений. В частности взрослой стадии является богатым источником морфологических признаков для межвидовые сравнения, включая крыло пигментации сравнения. Для изучения развития различия среди видов, для точного сравнения необходимы подробные наблюдения и соответствующие промежуточные. Здесь мы описываем протоколы для промежуточной куколки периодов и количественной оценки крыла пигментации в полька пунктирной плодовой мушки, дрозофила guttifera. Во-первых мы описываем метод для подробного морфологических наблюдения и определения стадий куколки, основанный на морфологии. Этот метод включает метод для удаления puparium, который внешние хитиновый случае куколки, чтобы включить подробные наблюдения куколки морфологии. Во-вторых мы описываем метод для измерения длительности определенных этапов куколки. Наконец мы описываем метод количественной оценки крыла пигментации на основе анализа изображения с помощью цифровых изображений и ImageJ программного обеспечения. С помощью этих методов мы можем создать прочную основу для сравнения процессов развития взрослых черты куколки этапах.
Introduction
Некоторые из морфологических признаков дрозофилы диверсифицированы среди видов1,2,3,4,5. Мы можем подойти к вопросу как морфологического разнообразия возникает, сравнивая механизмы генерации этих морфологии. Примерами таких морфологии являются личиночной трихом, секс Расчески, внешних половых аппарат, брюшной пигментации и крыло пигментации6,,78,9, 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15. изучить морфологические различия среди взрослых, наблюдение и анализ стадии куколки важны, потому что в конце личиночной стадии определяется судьба взрослых черты и последующие морфогенеза продолжается период куколки.
В биологии развития исследований Drosophila melanogaster«часов НФА» (часов после куколки формирования) является распространенным методом для обозначения стадия куколки16. Эта система использует абсолютное время после формирования куколки и очень удобно для обычных экспериментов. Однако развития скорость может отличаться среди куколок и могут быть затронуты незначительные различия генетических, эпигенетических или microenvironmental, и поэтому имеющие то же абсолютное время после куколки образования не гарантирует что куколки в то же стадии развития. Во многих случаях этапов определяется морфологические особенности являются предпочтительными для сравнения нескольких лиц. Особенно Сравнение видов требует точной постановки и сравнение среди соответствующих этапов (гомологичных).
Байнбридж и Bownes17 признал 20 куколки этапов (P1 для P15(ii)) на основе морфологических особенностей Drosophila melanogaster куколок. Эта постановка является наиболее широко используемой системой морфологического развития промежуточной18. В предыдущем исследовании мы провели, куколки постановка Drosophila guttifera создать основу для крыла пигментации исследования19. D. guttifera имеет черный горошек узор на свои крылья и является одним из видов модели для формирования пигментации крыла20. Хотя мы ссылались на морфологические критерии, описанные в17исследования Байнбридж и Bownes’, мы непосредственно измеряется стадии длительностей последовательных наблюдений19, вместо Байнбридж и Bownes оценки длительности этапа от наблюдаемой частоты. Здесь мы описываем метод куколки промежуточной и измерение длительности куколки этапов дрозофилы , используемых в Фукутоми et al19.
Для изучения развития механизма пигментации крыла, нам необходимо знать, когда в стадии куколки или взрослых происходит пигментация. Фукутоми и др. 19 количественно оптических плотностей (СОД) пигментации стадии куколки и взрослых путем анализа изображений крыла изображений. Считается, что пигментации дрозофилы крыльев быть вызваны накоплением меланина черный21. Для количественной оценки ОРВ были использованы серого изображения и ImageJ программного обеспечения (https://imagej.nih.gov/ij/)22 . Признать и определить место конкретных пигментации (ΔOD), мы вычитаем ОД вне пятно от ОД внутри пятно. Чтобы сделать этот метод воспроизводимость и объективной, должна определяться места измерения ОД, с использованием крыло вен как ориентиры. В этой статье мы подробно описать этот метод количественной оценки крыла пигментации в Drosophila guttifera.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы описываем протоколы для определения стадии куколки, удаление puparium подробные наблюдения, измерения длительности куколки этапов и измерение интенсивности черные пятна на крыло в д guttifera. Эти протоколы могут быть применены для многих дрозофилы и связанных летать видов,…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Шон Кэрролл B. и Томас Вернер за предоставление покупать акции, Наоюки предохранитель для оборудования, Джин Сеок Byung за его помощь в съемках, Агата Киоказу для наставничества и Элизабет Накадзима для английского редактирования. Эта работа была поддержана KAKENHI 17K 19427 и Такэда научный фонд.
