Summary
La néovascularisation IRIS, une complication fréquente de la maladie ischémique de la rétine, peut conduire à vue en danger de glaucome néovasculaire. Nous décrivons ici un protocole murin pour induire la néovascularisation iris expérimentaux qui peut-être être utilisée pour l’évaluation non invasive de substances modulant l’angiogenèse.
Abstract
Nous décrivons un modèle de la néovascularisation iris induite par ponction comme un modèle général pour l’évaluation non invasive de l’angiogenèse. Le modèle est également pertinent pour cibler un glaucome néovasculaire, une complication vue en danger de la rétinopathie diabétique. Cette méthode est basée sur l’induction de la réponse vasculaire iris par une série d’auto-obturant uvées crevaisons sur souris BALB/c et profite de la maturation postnatale du système vasculaire oculaire de souris. Souriceaux subissent uvées crevaisons de jour après la naissance 12.5, quand les chiots naturellement ouvrent leurs yeux, jusqu’au jour après la naissance 24,5. Grâce à la transparence de la cornée, la vascularisation iris peut être analysée facilement à travers le temps par des méthodes non invasives en vivo . En outre, l’iris translucide de souris BALB/c peut être flatmounted pour l’analyse détaillée immunohistologiques minime non-spécifiques fond de coloration. Dans ce modèle, angiogenèse est principalement conduit par l’inflammation et le plasminogène activation de systèmes. Le modèle induite par la ponction est le premier à induire la néovascularisation iris chez les petits rongeurs et a l’avantage de permettre de direct non invasif en vivo analyse du processus angiogénique. En outre, le modèle peut être associé angiogénique substances modulant, qui met en évidence son potentiel dans l’étude de l’angiogenèse dans une perspective in vivo .
Introduction
L’iris, ainsi que le corps ciliaire et la choroïde, compose de l’uvée, qui est un tissu plus vascularisé de le œil. Système vasculaire Iris est essentiel pour maintenir l’homéostasie dans la chambre antérieure de le œil. Par suite de l’abondantes connexions anastomose entre les artères et les veines, vaisseaux sanguins iris fournissent nutriments et alimentation en oxygène non seulement à l’iris elle-même, mais à l’ensemble du segment antérieur de l' oeil1.
La formation de nouveaux vaisseaux, ou angiogenèse de celles existantes, est fondamentale dans les processus physiologiques, tels que le développement et la guérison2. L’angiogenèse est finement régulée par une multitude de facteurs canoniques comme facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF) et inhibiteur de l’activateur du plasminogène (PAI), ainsi que plusieurs facteurs inflammatoires, et un déséquilibre de ces facteurs peut mener à pathologiques 3de l’angiogenèse.
Dans le œil, une néovascularisation est la cause de maladies mortelles vue, telles que la rétinopathie diabétique proliférante (PDR) et le glaucome néovasculaire (NVG). Dans ces maladies oculaires, la néovascularisation focale est couramment située dans les tissus rétiniens, encore le déséquilibre inflammatoires et de facteurs angiogéniques dans les deux postérieures et antérieures chambres oculaires de le œil a été associée par rubeosis iridis, le terme clinique pour iris néoangiogenèse pathologique4. Ces pathologies indiquent la capacité de l’iris adulte pour subir l’angiogenèse. Chez les souris, système vasculaire oculaire est immature après la naissance et poursuit après l’accouchement de la maturation. Cette particularité du développement est exploitée dans le modèle murin de la rétinopathie induite par l’oxygène, un modèle qui imite étroitement l’état clinique de la rétinopathie de la prématurité5. En outre, l’angiogenèse et l’inflammation jouent un rôle essentiel dans la guérison des mécanismes6, et la guérison elle-même a été associée à l’angiogenèse modèles7.
Dans cette étude, nous décrivons un modèle de la néovascularisation iris induite par la ponction. Uvée crevaisons sont effectués près de la limite extérieure de la limbe, qui induisent une néovascularisation iris en déclenchant la système de cicatrisation. Grâce à la transparence de la cornée, la vascularisation de l’iris peut être analysé facilement in vivo par des méthodes non invasives. Les yeux crevés présentent une augmentation du lit vasculaire dans l’iris, qui a été associée à une augmentation de l’activation du plasminogène et marqueurs inflammatoires8. Le modèle présenté possède un grand potentiel comme un nouvel outil pour étudier l’angiogenèse et criblage de composés angiogénique et permet direct en vivo visualisation des processus angiogénique.
