JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Materials
References
Traduction automatique
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologie

ليزر التقاط ميكروديسيكشن من ميشوورك ترابيكولار نقية جداً من عيون الماوس لتحليل التعبير الجيني

Published: June 03, 2018
doi:
10.3791/57576
, , , , , , ,
1Immunity, Inflammation, and Disease Laboratory, Division of Intramural Research,National Institute of Environmental Health Sciences, NIH, 2Cellular and Molecular Pathology Branch, Division of the National Toxicology Program,National Institute of Environmental Health Sciences, NIH, 3Integrated Laboratory Systems Inc., 4Experimental Pathology Laboratories Inc.

Summary

هنا، نحن وصف بروتوكول ميكروديسيكشن التقاط ليزر استنساخه (LCM) لعزل trabecular ميشوورك (TM) لتحليل الحمض النووي الريبي المتلقين للمعلومات. القدرة على تحليل التغيرات في التعبير الجيني في TM سوف تساعد في فهم الآليات الجزيئية الكامنة لأمراض العين المتعلقة بالخرائط المواضيعية.

Abstract

ليزر التقاط ميكروديسيكشن (LCM) يسمح بتحليل التعبير الجيني للخلايا المفردة وأثرى السكان خلية في أقسام الأنسجة. LCM أداة عظيمة لدراسة الآليات الجزيئية الكامنة وراء تمايز الخلايا والتنمية والتقدم لمختلف الأمراض، بما في ذلك المياه الزرقاء. الزرق، التي تضم أسرة من اعتلالات الأعصاب البصرية التدريجي، السبب الأكثر شيوعاً للعمى لا رجعة فيها في جميع أنحاء العالم. يمكن أن يؤدي زيادة الضغط داخل مقلة العين (IOP)، وعامل خطر رئيسي لتطوير الزرق التغييرات الهيكلية والأضرار داخل ميشوورك ترابيكولار (TM). ومع ذلك، هي لا تزال غير مفهومة الآليات الجزيئية الدقيقة التي تشارك. القدرة على إجراء تحليل التعبير الجيني سيكون حاسما في الحصول على المزيد من رؤى في وظيفة هذه الخلايا ودورها في تنظيم التنمية IOP والزرق. لتحقيق هذا الهدف، إثراء أسلوب استنساخه لعزل عالية TM من المقاطع المجمدة عيون الماوس وطريقة لتحليل التعبير الجيني المتلقين للمعلومات، مثل كما هو مطلوب RT-قبكر وتسلسل الحمض النووي الريبي. تم تطوير الطريقة الموضحة هنا لعزل TM نقية جداً من عيون الماوس PCR المتلقين للمعلومات الرقمية وتحليل ميكرواري. وبالإضافة إلى ذلك، هذا الأسلوب يمكن تكييفها بسهولة لعزل خلايا العين التخصيب والمقصورات الخلية التي كان من الصعب على عزل من عيون الماوس الأخرى. أن الجمع بين التحليل LCM والجيش الملكي النيبالي يمكن أن تسهم في فهم أكثر شمولاً للأحداث الخلوية الكامنة وراء الزرق.

Introduction

الزرق هو مجموعة من الأمراض التي تتميز باعتلال الأعصاب البصرية واعتلال الشبكية الذي يؤدي في النهاية إلى العمى لا رجعة فيه1،2. ومن المقدر أن يعيش قبل عام 2020 ما يزيد على 70 مليون شخص في جميع أنحاء العالم مع بعض أشكال المرض3،4،5،،من67. زاوية مفتوحة الابتدائي الزرق (باغ)، النوع الأكثر شيوعاً من الزرق، تتميز بانخفاض في التدفق المائي الفكاهة (AH) مما يؤدي إلى زيادة الضغط داخل مقلة العين (IOP)8،،من910، 11،13،،من121415،3،16،،من1718. غادر IOP غير المعالجة، وارتفاع مزمن يؤدي إلى الضرر التدريجي والذي لا رجعة فيه للشبكية والعصب البصري رئيس تسبب العمى شعاعي،1،2،19. جميع الأساليب الحالية لتباطؤ التقدم من الزرق التركيز على تخفيف IOP، أما عن طريق خفض معدل إنتاج AH بالجسم الهدبي أو تعزيز أنها تدفق1،،من89، 10 , 11 , 12 , 13 , 14-ميشوورك ترابيكولار (TM) يلعب دوراً حيويا في تنظيم نشاط في مسار تدفق آه الأولية ووظيفتها غير السليمة أحد عوامل مسببة لفرط ضغط الدم الزرق1،2،19. ومع ذلك، الآليات الجزيئية المرتبطة بخلل TM وكيف ينظم آه الصرف ليست بعد تماما مفهومة وحاليا محورا أساسيا الزرق البحوث1،2،19، 20-في حين ربطت العديد من الدراسات على نطاق الجينوم جمعية (جوس) عددا من الجينات الزرق، وزيادة المقاومة لمرفق تدفق آه في TM، الآليات الجزيئية الدقيقة التي تؤدي إلى المرض لم يفهم بعد تماما21 , 22 , 23 , 24 , 25.

