Bestimmen, ob DNA mit einem Cyanin Farbstoff kann nicht verdaut werden mit Restriktionsenzymen gebeizt
Summary
Färbung der DNA-Moleküle für die Fluoreszenzmikroskopie ermöglicht eine Wissenschaftler um sie während eines Experiments zu sehen. In die hier vorgestellte Methode sind DNA-Moleküle vorab mit Fluoreszenz-Farbstoffen gefärbt und mit Methylierung und nicht-Methylierung sensibel Restriktionsenzymen verdaut.
Abstract
Visualisierung der DNA für die Fluoreszenzmikroskopie nutzt eine Vielzahl von Farbstoffen wie Cyanin-Farbstoffe. Diese Farbstoffe werden aufgrund ihrer hohen Affinität und Sensibilität für DNA eingesetzt. Um festzustellen, ob die DNA-Moleküle in voller Länge nach Abschluss des Experiments sind, ist eine Methode erforderlich, um festzustellen, ob die gefärbten Moleküle in voller Länge sind von DNA mit Restriktionsenzymen verdaut. Gefärbten DNA kann jedoch die Enzyme hemmen, so eine Methode benötigt wird, um festzustellen, welche Enzyme, die man für Fluorochrom verwenden DNA befleckt. Bei dieser Methode wird DNA gefärbt, mit einem Cyanin-Farbstoff über Nacht um den Farbstoff und DNA zu equilibrate ermöglichen. Nächste, gefärbten DNA ist mit einem Restriktionsenzym verdaut, geladen in ein Gel und electrophoresed. Die experimentelle DNA-Digest-Bänder sind ein in Silico -Digest zu bestimmen, die Beschränkung Enzym-Aktivität gegenüber. Wenn es die gleiche Anzahl von Bands wie erwartet, ist die Reaktion abgeschlossen. Mehr Bands als erwartet, teilweise Verdauung zeigen und weniger Bands zeigen unvollständige Verdauung. Der Vorteil dieses Verfahrens liegt in seiner Einfachheit und es verwendet Geräte, die ein Wissenschaftler für ein Restriktionsenzym müssten assay und gel-Elektrophorese. Eine Einschränkung dieser Methode ist, dass die Enzyme zur Verfügung, um die meisten Wissenschaftler im Handel erhältlichen Enzyme sind; jedoch konnte Restriktionsenzyme verwendet werden.
Introduction
Die TOTO-Serie (TOTO-1, YOYO-1, POPO-1, BOBO-1, TOTO-3, YOYO-3, POPO-3, und BOBO-3; Tabelle 1) wird in einer Vielzahl von Experimenten verwendet wo die Visualisierung der DNA erforderlich1,2,3,4,5,6,7, ist 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17. Cyanin-Dimer-Familie ist weit verbreitet, aufgrund ihrer Quantenausbeute, Empfindlichkeit und hohe Affinität für DNA-Moleküle18,19,20. Cyanin Dimer Farbstoffe haben große Selektivität für doppelte stranded DNA und wenn Zwischenspiele einen 100 bis 1000 fachen Anstieg der Fluoreszenz21haben. Pyridiniumdichromat Farbstoffe (YOYO-1, TOTO-1, YOYO-3 und TOTO-3) haben eine kürzere Emissionswellenlänge als ihre Quinolium färben (BOBO-1, POPO-1, BOBO-3 und POPO-3) Pendants (Tabelle 1)22. Auch die Quantenausbeute für Cyanin Dimere Zwischenspiele in DNA ist hoch (0,2 – 0,6)22. Mithilfe eines Enzyms bestimmen das Profil der Methylierung von DNA-Molekül2 oder dehnen23 eines DNA-Moleküls, die bereits mit fluoreszierenden Farbstoff gefärbt erfordert jedoch eine Methode, um festzustellen, welche Enzyme wird gebeizt DNA zu verdauen. Jede Art von Farbstoff, die in DNA Plasmamembrane oder jedes Enzym, das eine erkennbare Muster des Substrats DNA gibt kann für diese Methode verwendet werden.
Meng Et Al. bestimmt zunächst die Verdauung bei prestained DNA durch Gelelektrophorese mit einer Vielzahl von verschiedenen Farbstoffen24. Maschmann Et Al. vertieft tiefer zu betrachten, die TOTO-Familie von Farbstoffen. Beide entschlossen die Verdauung bei gefärbten DNA zu sehen, ob DNA mit einem bestimmten Farbstoff gefärbt mit einem Restriktionsenzym25verdaut werden könnte. Andere Methoden studieren Bindung Auswirkungen von Farbstoffen mit DNA mit Hilfe von optischen Pinzette26 oder NMR27eingelagert. Entweder-Methode erfordert spezialisierten Ausrüstung; in der Erwägung, dass mit dieser Methode können Geräte, die meisten molekularbiologischen Labore haben um festzustellen, ob ein Farbstoff stört eine Beschränkung Enzym Verdauung.
