Engenharia genética de organóides intestinais do camundongo primário usando vetores virais de transdução de nanopartículas magnéticas para seccionamento congelado
Summary
Nós descrevemos instruções passo a passo para: 1) eficientemente projetar organóides intestinais usando nanopartículas magnéticas para Lenti-ou transdução retroviral, e, 2) gerar seções congeladas a partir de organóides projetados. Esta abordagem fornece uma poderosa ferramenta para alterar eficientemente a expressão gênica em organóides para investigação de efeitos a jusante.
Abstract
As culturas organoides intestinais proporcionam uma oportunidade única para investigar a biologia intestinal da célula-tronco e da cripta in vitro, embora abordagens eficientes para manipular a expressão gênica em organóides tenham feito progressos limitados nesta arena. Enquanto a tecnologia CRISPR/Cas9 permite a edição precisa do genoma das células para a geração de organoides, essa estratégia requer extensa seleção e triagem por análise de sequência, que é demorada e dispendiosa. Aqui, nós fornecemos um protocolo detalhado para a transdução viral eficiente de organoids intestinais. Essa abordagem é rápida e altamente eficiente, diminuindo assim o tempo e a despesa inerentes à tecnologia CRISPR/Cas9. Nós igualmente apresentamos um protocolo para gerar seções congeladas das culturas organoid intactas para uma análise mais adicional com mancha immunohistochemical ou Immunofluorescent, que pode ser usada para confirmar a expressão ou o silenciamento do gene. Após a transdução bem-sucedida de vetores virais para expressão gênica ou silenciamento é alcançada, a função de célula-tronco intestinal e cripta pode ser rapidamente avaliada. Embora a maioria dos estudos organoides empreguem ensaios in vitro, os organóides também podem ser entregues em camundongos para análises funcionais in vivo. Além disso, nossas abordagens são vantajosas para prever respostas terapêuticas às drogas porque as terapias atualmente disponíveis geralmente funcionam modulando a expressão gênica ou a função protéica em vez de alterar o genoma.
Introduction
A capacidade de cultura de rato ou células de criptas humanas como tridimensional (3D) organóides do intestino delgado ou cólon durante períodos prolongados de tempo proporcionou um grande avanço, porque estas culturas exibem características definidoras do epitélio intestinal in vivo 1. º , 2. º , 3. organóides derivados de criptas primárias são capazes de autorenovação e autoorganização, exibindo funções celulares semelhantes aos seus tecidos de origem. Na verdade, os organóides recapitulam não só a organização estrutural das criptas in vivo, mas também muitas características moleculares, proporcionando assim ferramentas úteis para estudar a biologia normal e os Estados da doença. Para ilustrar, os estudos organoid revelaram as vias moleculars novas envolvidas na regeneração do tecido1,2,3,4,5 assim como as drogas que poderiam realçar a função em configurações patológicas6,7.
O estudo das células estaminais intestinais é de particular interesse porque o revestimento intestinal está entre os tecidos de mamíferos mais altamente regenerativos, renovando-se a cada 3-5 dias para proteger o organismo de bactérias, toxinas e outros patógenos dentro do lúmens intestinais. As pilhas de haste intestinais (ISCS) são responsáveis para esta capacidade regenerativa notável e fornecem assim um paradigma original para estudar a função adulta da pilha de haste1,2. Experimentos de linhagem-rastreamento em camundongos demonstraram que células-tronco isoladas Lgr5-positivas podem ser cultivadas para gerar organóides 3D ou ‘ mini-Guts ‘ in vitro, onde eles espelham de perto suas contrapartes in vivo. Culturas organoides também podem ser derivadas de isolados de células de cripta intestinal, constituídos por progenitores, ISCs e células Paneth, sendo que estes últimos constituem as células de nicho epitelial in vivo. Na verdade, a cultura organóide de células de cripta intestinal primária evoluiu para uma técnica relativamente rotineira que é fácil de implementar na maioria dos laboratórios usando reagentes amplamente disponíveis. Este modelo também é capaz de análise quantitativa da expressão gênica por sequenciamento de RNA (RNA-Seq) e proteínas por espectrometria de massas, imuno-histoquímica, ou coloração imunofluorescente2,4,8. Além, a genética funcional pode ser estudada usando o ganho–função (superexpressão do gene ou expressão de um gene de activação do mutante) ou perda–função (silenciamento do gene ou expressão de um mutante da perda–função) aproximações2.
