Ingeniería Genética de Organoides Intestinales de Ratón Primario utilizando Vectores Virales de Transducción de Nanopartículas Magnéticas para Seccionamiento Congelado
Summary
Describimos instrucciones paso a paso para: 1) diseñar de manera eficiente organoides intestinales utilizando nanopartículas magnéticas para la transducción lenti- o retroviral, y, 2) generar secciones congeladas a partir de organoides diseñados. Este enfoque proporciona una poderosa herramienta para alterar eficientemente la expresión génica en organoides para la investigación de los efectos posteriores.
Abstract
Los cultivos organoides intestinales proporcionan una oportunidad única para investigar la biología intestinal de células madre y criptas in vitro, aunque los enfoques eficientes para manipular la expresión génica en organoides han hecho progresos limitados en esta arena. Si bien la tecnología CRISPR/Cas9 permite la edición precisa del genoma de las células para la generación de organoides, esta estrategia requiere una amplia selección y cribado por análisis de secuencia, que requiere mucho tiempo y es costoso. Aquí, proporcionamos un protocolo detallado para la transducción viral eficiente de organoides intestinales. Este enfoque es rápido y altamente eficiente, disminuyendo así el tiempo y los gastos inherentes a la tecnología CRISPR/Cas9. También presentamos un protocolo para generar secciones congeladas de cultivos organoides intactos para su posterior análisis con tinción inmunohistoquímica o inmunofluorescente, que se puede utilizar para confirmar la expresión génica o el silenciamiento. Después de lograr una transducción exitosa de vectores virales para la expresión génica o silenciamiento, se puede evaluar rápidamente la función de células madre intestinales y criptas. Aunque la mayoría de los estudios organoides emplean ensayos in vitro, los organoides también pueden ser entregados a ratones para análisis funcionales in vivo. Además, nuestros enfoques son ventajosos para predecir las respuestas terapéuticas a los fármacos porque las terapias disponibles actualmente generalmente funcionan modulando la expresión génica o la función proteica en lugar de alterar el genoma.
Introduction
La capacidad de cultivar células de ratones o criptas humanas como organoides tridimensionales (3D) desde el intestino delgado o el colon durante períodos de tiempo prolongados proporcionó un gran avance porque estos cultivos muestran características definitorias del epitelio intestinal in vivo 1 , 2 , 3. Los organoides derivados de las criptas primarias son capaces de auto-renovación y auto-organización, exhibiendo funciones celulares similares a sus tejidos de origen. De hecho, los organoides recapitulan no sólo la organización estructural de las criptas in vivo, sino también muchas características moleculares, proporcionando así herramientas útiles para estudiar la biología normal y los estados de enfermedad. Para ilustrar, estudios organoides han revelado nuevas vías moleculares implicadas en la regeneración tisular1,2,3,4,5 así como fármacos que podrían mejorar la función en ajustes patológicos6,7.
El estudio de las células madre intestinales es de particular interés porque el revestimiento intestinal se encuentra entre los tejidos de mamíferos más altamente regenerativos, renovándose cada 3-5 días para proteger el organismo de bacterias, toxinas y otros patógenos dentro de la lúmenes intestinales. Las células madre intestinales (ISC) son responsables de esta notable capacidad regenerativa y por lo tanto proporcionan un paradigma único para el estudio de la función de células madre adultas1,2. Los experimentos de trazado de linaje en ratones demostraron que se pueden cultivar células madre aisladas lgr5 positivas para generar organoides 3D o “mini-guts” in vitro donde reflejan de cerca sus contrapartes in vivo. Los cultivos organoides también pueden derivarse de aislados celulares de cripta intestinal compuestos por progenitores, ISC y células Depanet, los cuales constituyen las células de nicho epitelial in vivo. De hecho, el cultivo organoide a partir de células de cripta intestinal primaria ha evolucionado hasta convertirse en una técnica relativamente rutinaria que es fácil de implementar en la mayoría de los laboratorios utilizando reactivos ampliamente disponibles. Este modelo también es susceptible al análisis cuantitativo de la expresión génica mediante la secuenciación de ARN (RNA-Seq) y proteínas por espectrometría de masas, inmunohistoquímica o tinción inmunofluorescente2,4,8. Además, la genética funcional se puede estudiar utilizando enfoques de ganancia de función (sobreexpresión genética o expresión de un gen mutante activador) o pérdida de función (silenciamiento del gen o expresión de un mutante de pérdida de función)2.