نماذج حيوانية عززت إلى حد كبير معارفنا الحالية من تطور المرض في الزرق (استعراض على نطاق واسع في3،15،،من1626،،من2728، 29،،من3031،،من3233). تم وضع عدة طرق رائدة لدراسة ال35،،من34TM36 وقد استخدمت هذه الأساليب على نطاق واسع لتعزيز فهمنا الحالي للأنسجة المريضة وطبيعية. واحد المجالات التي لم تستكشف على نطاق واسع هو استخدام نماذج الماوس المعدلة وراثيا دراسة الآليات الجزيئية لفشل TM. وقد تدق المعدلة وراثيا في والماوس المغلوب دراسات الجينات TM المرتبطين بها، مثل ميسلين (ميوك)37،38 و39من Cyp1b1، الأدوات الأساسية لدراسة الآليات الجزيئية للخرائط المواضيعية الدالة. ومن المفهوم أن حجم TM في الفئران الصغيرة يمثل عقبة خطيرة يجب التغلب عليها من أجل البدء بدراسة هذا النسيج. نماذج الماوس تمثل أداة قوية لدراسة علم الوراثة والآليات الجزيئية للمرض، بينما التقدم في تكنولوجيات LCM توفير الأدوات اللازمة لتمكين دراسة الأنسجة أصغر وأدق، بما في ذلك TM.

في هذا التقرير، يرد طريقة قوية واستنساخه ل LCM ل TM التخصيب من عيون الماوس جنبا إلى جنب مع عزل الحمض النووي الريبي اللاحقة، وتضخيم لتحليل التعبير المتلقين للمعلومات. أساليب مماثلة قد استخدمت بنجاح في الفئران لعزل أنواع أخرى من العين الأنسجة40،41،42،،من4344، ويمكن تطبيق المنهجية التي ذكرت هنا للآخر منفصلة من أنسجة العين لدراسة الحمض النووي الريبي، ميكرورنا والحمض النووي والبروتينات. الأهم من ذلك، هذا الأسلوب يمكن استخدام الفئران المعدلة وراثيا لتحسين فهم الآلية المرضية الجزيئية للعاهات TM في الزرق، وأمراض العين3،،من1516،17 ،،من1826،31،،من4546. وستكون القدرة على عزل TM عيون الفأر من LCM تقنية مفيدة في الحصول على المزيد من رؤى في الآليات الجزيئية لعدة أمراض العين.

Protocol

رعاية الحيوان الوطنية معهد لعلوم الصحة البيئية (نييهس) واستخدام اللجنة (أكوك) وافقت جميع منهجية هذه الدراسة تحت “إييدل اقتراح دراسة الحيوان نييهس” 05-46. 1-جمع الأنسجة الأمثل لليزر ميكروديسيكشن الحصول على 2 للفئران عمرها 3 أشهر، ذكرا كان أو أنثى C57BL/6. Euthanize مع CO2 لحد أد?…

Representative Results

LCM جمعت الجيش الملكي النيبالي من TM والجسم الهدبي من الفئران مختلفة 4 معزولة من أجل أن تكون قادرة على تحليل التعبير الجيني ومقارنة التعبير مع ذلك في العين كلها والصلبة والقزحية، الشبكية، والقرنية والعدسة المعزولة من الفئران منفصلة ثلاثة. TM التعبير عن الجينات، ميوك<sup …

Discussion

TM يلعب دوراً حيويا في الحفاظ على نشاط IOP التماثل الساكن وبه خلل مقبول على نطاق واسع كالعامل الرئيسي المسبّب لارتفاع ضغط الدم الزرق1،2،19. قد تم ربط عدد من النوكليوتيدات واحدة مجمع الأشكال المتعددة في عدة جينات حددها تحليل جوس الزرق زيادة ال…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Materials