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Protocol
Chiots de souris BALB/c des deux sexes ont été utilisés conformément à la déclaration sur l’utilisation des animaux en ophtalmologie et en recherche de Vision, et les protocoles ont été approuvées par le Comité de Stockholm pour la recherche éthique animale. Souris ont été logés dans les litières, ainsi que de la mère qui allaite, avec un cycle jour/nuit de 12 h, le libre accès à la nourriture et l’eau et surveillées quotidiennement.
Remarque : Pour l’intervention chirurgicale, les souris étaient gardés sous anesthésie à l’isoflurane volatil. Pommades oculaires sont déconseillées pendant les procédures d’oculaires, car ils risquent d’interférer avec les traitements et les substances utilisées. Si nécessaire, pour éviter l’oeil sec, une goutte de sérum physiologique stérile normale peut être appliquée. Si crevaisons uvées sont d’auto-guérison, a pris soin au cours de l’uvée crevaisons pour assurer la stérilité avec des instruments chirurgicaux. Traitement post-opératoire inclus hydratation avec une solution saline normale par voie sous-cutanée et avec une administration topique oculaire de chlorhydrate de tétracaïne une analgésie. Les chiots ont été autorisés à récupérer à décubitus sternal sur un coussin chauffant avant d’être retourné à la mère qui allaite, dans une cage propre. Portées ont été conservées avec la mère qui allaite même d’éviter le stress.
1. anesthésie
- Préparer la chambre d’induction de l’anesthésie, à administrer l’anesthésie isoflurane et veiller à ce qu’un masque de petite souris est également couplé.
Remarque : Effectuez l’expérimentation animale tout en accord avec toutes les autorisations éthiques applicables. - Pré-remplir la chambre induction avec 3-4 % isoflurane volatils dans l’air atmosphérique.
NOTE : Différentes substances anesthésiques autres qu’isoflurane peuvent servir, selon permis éthiques. Des procédures anesthésiques volatils devraient se trouver à bord une hotte ventilée de banc ou de la fumée. - Placer un chiot souris BALB/c de postnatal (P) âgés de 12,5 jours dans la chambre de l’induction. Confirmer que l’appareil d’anesthésie est prêt à livrer l’isoflurane devant la chambre de l’induction.
Remarque : Les souriceaux est fragiles et mieux géré par la peau du cou. Garder les chiots ensemble comme une litière ou avec la mère qui allaite à éviter le stress. - Laisser le chiot à être complètement anesthésiés.
- Aspirer doucement, le chiot de souris par la peau du cou.
NOTE : Gardez la chambre induction fermée en tout temps pour l’induction sûre et stable. - Transférer la souris dans le masque de rongeur. Assurez-vous de passer le flux d’anesthésique de la chambre de l’induction au masque en déplaçant la souris.
- Effectuer un pincement de l’orteil pour confirmer l’anesthésie.
2. perforer la procédure sous stéréoscope chirurgicale
- Positionnez la souris en position de décubitus latéral. Confirmer que le masque est bien placé donc l’oeil de la souris est dans le champ de vision du stéréoscope.
- Tourner doucement la tête de la souris alors que l’oeil soit vers le haut vers le stéréoscope.
NOTE : Claire mise au point de le œil doit être réalisée sous le stéréoscope. Pour le positionnement, un grossissement de 16 X est recommandé, alors que 40 X devrait être utilisé pour effectuer l’intervention chirurgicale. Si permis éthiques permettent, tailler la pointe de la moustache peut faciliter la visualisation de le œil. - À l’aide de petites pinces égalisateur, saillie soigneusement oeil le chiot en appliquant une pression à la baisse sur les paupières, dorsales et ventrales à le œil.
- Gardez une main douce mais ferme sur paupière du pup, avec une petite pince.
