用限制性酶来测定染有菁染料的 DNA
Summary
染色 DNA 分子荧光显微镜允许科学家在实验中看到他们。在这里提出的方法, DNA 分子是前染色的荧光染料和消化的甲基化和非甲基化的敏感限制酶。
Abstract
荧光显微镜的 DNA 可视化利用了各种染料, 如菁染料。这些染料因其对 DNA 的亲和力和敏感性而被利用。为了确定在实验完成后 dna 分子是否全长, 需要用限制性酶消化 dna 来确定染色分子是否全长。然而, 染色的 dna 可能会抑制酶, 因此需要一种方法来确定什么酶可以用于荧光染色 dna。在这种方法中, dna 在一夜之间被染有菁染料, 使染料和 dna 平衡。接下来, 染色 DNA 被一种限制性的酶消化, 装入凝胶和电泳。将实验的 DNA 消化带与在硅片中的文摘进行比较, 以确定限制性酶活性。如果有相同数量的波段如预期, 那么反应是完整的。超过预期的波段表明部分消化和较少的带表示不完全消化。这种方法的优点是它的简单性, 它使用的设备, 科学家将需要一个限制酶检测和凝胶电泳。这种方法的一个局限性是, 大多数科学家可用的酶是商业上可用的酶;但是, 任何限制酶都可以使用。
Introduction
托托系列 (TOTO-1、YOYO-1、POPO-1、BOBO-1、TOTO-3、YOYO-3、POPO-3 和 BOBO-3;表 1)用于多种实验, 其中 DNA 的可视化是 必需的1,234568,9,10,11,12,13,14,15,16,17. 由于其量子产率、灵敏度和对 DNA 分子的高亲和性, 使菁二聚体被广泛应用于18、19、20。菁二聚体染料对双链 DNA 有很大的选择性, 当插层有100到1000倍的荧光21。吡啶染料 (YOYO-1、TOTO-1、YOYO-3 和 TOTO-3) 的发射波长较其 quinolium 染料 (BOBO-1、POPO-1、BOBO-3 和 POPO-3) 相对较短 (表 1)22。此外, 菁聚插入 DNA 的量子产率高 (0.2-0.6)22。然而, 使用一种酶来确定 dna 分子的甲基化分布,2或在已经沾有荧光染料的 dna 分子的拉伸23中需要一种方法来确定什么酶能消化染色的 dna。任何类型的染料, intercalates 成 dna 或任何酶, 提供了一个可辨认的 dna 基质的模式可以用于这种方法。
孟et al.首先通过使用各种不同染料的凝胶电泳测定 prestained DNA 的消化率24。Maschmann 的et al.深入研究了染料的托托系列。两者都确定了染色 dna 的消化率, 看看是否可以用限制性酶25来消化带有特定染料染色的 dna。其他方法研究染料插层与 DNA 的结合效应使用光学镊子26或核磁共振27。任何一种方法都需要专用设备;然而, 这种方法允许大多数分子生物学实验室确定染料是否干扰限制性酶消化的设备。
此外, 在其他测量给定分子长度的方法中, 光学制图在表面上拉长了不 dna 分子, 并消化了 dna, 以确定片段的拉伸和大小。染料的插层显示增加了荧光染色 DNA 分子的轮廓长度, 并根据所使用的染料, 其轮廓长度是不同的21。该方法已在各种基因组中得到了应用 1,3461328293031. 然而, 如果分子是前染色的, 根据染料和酶, 该酶可能无法切割 DNA 染色与给定的染料。因此, 这种方法确定是否 DNA 染色的特定染料可以消化的酶。此外, 根据染料的浓度和染料的使用, 在凝胶中的 dna 带的迁移速度会比原生 dna 的移动慢得多, 因为 dna 骨架部分解除, 使染料空间插入基对32.
