מודל לולאת המעי מחוברים בעופות חינם ומורדמת פתוגן מסוים ללמוד החיידק Clostridium התקפה אלימה
Summary
כאן אנו מציגים פרוטוקול ליצירת בניתוח ‘לולאות מעיים מחוברים’ בהמעי הדק עוף. הליך זה מאפשר ההשוואה של מספר זנים של החיידק Clostridium התקפה אלימה בחיי עיר שורה בודדת. שיטה זו פוחתת במידה ניכרת את מספר התרנגולות ההכרחיות בדרך כלל לצורך ניסויים דומים ויוו .
Abstract
דלקת מעיים נמק נחקרה תרנגולות באמצעות ויוו זיהום מודלים שונים. רוב אלה להשתמש בשילוב של גורמים נטייה, כגון כגון ותזונה, עם gavage או באמצעות ההזנה באמצעות החיידק Clostridium. דגמים אלה, השוואת מספר זני החיידק ללימודי התקפה אלימה דורש מספר רב של מחשבים מארחים עד להשגת תוצאות משמעותיות. התמותה במהלך המחקר יכול להיות גבוה בהתאם לדגם ניסיוני, ומכאן העלאת חששות אתיים בנוגע רווחת בעלי חיים במחקר. הפיתוח של הדגמים החדשים של זיהום, הדורשים פחות חיות ללמוד פתוגנזה, טרם מתן תוצאות משמעותיות מבחינה סטטיסטית וחוקית, חשוב להפחית את השימוש בבעלי חיים במחקר. לולאת המעי מחוברים מודלים שימשו ללמוד זיהומים clostridial מינים שונים כגון עכברים, ארנבים, עגלים. בעקבות ניתוחים ליצירת לולאה מחוברים מקטעי, זני החיידק הם מוזרק ישירות לתוך לולאות להקים במגע ישיר בין החיידק לבין רירית המעי. דוגמאות המעי הדק ותוכנו luminal נלקחים על הפסקת ההליכים אחרי כמה שעות. מספר זני חיידקים יכולים לקבל חיסון בכל בעל חיים, ומכאן הקטנת מספר הנושאים הנדרשים בניסויים. בנוסף, נהלים מבוצעים בהרדמה כללית כדי להפחית כאב בבעלי חיים. בעופות, מודל זה יהיה מתאים יותר מאשר ניהול דרך הפה כדי להשוות בין החיידק זן פתוגניות כי בעלי חיים פחות נחוצים ללא גורמי predisposing נדרשים כדי לגרום למחלה, כאב נשלטת על ידי משככי כאבים . המודל לולאת המעי מחוברים מתואר בצורה גרועה בעופות, תקינה חיונית עבור השימוש האופטימלי. כתב יד זה מספק את כל הצעדים הדרושים כדי ליצור לולאות מחוברים מעיים רבים בעופות ומביא מידע על נקודות קריטי כדי להשיג תוצאות בתוקף.
Introduction
השימוש במודלים לחקר מחלות זיהומיות להשפיע על בני האדם ובעלי החיים הוא כלי מרכזי בהערכת הגורמים התקפה אלימה ויסות בפתוגנזה של תנאי ספציפי כמו גם באשר לפרט אסטרטגיות כדי למנוע או לרפא מחלות1. למרות יתרונות רבים לשימוש בבעלי חיים כדי ללמוד מחלות שונות, חופרים אתית חששות לגבי המנהג. חוקרים צריך למזער את השימוש בבעלי חיים בעת השגת תוצאות משמעותיות וחוקית. הרעיון של ר’ 3 העקרונות (החלף, הקטן, מקד) היה פירט כדי להבטיח רווחה סוגיות נדונו בניסויים כאלה. במחקרים דלקת מעיים נמק עוף, ויוו עוף מודלים משמשים כדי לחקור את אטיולוגיה, מניעת וטיפולים זה תנאי2,3,4,5. פתוגניים זנים של החיידק נושאת גורמים התקפה אלימה ספציפיים, כגון הרעלן NetB6, מנוהלים כדי לגרום דלקת מעיים נמק של תרנגולות7. העיקרון החלפת הוא, לכן, קשה לתפיסה ולהשגה במקרה כזה כמו אלה הגורמים התקפה אלימה לא יכול להיות קריטי של מיני בעלי חיים אחרים. רוב הדגמים עבור דלקת מעיים נמק בעופות להשתמש בשילוב של גורמי סיכון, כגון כגון ושינינו דיאטה כדי לגרום דלקת מעיים נמק ואחריו gavage של תרבות מרק המכיל מספר גדול של החיידק2. מודלים אלה יגרום למחלה במספר רב של עופות, תמותה יכול להיות חשוב כזה ניסויים8, וליחסיו חששות לגבי העקרונות הפחתת ועידון מחקר בבעלי חיים.