Remarque : Il est recommandé d’effectuer la protrusion oculaire et couvercle en tenant avec la main non dominante, comme la main dominante doit exécuter la procédure de ponction. - Utilisez le stéréoscope pour localiser le limbe cornéen. Limbus BALB/c albinos peuvent être facilement identifiés par le plexus vasculaire circulaire postérieur de la cornée.
- Avec une aiguille biseautée de 0,25 mm de diamètre (30 G), effectuer une petite perforation uvée, près de la limite limbique postérieure de l’uvée. Utiliser seulement la pointe de l’aiguille, et non plus de la moitié le biseau (équivalent à 0,5 mm), percer l’uvée. Si exécutée correctement, les piqûres uvées sont étanches, mais injection intraoculaire d’étude substances peut être administrée par la même blessure de ponction.
Remarque : Si éprouvé avec anatomie oculaire de souris, la ponction uvée est exécutée entre le corps ciliaire et l’ora serrata. Il faut tout en effectuant la ponction uvée pour éviter une rupture de la lentille. - Effectuer la deuxième ponction uvée dans le site en face de l’oeil depuis le premier site de ponction. Optimiser la distance et la position de la perforation ; Pensez à 12 et 06:00 crevaisons, avec 12:00 étant aussi dorsale que possible.
- Répéter l’uvée perforations tous les quatre jours jusqu'à P24.5. Avant chaque ponction uvée successifs, surveiller État animal accordant une attention particulière à la présence d’une cataracte traumatique en raison des dommages de lentille pendant la ponction uvée, soit évidente pression oculaire réduite. But pour l’exécution des ponctions répétées sur les mêmes postes que les perforations antérieures pour un effet optimal.
3. non invasif in Vivo de surveillance
- Avant la ponction ou injections chaque jour expérimentale, anesthésier la souris interprété ci-dessus.
- Avec la souris en position de décubitus latéral, légèrement dépasser le œil.
- Se concentrer sur la vascularisation de l’iris avec le stéréoscope chirurgical.
- Prendre une photo de la vascularisation de l’iris avec un appareil photo monté sur le stéréoscope chirurgical.
Remarque : Bien que non nécessaire, induisant la méiose peut être utile pour normaliser la surface de l’iris / animal. Envisager d’éthiques permis lorsque vous sélectionnez un agent inducteur de la méiose. Soigneusement mise au point du système vasculaire iris facilitera davantage l’analyse quantitative. Une grandeur de 40 X est recommandée.
4. soins postopératoires
- Retirer le chiot BALB/c le masque de rongeur et transférer délicatement sur un coussin chauffant en couches avec un treillis chirurgical.
- Appliquer une goutte de solution à 1 % tétracaïne aux yeux crevés.
Remarque : Autres solutions analgésiques peuvent être utilisées, selon permis éthiques. - Hydrater l’animal avec une injection sous-cutanée de 200 µL de solution saline normale stérile.
- Retourner le chiot à la mère qui allaite dans une cage propre souris.
- Surveiller le processus de récupération. Le chiot doit être capable de deambulate et de revenir à la litière.
5. œil énucléation
- Euthanasier l’animal par dislocation cervicale. Effectuer une énucléation et la dissection sous un stéréoscope pour meilleure visualisation de la procédure.
Remarque : Les procédures différentes d’euthanasie peuvent être utilisés. Il est recommandé de se conformer strictement aux permis d’éthiques. - Séparez les paupières pour améliorer l’exposition à le œil.
- Faire une petite incision (environ 0,5 cm) près le canthus des paupières avec des ciseaux courbes de œil Bonn.
- Utilisez l’espace périoculaire exposées pour insérer les micro forceps liant derrière (sous) le monde dans l’orbite.
- Prenez le tissu qui entoure le œil et tirez doucement vers le haut. Éviter d’accrocher le globe oculaire, utiliser les tissus environnants plus près de l’orbite.
- Insérer les ciseaux d’oeil Bonn courbes derrière le globe oculaire dans l’orbite.
- Couper à travers les tissus environnants jusqu’au relâchement de la prise de le œil.