Darüber hinaus hat optische Zuordnung in andere Methoden, um die Länge eines bestimmten Moleküls zu messen, länglich ungefärbten DNA-Moleküle auf einer Oberfläche und verdaut DNA, um die Ausdehnung und Größe der Fragmente zu bestimmen. Interkalation von Farbstoff wurde gezeigt, dass die Kontur Länge der Gewebekulturen gefärbten DNA-Moleküle und abhängig von der Farbstoff verwendet, die Konturen Längen sind verschiedene21. Diese Methode wurde verwendet worden, in einer Vielzahl von Genome1,3,4,6,13,28,29,30, 31. jedoch wenn Moleküle vor gebeizt, je nach Farbstoff und Enzym, das Enzym möglicherweise nicht zum Schneiden von DNA mit einem bestimmten Farbstoff gefärbt. Diese Methode bestimmt somit, wenn DNA mit einem bestimmten Farbstoff gefärbt mit einem Enzym verdaut werden kann. Darüber hinaus werden abhängig von der Konzentration des Farbstoffes und der Farbstoff genutzt, die Mobilität der DNA Bands in einem Gel langsamer als native DNA aufgrund der teilweise Abbau der DNA Rückgrat um Platz für den Farbstoff zwischen Basenpaare32 einfügen zu migrieren .
Aber manchmal diese Farbstoffe können teilweise oder vollständig hemmen die Wirkung von bestimmten Restriktionsenzyme7,24. Dies ist vermutlich aufgrund eines strukturellen Wandels in der DNA verursacht durch die Befestigung der Fluoreszenzfarbstoff, die das Enzym kann verhindern, dass seine spezifischen Reihenfolge zu erkennen. Verstehen, wie diese Farbstoffe Restriktionsenzyme beeinflussen kann in Experimenten helfen wo die Methylierung-Profil oder die gefärbten DNA-Abschnitt erforderlich ist.
In unserer Methode wurde DNA befleckt mit einem Fluorochrom von Interesse und mit einem Restriktionsenzym verdaut. Dann wurde die DNA auf einem Gel, abgebildet, electrophoresed und die Beschränkung Enzym Verdauung wurde gemessen. Die Restriktionsenzyme wurden basierend auf den geschnittenen Muster auf einem Gel gewählt. Zu viele Bands verursacht Überlappung der DNA-Bänder und zu wenige Bands gaben kein vollständiges Bild des DNA-Moleküls. Es gibt ein Sweet Spot, das Profil der verdauten DNA-Moleküls bestimmen zu können; Daher hängt es von der DNA verwendet und das Enzym. Ein Vorteil dieser Methode ist seine Einfachheit; Es erfordert nur eine Einschränkung Verdauung und Gel-Elektrophorese verwendet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Um Eindringmittel beschrifteten DNA (Abbildung 1)zu verdauen, sind eine Reihe von Schritten erforderlich. Erstens ist DNA über Nacht mit einem Fluorochrom befleckt. DNA kann für einen kürzeren Zeitraum mit Cyanin Dimere inkubiert; Allerdings fand Carlsson Et Al. , dass DNA doppelte Bändern für jede DNA-Größe aufgrund unvollständiger Färbung20erstellt. Um dem abzuhelfen, kann die DNA über Nacht zu verhindern, dass doppelte Bänder ge…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Forschung wurde durch das nationale Institut für allgemeine medizinische Wissenschaft (NIGMS) (5605100122001), eine Komponente des National Institute of Health (NIH), und die University of Nebraska Kearney (UNK) Sommer Student Research Program (SSRP) und UNK finanziert. Undergraduate Research Fellowship (URF).
Materials
| Unmethylated lambda DNA | NEB | N3013S | |
| YOYO-1 | ThermoFisher Scientific | Y3601 | |
| TOTO-1 | ThermoFisher Scientific | T3600 | |
| POPO-1 | ThermoFisher Scientific | P3580 | |
| BOBO-1 | ThermoFisher Scientific | B3582 | |
| YOYO-3 | ThermoFisher Scientific | Y3606 | |
| TOTO-3 | ThermoFisher Scientific | T3604 | |
| POPO-3 | ThermoFisher Scientific | P3584 | |
| BamHI | NEB | R0136S | |
| PmlI | NEB | R0532S | |
| ScaI | NEB | R3122S | |
| EcoRI | NEB | R0101S | |
| HindIII | NEB | R0104S | |
| SmaI | NEB | R0141S | |
| Tris | Fisher | BP152-1 | Irritant |
| EDTA | Fisher | S316-212 | Toxic |
| HCl | Fisher | S25358 | Corrosive and irritant |
| Buffer 1 | NEB | B7201S | NEB 1.1 |
| Buffer 2 | NEB | B7202S | NEB 2.1 |
| Buffer 3 | NEB | B7204S | NEB Cutsmart |
| High gelling temperature agarose gel | Lonza | 50041 | |
| Acetic Acid | Fisher | S25118 | Hazardous |
| Blue light transilluminator | Dark Reader | DR196 | Wear correct eyewear |
| Ethidium bromide | Fisher | 15585011 | Carcinogen; other alternatives are Nancy 520, Gel red, etc. |
| Cannon EOS Rebel T3I camera | Cannon | ||
| Apogee Model H4 | Biorad | 1704510 | |
| Power Pac Basic Power Supply | Biorad | 1645050 | |
| Ficoll | Fisher Scientific | BP525-25 | |
| Bromophenol blue | Fisher Scientific | B-392 | |
| Xylene Cyanol | Eastmen | T1579 |
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