然而, 有时这些染料可以部分或完全抑制某些限制性酶的作用7,24。这被认为是由于荧光染料的附着导致 DNA 结构的改变, 这可能会阻止酶识别其特定的序列。了解这些染料如何影响限制性酶可以帮助在实验中的甲基化剖面或染色 DNA 的延伸是必需的。
在我们的方法, DNA 被染色的荧光的兴趣和消化的限制酶。然后在凝胶上电泳 DNA, 对其进行了成像, 并测定了限制性酶消化率。根据凝胶上的切口形态选择限制性酶。太多的波段导致 dna 带的重叠, 而太少的波段没有给出完整的 dna 分子的图像。有一个甜美的斑点, 能够确定的轮廓的消化 DNA 分子;因此, 它将取决于所使用的 DNA 和酶。这种方法的优点是它的简单性;它只需要在限制消化和凝胶电泳中使用的设备。
Protocol
Representative Results
Discussion
为了消化荧光标记的 DNA (图 1), 需要一系列步骤。首先, DNA 在一夜之间被荧光染色。DNA 可以用青菁聚孵育一段较短的时间;但是, 卡尔松et al.发现, 由于不完整的染色20, dna 为每个 dna 大小创建了双波段。为了纠正这种现象, DNA 可以在一夜之间被染色以防止双波段的发生。这是协议中的关键步骤。如果染料没有孵育足够长的时间, 染料-DNA 可?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项研究由国家普通医学科学研究所 (研究院) (5605100122001)、国立卫生研究院 (NIH) 的一个组成部分以及内布拉斯加州大学科尔尼 (UNK) 暑期学生研究计划 (SSRP) 和 UNK本科研究奖学金 (报告)。
Materials
| Unmethylated lambda DNA | NEB | N3013S | |
| YOYO-1 | ThermoFisher Scientific | Y3601 | |
| TOTO-1 | ThermoFisher Scientific | T3600 | |
| POPO-1 | ThermoFisher Scientific | P3580 | |
| BOBO-1 | ThermoFisher Scientific | B3582 | |
| YOYO-3 | ThermoFisher Scientific | Y3606 | |
| TOTO-3 | ThermoFisher Scientific | T3604 | |
| POPO-3 | ThermoFisher Scientific | P3584 | |
| BamHI | NEB | R0136S | |
| PmlI | NEB | R0532S | |
| ScaI | NEB | R3122S | |
| EcoRI | NEB | R0101S | |
| HindIII | NEB | R0104S | |
| SmaI | NEB | R0141S | |
| Tris | Fisher | BP152-1 | Irritant |
| EDTA | Fisher | S316-212 | Toxic |
| HCl | Fisher | S25358 | Corrosive and irritant |
| Buffer 1 | NEB | B7201S | NEB 1.1 |
| Buffer 2 | NEB | B7202S | NEB 2.1 |
| Buffer 3 | NEB | B7204S | NEB Cutsmart |
| High gelling temperature agarose gel | Lonza | 50041 | |
| Acetic Acid | Fisher | S25118 | Hazardous |
| Blue light transilluminator | Dark Reader | DR196 | Wear correct eyewear |
| Ethidium bromide | Fisher | 15585011 | Carcinogen; other alternatives are Nancy 520, Gel red, etc. |
| Cannon EOS Rebel T3I camera | Cannon | ||
| Apogee Model H4 | Biorad | 1704510 | |
| Power Pac Basic Power Supply | Biorad | 1645050 | |
| Ficoll | Fisher Scientific | BP525-25 | |
| Bromophenol blue | Fisher Scientific | B-392 | |
| Xylene Cyanol | Eastmen | T1579 |
References
- Teague, B., et al. High-resolution human genome structure by single-molecule analysis. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (24), 10848-10853 (2010).
- Ananiev, G. E., et al. Optical mapping discerns genome wide DNA methylation profiles. BMC Mol Biol. 9, 68 (2008).
- Zhou, S., et al. Validation of rice genome sequence by optical mapping. BMC Genomics. 8, 278 (2007).
- Reslewic, S., et al. Whole-genome shotgun optical mapping of Rhodospirillum rubrum. Appl Environ Microbiol. 71 (9), 5511-5522 (2005).
- Zhou, S., et al. Whole-genome shotgun optical mapping of Rhodobacter sphaeroides strain 2.4.1 and its use for whole-genome shotgun sequence assembly. Genome Res. 13 (9), 2142-2151 (2003).
- Gupta, A., Kounovsky-Shafer, K. L., Ravindran, P., Schwartz, D. Optical mapping and nanocoding approaches to whole-genome analysis. Microfluidics and Nanofluidics. 20 (44), 1-14 (2016).
- Kounovsky-Shafer, K. L., et al. Presentation of large DNA molecules for analysis as nanoconfined dumbbells. Macromolecules. 46 (20), 8356-8368 (2013).
- Kim, Y., et al. Nanochannel confinement: DNA stretch approaching full contour length. Lab Chip. 11 (10), 1721-1729 (2011).
- Yu, H., Jo, K., Kounovsky, K. L., de Pablo, J. J., Schwartz, D. C. Molecular propulsion: chemical sensing and chemotaxis of DNA driven by RNA polymerase. J Am Chem Soc. 131 (16), 5722-5723 (2009).