NOTE : Cette technique de dissection maintient l’anatomie de le œil et bénéficie d’une analyse ultérieure. - Procéder à l’ablation du tissu extrinsèque de le œil. Le prélèvement de tissus étrangers peut être effectué après avoir résolu, si l'on préfère.
Remarque : Souris BALB/c sont la mélanine déficiente, par conséquent, pour augmenter le contraste, un fond sombre est recommandé pour faciliter la procédure de la dissection. - Brièvement rincer le œil-ensemble dans une boîte de Pétri remplie de stérile solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
- Transférer le œil dans un tube de 2 mL contenant 1,5 mL de solution de formaline tamponnée de 4 %.
- Fixez l’oeil pendant 6 h à température ambiante.
NOTE : Fixation confère la rigidité du tissu et facilite la dissection de l’iris. Temps de fixation doit être testé et réglé pour différentes applications.
6. Iris Dissection procédure sous stéréoscope
- Enlever la solution de fixation du tube avec une pipette Pasteur en plastique de 1,5 mL (ou similaire) et bien rincer l’oeil trois fois avec du PBS frais.
- Placer le œil fixe dans une surface lisse et sèche (stand de dissection) avec la chambre antérieure vers le haut.
- Avec une aiguille de 30 G biseauté, effectuer un point d’entrée le limbus postérieur.
- Maintenant le segment antérieur d’égalisateur de petites pinces, insérer une astuce de Vannas Clayman ciseaux droites dans l’ouverture créée précédemment.
Remarque : Il est recommandé de contrôler la pince avec la main non dominante et le ciseaux avec la dominante. - Pendant la rotation de le œil avec la pince à lier, couper autour du limbe pour supprimer le segment postérieur de l’oeil.
NOTE : Des coupes partielles permettra l’extrémité intérieure de la paire de ciseaux pour continuer dans les tissus et grandement facilite le processus. - Positionner le segment antérieur vers le bas, exposant la lentille.
- Retirez soigneusement la lentille il saisissant avec une petite pince et tirez vers le haut.
Remarque : Une aiguille biseautée peut être utilisée pour perforer et tirez la lentille. - Positionner le segment antérieur avec la cornée vers le bas et la coupe perpendiculaire au champ de vision.
- Saisir délicatement le tissu postérieur au corps ciliaire avec les petites pinces égalisateur.
- Avec des ciseaux droites Vannas Clayman, procéder pour couper juste en avant du corps ciliaire pour enlever le réseau trabéculaire et isoler l’iris. Confirmer que le réseau trabéculaire est supprimé ; l’iris doit se déplacer au sein de la cornée.
- Transvaser avec soin le œilleton antérieur avec les petites pinces égalisateur, tenant de la cornée, d’une plaque à 96 puits contenant 200 µL de PBS.
- Continuez à tenir la cornée dans le puits et disséquer l’iris en la rinçant avec du PBS avec une pipette.
Remarque : Si l’iris reste fidèle à la cornée, certains trabéculaire peut être présent et le biseau d’une aiguille 30 G peut servir à aider à déplacer l’iris. - Retirez le 96 puits avec les petites pinces liant la cornée et garder l’iris isolé dans le puits pour une analyse plus approfondie.
- Conserver les échantillons d’iris flottant à 4 ° C.
Remarque : Malgré étant fixée, stockage à long terme des échantillons flottant d’iris n’est pas recommandé.
7. possibles afficheurs expérimentales
- Afin de visualiser les vaisseaux sanguins dans l’iris disséqués, utilisez flottant entier-Montez immunohistochemistry souillant des méthodes pour marqueurs tels que la molécule d’adhérence des cellules endothéliales plaquettaire (PECAM) -1 ou isolectine B4. Également utiliser la perfusion de tout le corps avec une coloration vasculaire, comme les dextranes fluorescent-étiquetées de haut poids moléculaire.
- In vivo des images non invasive permet d’effectuer en silico plat-montage et quantifier la vascularisation iris complet avec un logiciel d’imagerie approprié.
