Um modelo de alça Intestinal ligados em galinhas livres anestesiados patógeno específico para estudar a virulência de Clostridium Perfringens
Summary
Aqui nós apresentamos um protocolo para criar cirurgicamente ‘intestinais laços ligados’ no intestino de frango. Este procedimento permite a comparação de virulência em situ em um único host vários as estirpes Clostridium perfringens . Esse método marcadamente diminui o número de galinhas geralmente necessários para experimentos semelhantes na vivo .
Abstract
Enterite necrótica foi estudada em galinhas usando várias em vivo modelos de infecção. A maioria destes usa uma combinação de fatores predisponentes, tais como a dieta e coccidiose com gavagem ou administração através do feed usando o Clostridium perfringens. Nestes modelos, a comparação de várias cepas de c. perfringens para estudos de virulência requer um grande número de hosts para obter resultados significativos. Mortalidade no decorrer do estudo pode ser alta dependendo do modelo experimental, portanto, levantando preocupações éticas relativas ao bem-estar dos animal na pesquisa. O desenvolvimento de novos modelos de infecção, exigindo menos animais para estudar a patogênese, ainda, fornecer resultados estatisticamente significativos e válidos, é importante na redução do uso de animais em pesquisa. Modelos de alça intestinal ligados têm sido usados para estudar clostridial infecções em várias espécies, como ratos, coelhos e bezerros. Na sequência de procedimentos cirúrgicos para criar segmentos de laço ligados, cepas de c. perfringens são injetadas diretamente dos loops para estabelecer um contato próximo entre as bactérias e a mucosa intestinal. São retiradas amostras de intestino delgado e conteúdo luminal a finalização dos procedimentos, depois de algumas horas. Várias estirpes bacterianas podem ser inoculadas em cada animal, portanto, reduzindo o número de sujeitos necessários nos experimentos. Também, os procedimentos são realizados sob anestesia geral para reduzir a dor do animal. Em galinhas, esse modelo seria mais adequado que a administração oral para comparar a patogenicidade de cepa de c. perfringens , porque menos animais são necessários, sem fatores predisponentes são necessárias para induzir a doença e dor é controlada por analgésicos . O modelo de alça intestinal ligados é mal descrito em galinhas e padronização é essencial para optimizar a sua utilização. Este manuscrito fornece todos os passos necessários para criar inúmeros laços ligados intestinais em frangos e traz informações sobre os pontos críticos para obter resultados válidos.
Introduction
O uso de modelos animais para estudo de doenças infecciosas que afetam os seres humanos e animais é uma ferramenta central na avaliação de fatores de virulência, regulando a patogênese de uma condição específica, bem como para elaborar estratégias para prevenir ou curar doenças1. Apesar das inúmeras vantagens do uso de modelos animais para o estudo de várias doenças, estão surgindo preocupações éticas em relação a esta prática. Os pesquisadores precisam minimizar o uso de animais durante a obtenção de resultados significativos e válidos. O conceito dos 3 princípios Rs (Replace, Reduce e Refine) foi elaborado para garantir que o bem-estar questões foram tratadas em tais ensaios. Em estudos de enterite necrótica do frango, na vivo modelos de galinha são usados para investigar a etiologia, prevenção e tratamentos desta condição2,3,4,5. Cepas patogênicas de c. perfringens carregando fatores de virulência específicos, tais como a toxina NetB6, são administradas para causar enterite necrótica em galinhas7. O princípio de substituição é, portanto, difícil de conseguir neste caso como estes fatores de virulência podem não ser tão críticos em outras espécies animais. A maioria dos modelos para enterite necrótica em galinhas usam uma combinação de fatores de risco, tais como coccidiose e alteraram a dieta para induzir a enterite necrótica, seguido por gavagem do caldo de cultura que contém um grande número de c. perfringens2. Estes modelos irão induzir a doença em um grande número de galinhas, e a mortalidade pode ser importante em tais ensaios8, assim, levantando preocupações sobre os princípios de redução e refinamento em pesquisas com animais.
Modelos de laços ligados intestinal são uma alternativa desejável para o estudo de doenças induzidas por patógenos intestinais em relação à redução de princípio e refinamento. Nestes modelos, chamados ‘loops’ de segmentos intestinais são criados colocando ligaduras ao longo do trato intestinal formando compartimentos independentes e herméticos onde patógenos podem ser injetados sozinho9 ou com outras moléculas, tais como candidatos vacinais 10 , 11. os patógenos de interesse são colocados em contato com as células intestinais, e após algumas horas de tempo de infecção, amostras intestinais podem ser recuperadas para posterior análise. Isto permite o uso de múltiplos grupos tratamento e controle no mesmo animal. Análise estatística pode ser realizada com modelos de medidas repetidas, o que aumenta o poder de discriminação entre grupos e reduz o número de galinhas necessárias em relação aos testes de gavagem oral. Além disso, procedimentos cirúrgicos e subsequente infecção vezes são realizadas sob anestesia geral contínua e analgesia, portanto, minimizando a dor animal. Câmara de circuito fechado é um modelo ideal para reduzir o números de hosts e criando um sistema mais humano em pesquisas com animais.