לולאות מעיים מחוברים הן חלופה רצויה לחקר מחלות הנגרמת על ידי פתוגנים במעיים ביחס עיקרון הפחתת ולאחר עידון. מודלים אלה, מקטעי מעיים שנקרא “לולאות” נוצרים על-ידי הצבת ליגטורות לאורך צינור העיכול כדי ליצור תאים עצמאית, הרמטי איפה פתוגנים יכול להיות מוזרק לבד9 או עם מולקולות אחרות, כגון חיסון מועמדים 10 , 11. פתוגנים עניין ממוקמים קשר הדוק עם תאי המעי, אחרי כמה שעות של זמן זיהום, דגימות מעיים ניתן לשחזר לצורך ניתוח נוסף. זה מאפשר את השימוש במספר קבוצות שליטה וטיפול של אותה חיה. ניתן לבצע ניתוח סטטיסטי עם דגמים מידות החוזרות ונשנות, אשר מגדילה את כוחו של אפליה בין קבוצות, מקטין את מספר תרנגולות הכרחי בהשוואה gavage אוראלי ניסויים. כמו כן, ניתוחים ושעות זיהום לאחר מכן מבוצעים תחת הרדמה כללית רציפה, שיכוך כאבים, ומכאן הקטנת הכאב בעלי חיים. לולאה סגורה ligations הם תבנית אידיאלית עבור הפחתת מספרים מארח ויצירת מערכת אנושית יותר מחקר בבעלי חיים.
לולאות מעיים מחוברים מודלים היטיב לתאר במינים שונים, כגון עגלים, שפנים, עכברים2,9, אך גרוע שמתואר תרנגולות7. לשימוש מיטבי של מודל ניתוח זה, טכניקה נכונה וביצוע חיוניים ליצירת מחוברים לולאות מעיים כדי למנוע נזקים את השלמות מעיים. המטרה של כתב יד זה היא לתאר את שיטת צעד אחר צעד ליצירת של מספר לולאות מעיים במודל של עוף. טכניקה זו הוא מוגבל על ידי מיומנותו וניסיונו של המנתח, כמו נהלים מדויקים חיוניים להצלחת הפרויקט.
Protocol
Representative Results
Discussion
לולאות מעיים מודלים תוארו במינים רבים ללמוד פתוגן-פונדקאי אינטראקציה, בפתוגנזה של מחלות הנגרמות על ידי פתוגנים מעיים שונות, כגון החיידק Clostridium, Clostridium difficile , סלמונלה enterica7,9,13,14,15. הוא גם …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי הכיסא במחקר עופות (Boulianne מ’) מן הפקולטה לרפואה וטרינרית של דה מאוניברסיטת מונטריאול. ד”ר Boulianne, האב פיתח את המודל. ד”ר Boulianne, האב לבצע את הניתוחים. ד ר ברנס סייע בפיתוח פרוטוקול הרדמה. ד ר הורה לערוך הוידאו וכתב את כתב היד. Drs ברנס, Desrochers ו- Boulianne לערוך את כתב היד.
Materials
| EZ-Scrub 747 | Becton Dickinson and Company | 4% chlorhexidine gluconate detergent impregnated sterile brush. No catalog number available. Web address: https://www.bd.com/en-us/offerings/capabilities/infection-prevention/surgical-hand-scrubs/ez-scrub-preoperative-surgical-scrub-brushes | |
| Isopropyl alcohol 70% USP 4 L | Commercial isopropyl alcohol | P016IP70 | Web address: http://www.comalc.com/products/ |
| Chlorexidine | Sigma-Aldrich | 282227-1G | Chlorhexidine gluconate solution, must be diluted to 4%. Web address: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/282227?lang=fr®ion=CA&gclid=EAIaIQobChMI8vHr4_OY1wIV3rrACh2ZWQKuEAAYAiAAEgLKx_D_BwE |
| Surgical Drape Small (27 inch x 24 inch) with 3 x 6 inch Fenestration | Veterinary Specialty Products | 32724 | Web address: http://www.vetspecialtyproducts.com/index.cfm?fuseaction=ecommercecatalog.detail&productgroup_id=15 |
| Scalpel blades #3 | Swann-Morton | 301 | Web address: https://www.swann-morton.com/product/16.php |
| Sterile saline NaCl 0.9% | Sigma-Aldrich | S8776-100ML | Web address: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s8776?lang=fr®ion=CA |
| Vicryl 3-0 | Ethicon | D9003 | Polyglactin multifilament absorbable suture material. Web address: http://www.ethicon.com/healthcare-professionals/products/wound-closure/absorbable-sutures/coated-vicryl-polyglactin-910-suture |
| Syringe 1 ml with 26G needle | Becton Dickinson and Company | 329652 | Web address: https://www.bd.com/en-us/offerings/capabilities/diabetes-care/insulin-syringes/bd-1-ml-conventional-insulin-syringes |
| Brain Heart Infusion | Sigma-Aldrich | 1104930500 | Web address: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/mm/110493?lang=fr®ion=CA&cm_sp=Insite-_-prodRecCold_xorders-_-prodRecCold2-1 |
| Eppendorf tube | Sigma-Aldrich | T9661-500EA | Microcentrifuge tube. Web address: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t9661?lang=fr®ion=CA&gclid=EAIaIQobChMI-YizzfiY1wIVRkCGCh30SQjuEAAYAiAAEgLK5fD_BwE |
| Formalin solution, buffered neutral, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128-4L | Ratio tissue : formalin of 1: 10 for adequate fixation. Web address: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/ht501128?lang=fr®ion=CA |
| Clostridium perfringens strains | Université de Montréal, Chaire en recherche avicole | N/A | Specific to each laboratory, available upon request to correspondant author |
References
- Vitale, A., Chiarotti, F., Alleva, E. The use of animal models in disease research. Rare diseases and orphan drugs. 2 (1), 1-4 (2015).