ACTA2 ddPCR Primers (dMmuCPE5117282) BioRad 10031252 FAM
Agilent 2100 Bioanalyzer Agilent Technologies G2946-90004
Agilent RNA 6000 Pico kit Agilent Technologies 5067-1513
BioRad QX200 Droplet Digital PCR System BioRad
Small Paint Brush
Charged Glass Microscope Slide Thermo scientific 4951PLUS-001
Cresyl Violet Acetate Sigma Aldrich C5042
Curved Scissors
Eosin Y dye Thermo scientific 71204
Ethanol
Forceps Curved and Serrated tip (preferred tip size: 0.5 x 0.4 mm)
HemaCen American MasterTech STHEM30
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit Applied Biosystems 4368814
Hsp90a ddPCR Primers(dMmuCPE5097465) BioRad 10031255 VEX
Leica CM1850 Cryostat Leica
Millex-GS filter unit EMD Millipore SLGS033SB 0.22 µm
MMI CellCut UV Cutting Model Molecular Machines & Industries LCM intrument
MMI CellTools Software Molecular Machines & Industries 50202 LCM software
Sample Tube for Laser Capture Microdisssection ASEE Products ST-LMD-M-500 Isolation Cap Tube/Manufactured by Microdissect GmBH in Germany and distrubted by ASEE Products
Sample Tube for Laser Capture Microdisssection (Alternative) Molecular Machines & Industries
modified Harris Hematoxylin Thermo scientific 7211 FAM
MYOC ddPCR Primers (dMmuCPE5095712) BioRad 10031252
PBS
Memebrane Slides, RNase Free ASEE Products FS-LMD-M-50r Polyethylene terephthalate (PET) membrane/Manufactured by Microdissect GmBH in Germany and distrubted by ASEE Products
Memebrane Slides, RNase Free (Alternative) Molecular Machines & Industries 50102
Rapid Fix Thermo scientific 6764212 H&E staining
RLT Buffer Qiagen 79216 lysis bufffer used for LCM samples
RNAseZap Sigma R2020 RNase decontamination solution
Protect RNA RNAse Inhibitor Sigma Aldrich R7397
RNeasy Micro Kit Qiagen 74004 RNA isolation kit
SMART-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit Takara Clontech 634888 low input RNA to cDNA kit for LCM samples
SuperMix (no dUTP) BioRad 1863023 digital PCR master mix
Tissue-Tek Cryomold (25mm x 20mm x5mm) Sakura 4557
Tissue-Tek O.C.T. Compound Sakura 4583
Stratalinker UV Crosslinker Stratagene 400075
Xylene Macron 8668
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Foster, P. J., Buhrmann, R., Quigley, H. A., Johnson, G. J. The definition and classification of glaucoma in prevalence surveys. British Journal of Ophthalmology. 86 (2), 238-242 (2002).
  2. Quigley, H. A. Glaucoma. Lancet. 377 (9774), 1367-1377 (2011).
  3. Dismuke, W. M., Overby, D. R., Civan, M. M., Stamer, W. D. The Value of Mouse Models for Glaucoma Drug Discovery. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 32 (8), 486-487 (2016).
  4. Quigley, H. A. Number of people with glaucoma worldwide. British Journal of Ophthalmology. 80 (5), 389-393 (1996).
  5. Quigley, H. A., Broman, A. T. The number of people with glaucoma worldwide in 2010 and 2020. British Journal of Ophthalmology. 90 (3), 262-267 (2006).
  6. Resnikoff, S., et al. Global data on visual impairment in the year 2002. Bulletin World Health Organization. 82 (11), 844-851 (2004).
  7. Thylefors, B., Negrel, A. D., Pararajasegaram, R., Dadzie, K. Y. Global data on blindness. Bulletin World Health Organization. 73 (1), 115-121 (1995).
  8. . Comparison of glaucomatous progression between untreated patients with normal-tension glaucoma and patients with therapeutically reduced intraocular pressures. Collaborative Normal-Tension Glaucoma Study Group. American Journal of Ophthalmology. 126 (4), 487-497 (1998).
  9. . The effectiveness of intraocular pressure reduction in the treatment of normal-tension glaucoma. Collaborative Normal-Tension Glaucoma Study Group. American Journal of Ophthalmology. 126 (4), 498-505 (1998).
  10. . The Advanced Glaucoma Intervention Study (AGIS): 7. The relationship between control of intraocular pressure and visual field deterioration.The AGIS Investigators. American Journal of Ophthalmology. 130 (4), 429-440 (2000).