Modelos de laços ligados intestinal são bem descritos em várias espécies, tais como vacas, coelhos e ratos2,9, mas mal descritos em galinhas7. Para uma utilização óptima deste modelo cirúrgico, execução e técnica adequada são essenciais para a criação de loops intestinais ligados para evitar danos à integridade intestinal. O objetivo deste manuscrito é descrever um método passo a passo na criação de vários loops intestinais em um modelo de frango. Esta técnica é limitada pela habilidade e experiência do cirurgião, como procedimentos precisos são essenciais para o sucesso do projeto.
Protocol
Representative Results
Discussion
Modelos de laços intestinal têm sido descritos em inúmeras espécies para estudar a interação patógeno-hospedeiro e patogénese das doenças causadas por vários patógenos intestinais, tais como o Clostridium perfringens, Clostridium difficile e Salmonella typhi7,9,13,14,15. Também tem sido usado para analisar as mucosas resp…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pela cadeira na pesquisa de aves de capoeira (M. Boulianne) da faculdade de medicina veterinária da Université de Montréal. Os Drs Boulianne e pai desenvolveram o modelo. Boulianne DRS e pai fez as cirurgias. Dr. Burns auxiliou no desenvolvimento do protocolo de anestesia. Dr. Parent o vídeo editado e escreveu o manuscrito. DRS Burns, Desrochers e Boulianne editado o manuscrito.
Materials
| EZ-Scrub 747 | Becton Dickinson and Company | 4% chlorhexidine gluconate detergent impregnated sterile brush. No catalog number available. Web address: https://www.bd.com/en-us/offerings/capabilities/infection-prevention/surgical-hand-scrubs/ez-scrub-preoperative-surgical-scrub-brushes | |
| Isopropyl alcohol 70% USP 4 L | Commercial isopropyl alcohol | P016IP70 | Web address: http://www.comalc.com/products/ |
| Chlorexidine | Sigma-Aldrich | 282227-1G | Chlorhexidine gluconate solution, must be diluted to 4%. Web address: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/282227?lang=fr®ion=CA&gclid=EAIaIQobChMI8vHr4_OY1wIV3rrACh2ZWQKuEAAYAiAAEgLKx_D_BwE |
| Surgical Drape Small (27 inch x 24 inch) with 3 x 6 inch Fenestration | Veterinary Specialty Products | 32724 | Web address: http://www.vetspecialtyproducts.com/index.cfm?fuseaction=ecommercecatalog.detail&productgroup_id=15 |
| Scalpel blades #3 | Swann-Morton | 301 | Web address: https://www.swann-morton.com/product/16.php |
| Sterile saline NaCl 0.9% | Sigma-Aldrich | S8776-100ML | Web address: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s8776?lang=fr®ion=CA |
| Vicryl 3-0 | Ethicon | D9003 | Polyglactin multifilament absorbable suture material. Web address: http://www.ethicon.com/healthcare-professionals/products/wound-closure/absorbable-sutures/coated-vicryl-polyglactin-910-suture |
| Syringe 1 ml with 26G needle | Becton Dickinson and Company | 329652 | Web address: https://www.bd.com/en-us/offerings/capabilities/diabetes-care/insulin-syringes/bd-1-ml-conventional-insulin-syringes |
| Brain Heart Infusion | Sigma-Aldrich | 1104930500 | Web address: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/mm/110493?lang=fr®ion=CA&cm_sp=Insite-_-prodRecCold_xorders-_-prodRecCold2-1 |
| Eppendorf tube | Sigma-Aldrich | T9661-500EA | Microcentrifuge tube. Web address: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t9661?lang=fr®ion=CA&gclid=EAIaIQobChMI-YizzfiY1wIVRkCGCh30SQjuEAAYAiAAEgLK5fD_BwE |
| Formalin solution, buffered neutral, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128-4L | Ratio tissue : formalin of 1: 10 for adequate fixation. Web address: http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/ht501128?lang=fr®ion=CA |
| Clostridium perfringens strains | Université de Montréal, Chaire en recherche avicole | N/A | Specific to each laboratory, available upon request to correspondant author |
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