Remarque : Le système vasculaire peut être quantifié, aussi bien in vivo et in vitro, à l’aide de densitométrie ou avec le système vasculaire du logiciel analyse9. - Traiter le œil entier pour les acides nucléiques et extraction de la protéine, suivie par les méthodes PCR ou immunoblotting, pour effectuer l’analyse moléculaire des yeux crevés.
NOTE : L’analyse moléculaire des tissus est préférable d’effectuer avec les tissus non fixée, mais dissection des iris non fixée est extrêmement difficile, et l’utilisation de l’oeil entier a rendu des résultats statistiquement significatifs dans les précédentes études8.
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Representative Results
Albino BALB/c souriceaux à P12.5 ont été soumis aux crevaisons uvées, répétées chaque jour quatrième (experimental jour 0, 4, 8, 12), jusqu’au P24.5. À P27.5, les souris ont été euthanasiés et IRIS soigneusement disséqué (experimental jour 15). Photos des yeux de souris ont été prises avec une caméra attachée à un stéréoscope chirurgical avant chaque série de ponction dans chaque jour expérimentale pour évaluer l’évaluation non invasive de la réponse vasculaire de l’iris. Ponctions uvées induisent une réponse vasculaire de l’iris en déclenchant la cicatrisation du système (Figure 1). En raison de la transparence de la cornée et de la souris BALB/c déficients en mélanine, système vasculaire accrue iris est facilement visible de jour expérimental 4 (P16.5) et s’intensifie pendant toute la durée du protocole. Images d’immunohistochimie pour PECAM-1 indiquent une augmentation globale système vasculaire dans l’iris des yeux crevés par rapport aux témoins (Figure 2).
Figure 1 : surveillance non invasive de l’angiogenèse induite par ponction iris. Images représentatives du jour 0, 4, 8, 12 et 15 de contrôle et les yeux crevés. La réponse vasculaire Iris ressort du jour 4, dans les yeux crevés. Echelle = 1 mm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : réponse vasculaire Iris induite par ponction yeux. Images d’illustration du PECAM-1 coloration de le 15 Iris jour, affiché sous la forme pleine vue et amplifiée zone (carré), de contrôle et crevé les yeux. Echelle = 400 µm (en haut) ; 200 µm (en bas). Note de l’augmentation des branches vasculaires dans IRIS percés. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Dans le présent protocole, une nouvelle méthode pour l’induction de la réponse vasculaire iris par ponction uvée est présentée. La piqûre déclenche les mécanismes de guérison de blessure et favorise des réponses vasculaires dans l’iris10,11. C’est en accord avec les pathologies oculaires, tels que le PDR et les lunettes de vision nocturne, où réponses angiogénique exacerbée de la rétine dans le segment postérieur de le œil son point culminant dans l’état clinique de rubeosis iridis, une vascularisation accrue de l’iris12 ,,13.
La cornée est avasculaire et possède une structure particulière de collagène résultant en transparence. Dans cette optique, l’angiographie du segment antérieur de le œil pour la visualisation du système vasculaire iris est réalisable par visualisation directe des vaisseaux sanguins iris avec in vivo des méthodes non invasives13,14. Modèles précédents de la néovascularisation iris s’est appuyé sur des animaux aux grands yeux où des interventions chirurgicales complexes ont été effectué15,16,17, ou par l’injection intraoculaire de substances spécifiques angiogénique 18 , 19. dans cette méthode, l’utilisation de souris BALB/c carencées en pigment permet l’observation directe de l’iris vascularisation in vivoet permet une quantification non invasive de la néovascularisation iris chez la souris, fournissant ainsi un nouvel outil pour étudier la in vivo l’angiogenèse.
En outre, la méthode présentée pour une dissection souris iris permet l’analyse de la néovascularisation iris induite par la ponction avec des marqueurs spécifiques vasculaires. Ici, iris navires ont été exemple colorées avec les anticorps PECAM-1 et visualisées par microscopie à fluorescence. Immunomarquage flottant, entier-montent des protocoles sont facilement obtenus et assez régulières. En outre, les méthodes de perfusion pour les vaisseaux sanguins peuvent être effectuées dans ce modèle. Coloration spécifique vasculaire accorde évaluation de la structure des vaisseaux sanguins d’iris et donc la quantification, par axée sur l’utilisateur ou des logiciels d’analyse, de l’iris neovasculature9. Comme décrit précédemment8,20, l’illustration du neovasculature de l’iris a été évaluée au jour 15 après-puncture-induction. Néanmoins, les effets sur la vascularisation de l’iris peuvent être observées dès le jour 4 post-puncture-induction, ce qui suggère qu’évaluation du modèle iris induite par ponction néovascularisation pourrait effectuer à différents moments, basés sur la propre conditions expérimentales.