Materials
| Drosophila guttifera | The Drosophila Species Stock Center at the U.C. San Diego | 15130-1971.10 | Drosophila guttifera, a fruit fly species used in this article |
| Plastic vial | Hightech | MKC-30 | Plastic vial, for fly stock maintenance |
| Buzz plugs vial and bottle closures for glass vials | Fisher Scientific | AS-271 | Cellulose plug, for fly stock maintenance |
| White soft sugar | Mitsui Sugar | J-500g | White soft sugar, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Corn flour | Nippon Flour Mills | F | Corn flour, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Corn grits – C | Nippon Flour Mills | GC | Corn grits – C, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Agar powder | Matsuki Kanten Sangyo | No.602 | Agar powder, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Dry beer yeast | Asahi Food & Healthcare | Y2A | Dry beer yeast, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Butyl p-hydroxybenzoate | Nacalai Tesque | 06327-02 | Butyl p-hydroxybenzoate, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Ethanol | Wako | 057-00456 | Ethanol, for standard cornmeal/sugar/yeast/agar food |
| Flat bottom microtube | Ina Optica | CF-0150 | 1.5 mL microtube, for collecting pupae |
| CAPSULEFUGE | Tomy | PMC-060 | Mini microcentrifuge, for collecting pupae |
| Sterilized Schale NB | Sansei Medical | 01-013 | Plastic Petri dish (diameter 90 mm x height 15 mm) |
| Serum tube rack | Iwaki | 9796-050 | Used as a moist chamber, for observation of pupa |
| Corning Falcon Easy-Grip tissue culture dish | Corning | 353001 | Plastic Petri dish (diameter 35 mm x height 10 mm) |
| Falcon standard tissue culture dish | Corning | 353002 | Plastic Petri dish (diameter 60 mm x height 15 mm) |
| Push-pin | Kokuyo | 51233709 | Push-pin, for making pinholes on the microtube lid |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | Stereomicroscope, for morphological observation |
| Digital camera | Olympus | DSE-330-A | Digital camera, for imaging |
| NICETACK double sided tape | Nichiban | NW-15SF | Double sided tape, for removing puparium |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | Forceps, for removing puparium |
| Van Gogh VISUAL Paint brush | Talens Japan | GWVR-#5/0 | Paint brush, for removing puparium |
| Greiner CELLSTAR 12 well cell culture plate | Merck | 665-180 | 12-well cell culture plate, for measuring durations of pupal periods |
| NaCl | Wako | 191-01665 | NaCl, for PBS |
| KCl | Nacalai Tesque | 285-14 | KCl, for PBS |
| Na2HPO4·12H2O | Wako | 196-02835 | Na2HPO4·12H2O, for PBS |
| KH2PO4 | Nacalai Tesque | 28721-55 | KH2PO4, for PBS |
| Stepped Neutral Density (ND) Filter 0.04 – 3.0 | Edmund Optics | 64-384 | Stepped density filter, for calibration of pigmentation measurement |
| ImageJ software | NIH | 1.8.0-101 | ImageJ software, for measurement of intensity of black spots on a wing (https://imagej.nih.gov) |
| FINE FROST glass slide | Matsunami Glass Ind | FF-001 | Glass slide, for measurement of intensity of black spots on a wing |
| Square microscope cover glass 18 x 18 | Matsunami Glass Ind | C018181 | Cover slip, for measurement of intensity of black spots on a wing |
References
- Carson, H. L., Hardy, D. E., Spieth, H. T., Stone, W. S., Hecht, M. K., Steere, W. C. The evolutionary biology of the Hawaiian Drosophilidae. Essays in evolution and genetics in honor of Theodosius Dobzhansky. , 437-543 (1970).
- Markow, T. A., O’Grady, P. M. . Drosophila: a guide to species identification and use. , (2006).
- Patterson, J. T. . The Drosophilidae of the southwest. 4313, 7-216 (1943).
- Setoguchi, S., Takamori, H., Aotsuka, T., Sese, J., Ishikawa, Y., Matsuo, T. Sexual dimorphism and courtship behavior in Drosophila prolongata. J Ethol. 32 (2), 91-102 (2014).
- Werner, T., Jaenike, J. . Drosophilids of the Midwest and Northeast. , (2017).
