Primer fare bağırsak Organoidlerin genetik mühendisliği dondurulmuş bölümleme için Manyetik Nano madde dönüştürücü viral vektörler kullanma
Summary
Biz adım adım talimatları tarif: 1) etkin bir şekilde bağırsak organoidleri Lenti-veya retroviral dönüştürücü için manyetik nano maddeler kullanarak mühendis ve 2) mühendislik organoidler dondurulmuş bölümler oluşturmak. Bu yaklaşım, akım etkilerinin incelenmesi için organoidlerde gen ifadesini verimli bir şekilde değiştirmek için güçlü bir araç sağlar.
Abstract
İntestinal nevuslardır kültürler, bağırsak kök hücresini araştırmak için benzersiz bir fırsat sağlar ve biyoloji içinde yer alan biyolojisi, organoidlerde gen ifadesini manipüle etmek için etkili yaklaşımlar bu arenada sınırlı ilerleme kaydetmesine karşın. Crispr/Cas9 teknolojisi, nevuslardır üretimi için hücrelerin hassas genom düzenlemesine izin verirken, bu strateji hem zaman alıcı hem de pahalı olan sıra analizi ile geniş seçim ve tarama gerektirir. Burada, intestinal organoidlerin verimli viral dönüştürücü için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Bu yaklaşım hızlı ve son derece etkilidir, böylece CRISPR/Cas9 teknolojisinin doğasında zaman ve gider azalır. Ayrıca immünohistokimyasal veya immünofluorescent boyama ile daha fazla analiz için bozulmamış nevuslardır kültürlerden dondurulmuş bölümler oluşturmak için bir protokol sunuyoruz, hangi gen ifadesi veya susturma onaylamak için kullanılabilir. Gen ifadesi veya susturulması için viral vektörler başarılı dönüştürücüden sonra elde edilir, bağırsak kök hücresi ve Crypt fonksiyonu hızla değerlendirilebilir. Çoğu nevuslardır etütler in vitro olarak çalışsa da, organoidler in vivo fonksiyonel analizler için farelere de teslim edilebilir. Dahası, şu anda mevcut tedaviler genellikle genomu değiştirmek yerine gen ifadesi veya protein fonksiyonuyla işlev gördükleri için ilaçlara yönelik terapötik tepkiler tahmin etmek için yaklaşımlarımız avantajlıdır.
Introduction
Kültür fare veya insan kript hücreleri üç boyutlu olarak (3D) küçük bağırsak veya kolon uzun süre boyunca organoids gibi hücreler büyük bir atılım sağladı çünkü bu kültürler intestinal epitelyum içinde vivo tanımlama özellikleri görüntüleme 1 , 2 , 3. organoids birincil kript türetilen kendi kendine yenileme ve kendi kendine organizasyon, cep fonksiyonları kökeni kendi dokularına benzer sergileyen yeteneğine sahiptir. Nitekim, organoids sadece kript in vivo yapısal organizasyonu değil, aynı zamanda birçok moleküler özellikleri, böylece normal biyoloji ve hastalık Devletler çalışmak için yararlı araçlar sağlayan reapitulate. Göstermek için, nevuslardır çalışmalar doku rejenerasyon dahil yeni moleküler yollar ortaya koydu1,2,3,4,5 yanı sıra fonksiyonu artırabilir ilaçlar patolojik ayarlar6,7.