  11. Anderson, D. R. Collaborative normal tension glaucoma study. Current Opinion Ophthalmology. 14 (2), 86-90 (2003).
  12. Kass, M. A., et al. The Ocular Hypertension Treatment Study: a randomized trial determines that topical ocular hypotensive medication delays or prevents the onset of primary open-angle glaucoma. Archives of Ophthalmology. 120 (6), 701-713 (2002).
  13. Gordon, M. O., et al. The Ocular Hypertension Treatment Study: baseline factors that predict the onset of primary open-angle glaucoma. Archives of Ophthalmology. 120 (6), (2002).
  14. Leske, M. C., et al. Factors for glaucoma progression and the effect of treatment: the early manifest glaucoma trial. Archives of Ophthalmology. 121 (1), 48-56 (2003).
  15. Chen, S., Zhang, X. The Rodent Model of Glaucoma and Its Implications. Asia-Pacific Journal Ophthalmology (Phila). 4 (4), 236-241 (2015).
  16. Fernandes, K. A., et al. Using genetic mouse models to gain insight into glaucoma: Past results and future possibilities. Experimental Eye Research. 141, 42-56 (2015).
  17. Howell, G. R., Libby, R. T., John, S. W. Mouse genetic models: an ideal system for understanding glaucomatous neurodegeneration and neuroprotection. Progress in Brain Research. 173, 303-321 (2008).
  18. John, S. W., Anderson, M. G., Smith, R. S. Mouse genetics: a tool to help unlock the mechanisms of glaucoma. Journal of Glaucoma. 8 (6), 400-412 (1999).
  19. Braunger, B. M., Fuchshofer, R., Tamm, E. R. The aqueous humor outflow pathways in glaucoma: A unifying concept of disease mechanisms and causative treatment. Eurupean Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 95 (Pt B), 173-181 (2015).
  20. Weinreb, R. N., et al. Primary open-angle glaucoma. Nature Reviews Disease Primers. 2 (16067), (2016).
  21. Burdon, K. P. Genome-wide association studies in the hunt for genes causing primary open-angle glaucoma: a review. Clinical and Experimental Ophthalmology. 40 (4), 358-363 (2012).
  22. Iglesias, A. I., et al. Genes, pathways, and animal models in primary open-angle glaucoma. Eye (London). 29 (10), 1285-1298 (2015).
  23. Jakobs, T. C. Differential gene expression in glaucoma. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (7), (2014).
  24. Jeck, W. R., Siebold, A. P., Sharpless, N. E. Review: a meta-analysis of GWAS and age-associated diseases. Aging Cell. 11 (5), 727-731 (2012).
  25. Sakurada, Y., Mabuchi, F. Advances in glaucoma genetics. Progress in Brain Research. 220, 107-126 (2015).
  26. Agarwal, R., Agarwal, P. Rodent models of glaucoma and their applicability for drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 12 (3), 1-10 (2017).
  27. Aires, I. D., Ambrosio, A. F., Santiago, A. R. Modeling Human Glaucoma: Lessons from the in vitro Models. Ophthalmic Research. 57 (2), 77-86 (2016).
  28. Burgoyne, C. F. The non-human primate experimental glaucoma model. Experimental Eye Research. 141, 57-73 (2015).
  29. Morgan, J. E., Tribble, J. R. Microbead models in glaucoma. Experimental Eye Research. 141, 9-14 (2015).
  30. Morrison, J. C., Cepurna, W. O., Johnson, E. C. Modeling glaucoma in rats by sclerosing aqueous outflow pathways to elevate intraocular pressure. Experimental Eye Research. 141, 23-32 (2015).
  31. Overby, D. R., Clark, A. F. Animal models of glucocorticoid-induced glaucoma. Experimental Eye Research. 141, 15-22 (2015).
  32. Rybkin, I., Gerometta, R., Fridman, G., Candia, O., Danias, J. Model systems for the study of steroid-induced IOP elevation. Experimental Eye Research. 158, 51-58 (2016).
  33. Zernii, E. Y., et al. Rabbit Models of Ocular Diseases: New Relevance for Classical Approaches. CNS & Neurological Disorders – Drug Targets. 15 (3), 267-291 (2016).
  34. Gong, H., Ruberti, J., Overby, D., Johnson, M., Freddo, T. F. A new view of the human trabecular meshwork using quick-freeze, deep-etch electron microscopy. Experimental Eye Research. 75 (3), 347-358 (2002).