Importante, a baixa eficiência e a toxicidade elevada do ADN padrão do plasmídeo ou dos protocolos virais da transdução com Polybrene permanecem um obstáculo principal no campo. Embora a tecnologia CRISPR/Cas9 permita a edição precisa do genoma, essa abordagem requer uma seleção demorada seguida pela validação da sequência9. Aqui, apresentamos um protocolo de transdução viral para organóides intestinais primários que otimiza a entrega de partículas virais por conjugação com nanopartículas magnéticas e aplicação de um campo magnético. Principais modificações aos protocolos anteriores4,5,10,11,12,13 e recomendações para aumentar a eficiência são fornecidos. Nós igualmente descrevemos uma aproximação para gerar as seções congeladas dos organóides intactos cultivados no matrigel 3D (doravante referido como a matriz ou a matriz da membrana do porão) para uma análise mais adicional com mancha immunohistochemistry ou Immunofluorescent.
Protocol
Representative Results
Discussion
A cultura preliminar do epitélio intestinal adulto como organóides fornece uma ferramenta poderosa para estudar os mecanismos moleculars envolvidos na função da pilha de haste, na homeostase epithelial intestinal, e na patologia1,2,3, a 4. Embora a tecnologia CRISPR/Cas9 possa ser usada para projetar geneticamente organóides9, ela é limitada pela necessidade de tri…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por doações do Instituto Nacional de saúde (R01DK102943, R03CA182679, R03CA191621), o fundo de pesquisa de células-tronco de Maryland (2015-MSCRFE-1759, 2017-MSCRFD-3934), a associação americana de pulmão, a rede de saúde Allegheny-Johns Fundo de pesquisa Hopkins e as doenças digestivas Hopkins Centro núcleo de pesquisa básica.
Materials
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | Base medium for 293T cells |
| DMEM/F12+ | Thermo Fisher Scientific | 12634010 | Base medium for organoid culture medium and organoid digestion buffer |
| OPTI-MEM | Thermo Fisher Scientific | 11058021 | Virus plasmids transfection medium |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-011-CV | Component of virus collection medium and 293T medium |
| Pen/Strep | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Component of organoid culture medium and crypt dissociation buffer |
| PBS (without Ca2+, Mg2+) | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | A wash buffer and component of crypt dissociation buffer |
| Mem-NEAA | Thermo Fisher Scientific | 11140050 | Component of organoid culture medium |
| GlutamaxII | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Component of organoid culture medium |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | Component of organoid culture medium |
| EGF | Millipore Sigma | E9644 | Component of organoid culture medium |
| Noggin | Peprotech | 250-38 B | Component of organoid culture medium |
| R-spondin | R&D | 7150-RS-025/CF | Component of organoid culture medium |
| Human recombinant insulin | Millipore Sigma | I9278-5ml | Component of organoid culture medium |
| Nicotinamide | Millipore Sigma | N3376-100G | Component of Transduction medium |
| Wnt3A | R&D | 5036-WN-010 | Component of Transduction medium |
| Y27632 | Millipore Sigma | Y0503-1MG | Component of Transduction medium |
| 0.5M EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | Component of Crypts dissociation buffer |
| DTT (dithiothreitol) | Thermo Fisher Scientific | R0861 | Component of Crypts dissociation buffer |
| Dispase I | Millipore Sigma | D4818-2MG | Component of organoid digestion buffer |
| DNase I | Millipore Sigma | 11284932001 | Component of organoid digestion buffer |
| matrigel(Growth factor reduced) | Corning | 356231 | Used as a matrix to embed organoids |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | Medium for transfection in viral production |
| ViralMag R/L | Oz Biosiences | RL40200 | Magnetic particles of viral transduction |
| Magnetic plate | Oz Biosiences | MF10000 | Magnetic plate to facilitate viral transduction |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | Transfection agent in viral production |
| Poly-D-Lysine | Millipore Sigma | A-003-E | Coating for plates before seeding 293T cells |
| 4% Formaldehyde Solution | Boster | AR1068 | Solution to fix organoids |
| O.C.T embedding compound | Thermo Fisher Scientific | 4583S | For embedding of the the organoids |
| 5 mL Falcon polystyrene tubes | Corning | 352054 | |
| 50 mL Falcon Tubes | Sarstedt | 62.547.100 | |
| Orbitron rotator II Rocker Shaker | Boekel Scientific | 260250 | |
| Olympus Inverted microscop CK30 | Olympus | CK30 | for scanning and counting crypts |
| Zeiss Axiovert 200 inverted fluorescence | Nikon | Axiovert 200 | for viewing fluorescence in the crypts |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter unit with Ultracel-100 membrane | Milipore Sigma | UFC910024 | For concentrating viruses |
| pluriStrainer 20 µm (Cell Strainer) | pluriSelect | SKU 43-50020 | For preparing organoid fragments |
| Falcon Cell Strainer | Fisher Scientific | 352340 | For preparing cyrpts of similar size after crypt isolation |
| Greiner CELLSTAR multiwell culture plates 48 wells (TC treated with lid) | Millipore Sigma | M8937-100EA | ForD2:D37+D16:D37g organoid fragments |
| Animal strain: C57BL/6J | Jackson Lab | #000664 | For organoid culture |
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