İntestinal astar en son derece rejeneratif memeliler dokuları arasında olduğu için, her 3-5 gün içinde bakteri, toksinler ve diğer patojenlerden organizmayı korumak için kendini yenileyen bağırsak kök hücrelerinin çalışma özellikle ilgi bağırsak lümen. Bağırsak kök hücreleri (ISCs) bu olağanüstü rejeneratif yeteneği sorumludur ve böylece yetişkin kök hücre fonksiyonu1,2eğitim için benzersiz bir paradigma sağlar. Lineage-farelerde izleme denemeler izole Lgr5-pozitif kök hücreleri 3D organoids veya ‘ mini-cesareti ‘ in vitro oluşturmak için kültürlü olabilir gösterdi nerede yakından onların in vivo karşı ayna. Organoid kültürler Ayrıca progenitors oluşan bağırsak Crypt hücre yalıtımlarından elde edilebilir, ISCs, ve Paneth hücreleri, ikincisi epitel niş hücreleri oluşturmaktadır in vivo. Aslında, primer bağırsak Crypt hücrelerinden nevuslardır kültür yaygın olarak kullanılabilir reaktifler kullanarak çoğu laboratuvarlarda uygulanması kolay nispeten rutin bir teknik haline gelmiştir. Bu model aynı zamanda RNA sıralaması (RNA-seq) ve kütle spektrometresi, immünhistokimya veya immünofluorescent boyama2,4,8proteinleri tarafından Gen ifadesinin nicel analizine imkan tanır. Buna ek olarak, fonksiyonel genetik (gen aşırı ifade veya aktive mutant geni ifadesi) veya fonksiyon kaybı (gen susturma veya bir fonksiyon kaybı mutant ifade) yaklaşımlar2kullanılarak incelenebilir.
Önemlisi, düşük verimlilik ve standart plazmid DNA ‘Sı yüksek toksisitesi veya polybrene ile viral iletim protokolleri alanında büyük bir engel kalır. CRISPR/Cas9 teknolojisi hassas genom düzenleme için izin verir, ancak bu yaklaşım sıra doğrulama9tarafından izlenen zaman alıcı seçim gerektirir. Burada, manyetik nanopartiküllere konjugasyon ve manyetik alanın uygulanması ile viral partiküllerin teslimatını optimize eden primer bağırsak organoidleri için viral bir dönüştürücü Protokolü sunuyoruz. Önceki protokollerde önemli değişiklikler4,5,10,11,12,13 ve önerileri verimliliği artırmak için sağlanır. Ayrıca immunohistokimya veya immünofluorescent boyama ile daha fazla analiz için 3D matrigel (bundan böyle Bodrum membran matris veya matris olarak da adlandırılır) kültürlü bozulmamış organoidlerden dondurulmuş bölümler oluşturmak için bir yaklaşım açıklanmaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Organoids olarak yetişkin intestinal epitelin primer kültürü, kök hücre fonksiyonunda yer alan moleküler mekanizmalar, intestinal epitelyal homeostaz ve patoloji1,2,3, 4‘ ü yapın. CRISPR/Cas9 teknolojisi genetik mühendisliği organoids için kullanılabilir olsa da9, istenilen genetik değişiklikler için sıra analizi dayalı geniş tarama ve seçim için ih…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Sağlık Ulusal Enstitüsü (R01DK102943, R03CA182679, R03CA191621), Maryland kök hücre araştırma fonu (2015-MSCRFE-1759, 2017-MSCRFD-3934), Amerikan Akciğer Derneği, Allegheny Sağlık Ağı-Johns tarafından hibe tarafından desteklenmektedir Hopkins Araştırma Fonu ve Hopkins sindirim hastalıkları temel araştırma çekirdek merkezi.
Materials
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | Base medium for 293T cells |
| DMEM/F12+ | Thermo Fisher Scientific | 12634010 | Base medium for organoid culture medium and organoid digestion buffer |
| OPTI-MEM | Thermo Fisher Scientific | 11058021 | Virus plasmids transfection medium |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-011-CV | Component of virus collection medium and 293T medium |
| Pen/Strep | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Component of organoid culture medium and crypt dissociation buffer |
| PBS (without Ca2+, Mg2+) | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | A wash buffer and component of crypt dissociation buffer |
| Mem-NEAA | Thermo Fisher Scientific | 11140050 | Component of organoid culture medium |
| GlutamaxII | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Component of organoid culture medium |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | Component of organoid culture medium |
| EGF | Millipore Sigma | E9644 | Component of organoid culture medium |
| Noggin | Peprotech | 250-38 B | Component of organoid culture medium |
| R-spondin | R&D | 7150-RS-025/CF | Component of organoid culture medium |