- Lam, E. T., et al. Genome mapping on nanochannel arrays for structural variation analysis and sequence assembly. Nat Biotechnol. 30 (8), 771-776 (2012).
- Cao, H., Tegenfeldt, J. O., Austin, R. H., Chou, S. Y. Gradient nanostructures for interfacing microfluidics and nanofluidics. Applied Physics Letters. 81 (16), 3058-3060 (2002).
- Gupta, A., et al. Single-molecule analysis reveals widespread structural variation in multiple myeloma. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (25), 7689-7694 (2015).
- Wu, C. W., Schramm, T. M., Zhou, S., Schwartz, D. C., Talaat, A. M. Optical mapping of the Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis genome. BMC Genomics. 10, 25 (2009).
- Jo, K., Schramm, T. M., Schwartz, D. C. A single-molecule barcoding system using nanoslits for DNA analysis : nanocoding. Methods Mol Biol. 544, 29-42 (2009).
- Jo, K., Chen, Y. L., de Pablo, J. J., Schwartz, D. C. Elongation and migration of single DNA molecules in microchannels using oscillatory shear flows. Lab Chip. 9 (16), 2348-2355 (2009).
- Jo, K., et al. A single-molecule barcoding system using nanoslits for DNA analysis. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (8), 2673-2678 (2007).
- Reccius, C. H., Mannion, J. T., Cross, J. D., Craighead, H. G. Compression and free expansion of single DNA molecules in nanochannels. Phys Rev Lett. 95 (26), 268101 (2005).
- Staerk, D., Hamed, A. A., Pedersen, E. B., Jacobsen, J. P. Bisintercalation of homodimeric thiazole orange dyes in DNA: effect of modifying the linker. Bioconjug Chem. 8 (6), 869-877 (1997).
- Spielmann, H. P., Wemmer, D. E., Jacobsen, J. P. Solution structure of a DNA complex with the fluorescent bis-intercalator TOTO determined by NMR spectroscopy. Biochimie. 34, 8542-8553 (1995).
- Carlsson, C., Jonsson, M., Akerman, B. Double bands in DNA gel electrophoresis caused by bis-intercalating dyes. Nucleic Acids Res. 23 (13), 2413-2420 (1995).
- Kundukad, B., Yan, J., Doyle, P. S. Effect of YOYO-1 on the mechanical properties of DNA. Soft Matter. 10 (48), 9721-9728 (2014).
- Technologies, L. . The Molecular Probes Handbook: A guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies. , (2010).
- Riehn, R., et al. Restriction mapping in nanofluidic devices. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (29), 10012-10016 (2005).
- Meng, X., Cai, W., Schwartz, D. C. Inhibition of restriction endonuclease activity by DNA binding fluorochromes. J Biomol Struct Dyn. 13 (6), 945-951 (1996).
- Maschmann, A., Kounovsky-Shafer, K. L. Determination of restriction enzyme activity when cutting DNA labeled with the TOTO Dye family. Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. , 1-12 (2017).
- Biebricker, A. S., et al. The impact of DNA intercalators on DNA and DNA-processing enzymes elucidated through force-dependent binding kinetics. Nature Communications. 6, 7304 (2015).
- Gunther, K., Mertig, M., Seidel, R. Mechanical and structural properties of YOYO-1 complexed DNA. Nucleic Acids Res. 38 (19), 6526-6532 (2010).
- Zhou, S., et al. A clone-free, single molecule map of the domestic cow (Bos taurus) genome. BMC Genomics. 16, 644 (2015).
- Ray, M., et al. Discovery of structural alterations in solid tumor oligodendroglioma by single molecule analysis. BMC Genomics. 14, 505 (2013).
- Chen, S., et al. Genome sequence of the model medicinal mushroom Ganoderma lucidum. Nat Commun. 3, 913 (2012).
- Zhou, S., et al. A single molecule scaffold for the maize genome. PLoS Genet. 5 (11), e1000711 (2009).
- Sischka, A., et al. Molecular mechanisms and kinetics between DNA and DNA binding ligands. Biophys J. 88 (1), 404-411 (2005).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), (2012).
- Zipper, H., Brunner, H., Bernhagen, J., Vitzthum, F. Investigations on DNA intercalation and surface binding by SYBR Green I, its structure determination and methodological implications. Nucleic Acids Res. 32 (12), e103 (2004).