  35. Hoerauf, H., et al. Transscleral optical coherence tomography: a new imaging method for the anterior segment of the eye. Archives of Ophthalmology. 120 (6), 816-819 (2002).
  36. Tomarev, S. I., Wistow, G., Raymond, V., Dubois, S., Malyukova, I. Gene expression profile of the human trabecular meshwork: NEIBank sequence tag analysis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (6), 2588-2596 (2003).
  37. Kim, B. S., et al. Targeted disruption of the myocilin gene (Myoc) suggests that human glaucoma-causing mutations are gain of function. Molecular and Cellular Biology. 21 (22), 7707-7713 (2001).
  38. Gould, D. B., et al. Genetically increasing Myoc expression supports a necessary pathologic role of abnormal proteins in glaucoma. Molecular and Cellular Biology. 24 (20), 9019-9025 (2004).
  39. Teixeira, L., Zhao, Y., Dubielzig, R., Sorenson, C., Sheibani, N. Ultrastructural abnormalities of the trabecular meshwork extracellular matrix in Cyp1b1-deficient mice. Veterinary pathology. 52 (2), 397-403 (2015).
  40. Hackler, L., Masuda, T., Oliver, V. F., Merbs, S. L., Zack, D. J. Use of laser capture microdissection for analysis of retinal mRNA/miRNA expression and DNA methylation. Retinal Development: Methods and Protocols. 884, 289-304 (2012).
  41. Gipson, I. K., Spurr-Michaud, S., Tisdale, A. Human conjunctival goblet cells express the membrane associated mucin MUC16: Localization to mucin granules. Experimental Eye Research. 145, 230-234 (2016).
  42. Sweigard, J. H., et al. The alternative complement pathway regulates pathological angiogenesis in the retina. The FASEB Journal. 28 (7), 3171-3182 (2014).
  43. Marko, C. K., et al. Spdef null mice lack conjunctival goblet cells and provide a model of dry eye. The American Journal of Pathology. 183 (1), 35-48 (2013).
  44. Huynh, S., Otteson, D. Optimizing Laser Capture Microdissection to Study Spatiotemporal Gene Expression in the Retinal Ganglion Cell Layer. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (15), 2469-2469 (2013).
  45. Cone, F. E., Gelman, S. E., Son, J. L., Pease, M. E., Quigley, H. A. Differential susceptibility to experimental glaucoma among 3 mouse strains using bead and viscoelastic injection. Experimental Eye Research. 91 (3), 415-424 (2010).
  46. McKinnon, S. J., Schlamp, C. L., Nickells, R. W. Mouse models of retinal ganglion cell death and glaucoma. Experimental Eye Research. 88 (4), 816-824 (2009).
  47. Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7 (3), (2006).
  48. Hardy, K. M., Hoffman, E. A., Gonzalez, P., McKay, B. S., Stamer, W. D. Extracellular trafficking of myocilin in human trabecular meshwork cells. Journal of Biological Chemistry. 280 (32), 28917-28926 (2005).
  49. Morgan, J. T., et al. Human trabecular meshwork cells exhibit several characteristics of, but are distinct from, adipose-derived mesenchymal stem cells. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 30 (2-3), 254-266 (2014).
  50. Hindson, C. M., et al. Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR. Nature Methods. 10 (10), 1003-1005 (2013).
  51. Wang, W. Z., Oeschger, F. M., Lee, S., Molnar, Z. High quality RNA from multiple brain regions simultaneously acquired by laser capture microdissection. BMC Molecular Biology. 10 (69), (2009).
  52. Cummings, M., et al. A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue. Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).

Tags

Laser MicrodissectionTrabecular MeshworkGene Expression AnalysisOcular DiseasesRNA IsolationCryostat SectioningH&E StainingLaser Capture Microscopy

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Sutherland, C., Wang, Y., Brown, R. V., Foley, J., Mahler, B., Janardhan, K. S., Kovi, R. C., Jetten, A. M. Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis. J. Vis. Exp. (136), e57576, doi:10.3791/57576 (2018).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image