| Human recombinant insulin | Millipore Sigma | I9278-5ml | Component of organoid culture medium |
| Nicotinamide | Millipore Sigma | N3376-100G | Component of Transduction medium |
| Wnt3A | R&D | 5036-WN-010 | Component of Transduction medium |
| Y27632 | Millipore Sigma | Y0503-1MG | Component of Transduction medium |
| 0.5M EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | Component of Crypts dissociation buffer |
| DTT (dithiothreitol) | Thermo Fisher Scientific | R0861 | Component of Crypts dissociation buffer |
| Dispase I | Millipore Sigma | D4818-2MG | Component of organoid digestion buffer |
| DNase I | Millipore Sigma | 11284932001 | Component of organoid digestion buffer |
| matrigel(Growth factor reduced) | Corning | 356231 | Used as a matrix to embed organoids |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | Medium for transfection in viral production |
| ViralMag R/L | Oz Biosiences | RL40200 | Magnetic particles of viral transduction |
| Magnetic plate | Oz Biosiences | MF10000 | Magnetic plate to facilitate viral transduction |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | Transfection agent in viral production |
| Poly-D-Lysine | Millipore Sigma | A-003-E | Coating for plates before seeding 293T cells |
| 4% Formaldehyde Solution | Boster | AR1068 | Solution to fix organoids |
| O.C.T embedding compound | Thermo Fisher Scientific | 4583S | For embedding of the the organoids |
| 5 mL Falcon polystyrene tubes | Corning | 352054 | |
| 50 mL Falcon Tubes | Sarstedt | 62.547.100 | |
| Orbitron rotator II Rocker Shaker | Boekel Scientific | 260250 | |
| Olympus Inverted microscop CK30 | Olympus | CK30 | for scanning and counting crypts |
| Zeiss Axiovert 200 inverted fluorescence | Nikon | Axiovert 200 | for viewing fluorescence in the crypts |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter unit with Ultracel-100 membrane | Milipore Sigma | UFC910024 | For concentrating viruses |
| pluriStrainer 20 µm (Cell Strainer) | pluriSelect | SKU 43-50020 | For preparing organoid fragments |
| Falcon Cell Strainer | Fisher Scientific | 352340 | For preparing cyrpts of similar size after crypt isolation |
| Greiner CELLSTAR multiwell culture plates 48 wells (TC treated with lid) | Millipore Sigma | M8937-100EA | ForD2:D37+D16:D37g organoid fragments |
| Animal strain: C57BL/6J | Jackson Lab | #000664 | For organoid culture |
References
- Cheung, E. C., et al. TIGAR is required for efficient intestinal regeneration and tumorigenesis. Dev Cell. 25 (5), 463-477 (2013).
- Xian, L., et al. HMGA1 amplifies Wnt signalling and expands the intestinal stem cell compartment and Paneth cell niche. Nature Comm. , (2017).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Koo, B. K., et al. Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nature Methods. 9 (1), 81-83 (2012).
- Kabiri, Z., et al. Stroma provides an intestinal stem cell niche in the absence of epithelial Wnts. Development. 141, 2206-2215 (2014).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Boj, S. F., et al. Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients. J Vis Exp. (120), (2017).
- Muñoz, J., et al. The Lgr5 intestinal stem cell signature: robust expression of proposed quiescent ‘+4’ cellmarkers. EMBO J. 31 (14), 3079-3091 (2012).
- Schwank, G., et al. Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients. Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2014).
- Andersson-Rolf, A., Fink, J., Mustata, R. C., Koo, B. K. A video protocol of retroviral infection in primary intestinal organoid culture. J Vis Exp. (90), e51765 (2014).
- Sato, T., Clevers, H. Primary mouse small intestinal epithelial cell cultures. Methods Mol Biol. 945, 319-328 (2013).
- Ye, Z., Yu, X., Cheng, L. Lentiviral gene transduction of mouse and human stem cells. Methods Mol Biol. 430, 243-253 (2008).
- Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).
- Tesfaye, A., et al. The High-Mobility Group A1 gene up-regulates Cyclooxygenase-2 expression in uterine tumorigenesis. Cancer Res. 67 (9), 3998-4004 (2007).
- Haim, H., et al. Synchronized infection of cell cultures by magnetically controlled virus. J. Virol. 79 (1), 622-625 (2005).
- Xue, X., Shah, Y. M. In vitro organoid culture of primary mouse colon tumors. J Vis Exp. (75), e50210 (2013).