- Uzal, F. A., et al. Animal models to study the pathogenesis of human and animal Clostridium perfringens infections. Veterinary Microbiology. , (2015).
- Bernier, G., Phaneuf, J. B., Filion, R. Necrotic enteritis in broiler chickens. III. Study of the factors favoring the multiplication of Clostridium perfringens and the experimental transmission of the disease. Canadian Journal of Comparative Medicine. 41 (1), 112-116 (1977).
- Al-Sheikhly, F., Truscott, R. B. The pathology of necrotic enteritis of chickens following infusion of broth cultures of Clostridium perfringens into the duodenum. Avian Diseases. 21 (2), 230-240 (1977).
- Wicker, D. L., Iscrigg, W. N., Trammell, J. H. The control and prevention of necrotic enteritis in broilers with zinc bacitracin. Poultry Science. 56 (4), 1229-1231 (1977).
- Keyburn, A. L., et al. NetB, a new toxin that is associated with avian necrotic enteritis caused by Clostridium perfringens. PLoS Pathog. 4 (2), e26 (2008).
- Timbermont, L., et al. Origin of Clostridium perfringens isolates determines the ability to induce necrotic enteritis in broilers. Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 32 (6), 503-512 (2009).
- Paradis, M. A., et al. Efficacy of avilamycin for the prevention of necrotic enteritis caused by a pathogenic strain of Clostridium perfringens in broiler chickens. Avian Pathol. 45 (3), 365-369 (2016).
- Valgaeren, B., et al. Lesion development in a new intestinal loop model indicates the involvement of a shared Clostridium perfringens virulence factor in haemorrhagic enteritis in calves. Journal of Comparative Pathology. 149 (1), 103-112 (2013).
- Goossens, E., et al. The C-terminal domain of Clostridium perfringens alpha toxin as a vaccine candidate against bovine necrohemorrhagic enteritis. Vet Res. 47 (1), 52 (2016).
- Goossens, E., et al. Toxin-neutralizing antibodies protect against Clostridium perfringens-induced necrosis in an intestinal loop model for bovine necrohemorrhagic enteritis. BMC Vet Res. 12 (1), 101 (2016).
- Parent, E., Archambault, M., Charlebois, A., Bernier-Lachance, J., Boulianne, M. A chicken intestinal ligated loop model to study the virulence of Clostridium perfringens isolates recovered from antibiotic-free chicken flocks. Avian Pathol. 46 (2), 138-149 (2017).
- Janvilisri, T., et al. Temporal differential proteomes of Clostridium difficile in the pig ileal-ligated loop model. PLoS One. 7 (9), e45608 (2012).
- Aabo, S., et al. Development of an in vivo model for study of intestinal invasion by Salmonella enterica in chickens. Infection and Immunity. 68 (12), 7122-7125 (2000).
- Meurens, F., et al. Early immune response following Salmonella enterica subspecies enterica serovar Typhimurium infection in porcine jejunal gut loops. Vet Res. 40 (1), 5 (2009).
- Gerdts, V., et al. Multiple intestinal ‘loops’ provide an in vivo model to analyse multiple mucosal immune responses. J Immunol Methods. 256 (1-2), 19-33 (2001).
- Wade, B., et al. The adherent abilities of Clostridium perfringens strains are critical for the pathogenesis of avian necrotic enteritis. Vet Microbiol. 197, 53-61 (2016).
- Cooper, K. K., et al. Virulence for chickens of Clostridium perfringens isolated from poultry and other sources. Anaerobe. 16 (3), 289-292 (2010).
- Cooper, K. K., Songer, J. G. Virulence of Clostridium perfringens in an experimental model of poultry necrotic enteritis. Veterinary Microbiology. 142 (3-4), 323-328 (2010).
- Chalmers, G., Bruce, H. L., Toole, D. L., Barnum, D. A., Boerlin, P. Necrotic enteritis potential in a model system using Clostridium perfringens isolated from field outbreaks. Avian Diseases. 51 (4), 834-839 (2007).