Es importante destacar que la baja eficiencia y la alta toxicidad del ADN plásmido estándar o los protocolos de transducción viral con polibrino siguen siendo un obstáculo importante en el campo. Aunque la tecnología CRISPR/Cas9 permite una edición precisa del genoma, este enfoque requiere una selección que requiere mucho tiempo seguida de la validación de secuencias9. Aquí, presentamos un protocolo de transducción viral para organoides intestinales primarios que optimiza la entrega de partículas virales por conjugación a nanopartículas magnéticas y aplicación de un campo magnético. Se proporcionan modificaciones clave a los protocolos anteriores4,5,10,11,12,13 y recomendaciones para mejorar la eficiencia. También describimos un enfoque para generar secciones congeladas a partir de organoides intactos cultivados en matrigael 3D (en adelante, matriz o matriz de membrana de sótano) para su posterior análisis con inmunohistoquímica o tinción inmunofluorescente.
Protocol
Representative Results
Discussion
El cultivo primario del epitelio intestinal adulto como organoides proporciona una poderosa herramienta para estudiar los mecanismos molecularesimplicados en la función de las células madre, la homeostasis epitelial intestinal y la patología 1,2,3, 4. Aunque la tecnología CRISPR/Cas9 se puede utilizarpara diseñar genéticamente organoides 9, está limitada por la n…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Instituto Nacional de Salud (R01DK102943, R03CA182679, R03CA191621), el Maryland Stem Cell Research Fund (2015-MSCRFE-1759, 2017-MSCRFD-3934), la Asociación Americana del Pulmón, la Red de Salud Allegheny – Johns Hopkins Research Fund y hopkins Digestive Diseases Basic Research Core Center.
Materials
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | Base medium for 293T cells |
| DMEM/F12+ | Thermo Fisher Scientific | 12634010 | Base medium for organoid culture medium and organoid digestion buffer |
| OPTI-MEM | Thermo Fisher Scientific | 11058021 | Virus plasmids transfection medium |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-011-CV | Component of virus collection medium and 293T medium |
| Pen/Strep | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Component of organoid culture medium and crypt dissociation buffer |
| PBS (without Ca2+, Mg2+) | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | A wash buffer and component of crypt dissociation buffer |
| Mem-NEAA | Thermo Fisher Scientific | 11140050 | Component of organoid culture medium |
| GlutamaxII | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Component of organoid culture medium |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | Component of organoid culture medium |
| EGF | Millipore Sigma | E9644 | Component of organoid culture medium |
| Noggin | Peprotech | 250-38 B | Component of organoid culture medium |
| R-spondin | R&D | 7150-RS-025/CF | Component of organoid culture medium |
| Human recombinant insulin | Millipore Sigma | I9278-5ml | Component of organoid culture medium |
| Nicotinamide | Millipore Sigma | N3376-100G | Component of Transduction medium |
| Wnt3A | R&D | 5036-WN-010 | Component of Transduction medium |
| Y27632 | Millipore Sigma | Y0503-1MG | Component of Transduction medium |
| 0.5M EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | Component of Crypts dissociation buffer |
| DTT (dithiothreitol) | Thermo Fisher Scientific | R0861 | Component of Crypts dissociation buffer |
| Dispase I | Millipore Sigma | D4818-2MG | Component of organoid digestion buffer |
| DNase I | Millipore Sigma | 11284932001 | Component of organoid digestion buffer |
| matrigel(Growth factor reduced) | Corning | 356231 | Used as a matrix to embed organoids |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | Medium for transfection in viral production |
| ViralMag R/L | Oz Biosiences | RL40200 | Magnetic particles of viral transduction |
| Magnetic plate | Oz Biosiences | MF10000 | Magnetic plate to facilitate viral transduction |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | Transfection agent in viral production |
| Poly-D-Lysine | Millipore Sigma | A-003-E | Coating for plates before seeding 293T cells |
| 4% Formaldehyde Solution | Boster | AR1068 | Solution to fix organoids |
| O.C.T embedding compound | Thermo Fisher Scientific | 4583S | For embedding of the the organoids |
| 5 mL Falcon polystyrene tubes | Corning | 352054 | |
| 50 mL Falcon Tubes | Sarstedt | 62.547.100 | |
| Orbitron rotator II Rocker Shaker | Boekel Scientific | 260250 | |
| Olympus Inverted microscop CK30 | Olympus | CK30 | for scanning and counting crypts |
| Zeiss Axiovert 200 inverted fluorescence | Nikon | Axiovert 200 | for viewing fluorescence in the crypts |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter unit with Ultracel-100 membrane | Milipore Sigma | UFC910024 | For concentrating viruses |
| pluriStrainer 20 µm (Cell Strainer) | pluriSelect | SKU 43-50020 | For preparing organoid fragments |
| Falcon Cell Strainer | Fisher Scientific | 352340 | For preparing cyrpts of similar size after crypt isolation |
| Greiner CELLSTAR multiwell culture plates 48 wells (TC treated with lid) | Millipore Sigma | M8937-100EA | ForD2:D37+D16:D37g organoid fragments |
| Animal strain: C57BL/6J | Jackson Lab | #000664 | For organoid culture |
References
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