Il convient de préciser que ce protocole présente certaines difficultés, notamment liées à la taille d’un yeux de souris par rapport à d’autres modèles animaux. Doit être très prudent lors de l’exécution de la procédure de ponction uvée, pour éviter les touches de la lentille ou d’endommager le œil. Observation de l’État oculaire est paramount et les animaux présentant des cataractes liées à expérimental ou chute de pression oculaire devrait être exclus et euthanasié de manière appropriée. Iris de souris sont extrêmement fragiles et un peu collante. Bonne dissection et l’isolement du tissu présente une autre étape cruciale pour le protocole. Une bonne séparation d'avec le trabéculum est nécessaire pour le déplacement de l’iris de la chambre antérieure. En outre, en raison de la fragilité, l’isolement iris nécessite la fixation du tissu, qui altère l’analyse moléculaire en aval. Cependant, une analyse moléculaire d’interprétation ensemble-œil a été appliquée avec succès à la méthode présentée8.
En résumé, le protocole décrit présente un modèle de souris de néovascularisation de nouveaux iris induite par la ponction. Ce modèle a l’avantage de permettre en vivo non invasive visualisation directe de l’angiogenèse. En outre, l’utilisation de petits rongeurs rend le modèle présenté attrayant pour les études de rubeosis iridis, car il évite l’utilisation d’animaux aux grands yeux et accompagné de restriction éthique. En outre, la procédure peut être associée à l’injection de substances pro - ou anti-angiogéniques par la ponction auto-obturant, améliorer son utilité comme un nouveau modèle de in vivo de l’angiogenèse.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs remercient Linnea Tankred et Diana Rydholm pour l’élevage.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bonn eye scissors | Bausch & Lomb | 23060 | |
| Clayman-Vannas curved scissors | Bausch & Lomb | E3383 C | |
| Clayman-Vannas straight scissors | Bausch & Lomb | E3383 S | |
| Objective adapter for camera | Handcrafted | N/A | Or any system that allows adapting a camera to the microscope |
| Heating Pad 100-110 watts | Non Applicable | N/A | Available in pet/veterinarian stores |
| Hypodermic 30g beveled needle | KDM GmBH germany | 911914 | |
| Iphone 4S | Apple | Non Applicable | Or other high resolution image acquistion device |
| Isoflurane | Baxter | KDG 9623 | |
| McPherson tying forceps | Bausch & Lomb | E1815 S | |
| Micro tying forceps | Bausch & Lomb | 63140 | |
| Minims tetracaine hydrochloride | Bausch & Lomb | N/A | 1 % (w/v) Eye Drops |
| Neutral-buffered formalin | Bioreagens | 0018-40 | |
| Normal saline solution | Fresenius Kabi | 210352 | 0.9 % (w/v) NaCl in injectable water |
| Phosphate-buffered saline | ThermoFisher Scientific | 10010023 | Balanced and buffered PBS pH 7.4 |
| Petri dish 10 cm | Starstedt | 83.3902 | |
| Petri dish 3 cm | Starstedt | 83.3900 | |
| Safe Seal Tube 2.0 mL | Starstedt | 72.685.200 | Or any eppendorf style tubes |
| TC plate 96-well | Starstedt | 83.3924 | |
| Transfer pipette 3.5 mL | Starstedt | 86.1171 | Or any other Pasteur pipette style |
| Univentor 400 anesthesia unit | Univentor Limited | N/A | Or equivalent flow regulator with induction chamber and mask for volatile anesthesia |
| Wild M650 surgical microscope | Wild Heerbrugg | N/A | Or other surgical or magnifying stereoscope |
References
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