- Arnoult, L., et al. Emergence and diversification of fly pigmentation through evolution of a gene regulatory module. Science. 339 (6126), 1423-1426 (2013).
- Camino, E. M., Butts, J. C., Ordway, A., Vellky, J. E., Rebeiz, M., Williams, T. M. The evolutionary origination and diversification of a dimorphic gene regulatory network through parallel innovations in cis and trans. PLoS Genet. 11 (4), e1005136 (2015).
- Gompel, N., Prud’homme, B., Wittkopp, P. J., Kassner, V. A., Carroll, S. B. Chance caught on the wing: cis-regulatory evolution and the origin of pigment patterns in Drosophila. Nature. 433 (7025), 481-487 (2005).
- Glassford, W. J., et al. Co-option of an ancestral Hox-regulated network underlies a recently evolved morphological novelty. Dev. Cell. 34 (5), 520-531 (2015).
- Koshikawa, S. Enhancer modularity and the evolution of new traits. Fly. 9 (4), 155-159 (2015).
- Koshikawa, S., et al. Gain of cis-regulatory activities underlies novel domains of wingless gene expression in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (24), 7524-7529 (2015).
- McGregor, A. P., et al. Morphological evolution through multiple cis-regulatory mutations at a single gene. Nature. 448 (7153), 587-590 (2007).
- Tanaka, K., Barmina, O., Kopp, A. Distinct developmental mechanisms underlie the evolutionary diversification of Drosophila sex combs. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (12), 4764-4769 (2009).
- Werner, T., Koshikawa, S., Williams, T. M., Carroll, S. B. Generation of a novel wing colour pattern by the Wingless morphogen. Nature. 464 (7292), 1143-1148 (2010).
- Wittkopp, P. J., et al. Intraspecific polymorphism to interspecific divergence: genetics of pigmentation in Drosophila. Science. 326 (5952), 540-544 (2009).
- Lawrence, P. A., Morata, G. Compartments in the wing of Drosophila: a study of the engrailed gene. Dev Biol. 50 (2), 321-337 (1976).
- Bainbridge, S. P., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. J. Embryol. Exp. Morphol. 66, 57-80 (1981).
- Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, R. S. . Drosophila: A Laboratory Handbook. , (2005).
- Fukutomi, Y., Matsumoto, K., Agata, K., Funayama, N., Koshikawa, S. Pupal development and pigmentation process of a polka-dotted fruit fly, Drosophila guttifera (Insecta, Diptera). Dev Genes Evol. 227 (3), 171-180 (2017).
- Koshikawa, S., Fukutomi, Y., Matsumoto, K., Sekimura, T., Nijhout, H. F. Drosophila guttifera as a model system for unraveling color pattern formation. Diversity and evolution of butterfly wing patterns: an integrative approach. , (2017).
- True, J. R., Edwards, K. A., Yamamoto, D., Carroll, S. B. Drosophila wing melanin patterns form by vein-dependent elaboration of enzymatic prepatterns. Curr Biol. 9 (23), 1382-1391 (1999).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Izumitani, H. F., Kusaka, Y., Koshikawa, S., Toda, M. J., Katoh, T. Phylogeography of the Subgenus Drosophila (Diptera: Drosophilidae): evolutionary history of faunal divergence between the Old and the New Worlds. PLoS ONE. 11 (7), e0160051 (2016).
- Resh, V. H., Cardé, R. T. . Encyclopedia of Insects. , (2009).
- DeLean, A., Munson, P. J., Rodbard, D. Simultaneous analysis of families of sigmoidal curves: application to bioassay, radioligand assay, and physiological dose-response curves. Am J Physiol. 235 (2), E97-E102 (1978).
- Robertson, C. W. The metamorphosis of Drosophila melanogaster, including an accurately timed account of the principal morphological changes. J Morphol. 59 (2), 351-399 (1936).
- McKinney, M. L., McNamara, K. . Heterochrony: the evolution of ontogeny. , (1991).
- Hardie, D. C., Gregory, T. R., Hebert, P. D. From pixels to picograms: a beginners’ guide to genome quantification by Feulgen image analysis densitometry. J Histochem Cytochem. 50 (6), 735-749 (2002).
- Koshikawa, S., Miyazaki, S., Cornette, R., Matsumoto, T., Miura, T. Genome size of termites (Insecta, Dictyoptera, Isoptera) and wood roaches (Insecta, Dictyoptera, Cryptocercidae). Naturwissenschaften. 95 (9), 859-867 (2008).
