Laser vangt Microdissection voor zeer zuivere Trabecular Zitschalen van muis ogen gen expressie p.a.
Summary
Hier beschrijven we een protocol voor een reproduceerbare laser vangt microdissection (LCM) voor het isoleren van trabecular gevlochten (TM) voor downstream RNA analyse. De mogelijkheid om het analyseren van wijzigingen in genexpressie in het Vertaalgeheugen zal helpen bij het begrijpen van de moleculaire mechanismen van TM-gerelateerde oogbeschadigingen en/of ziekten.
Abstract
Laser vangt microdissection (LCM) heeft toegestaan gen expressie analyse van afzonderlijke cellen en cel populaties in weefselsecties verrijkt. LCM is een geweldig hulpmiddel voor de studie van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de celdifferentiatie, de ontwikkeling en de progressie van verschillende ziekten, met inbegrip van glaucoom. Glaucoom, die bestaat uit een familie van progressieve optic neuropathieën, is de meest voorkomende oorzaak van onomkeerbare blindheid wereldwijd. Structurele veranderingen en schade binnen het trabecular gevlochten (TM) kunnen leiden tot verhoogde intraoculaire druk (IOP), dat een belangrijke risicofactor is voor het ontwikkelen van glaucoom. De exacte moleculaire mechanismen die betrokken zijn echter nog steeds slecht begrepen. De mogelijkheid om het gen expressie analyses uit te voeren zullen van cruciaal belang bij het verkrijgen van meer inzicht in de functie van deze cellen en haar rol in de regulatie van de ontwikkeling van het IOP en glaucoom. Om dit te bereiken, verrijkt een reproduceerbare methode voor het isoleren van sterk TM uit bevroren secties van muis ogen en een methode voor de analyse van de expressie van de stroomafwaartse gen, zoals RT-qPCR en RNA-Seq nodig is. De hier beschreven methode is ontwikkeld om zeer zuivere TM van muis ogen isoleren voor downstream digitale PCR en microarray analyse. Deze techniek kunnen bovendien gemakkelijk aan te passen voor de isolatie van andere hoogverrijkt oogbeschadigingen en/of cellen en de cel compartimenten die moeilijk geweest te isoleren van de ogen van de muis. De combinatie van LCM en RNA analyse kan bijdragen tot een vollediger begrip van de cellulaire gebeurtenissen ten grondslag liggen aan de glaucoom.
Introduction
Glaucoom is een groep van ziekten gekenmerkt door optische neuropathie en retinopathie die uiteindelijk tot onomkeerbare blindheid1,2 leidt. Geschat wordt dat door 2020 meer dan 70 miljoen mensen wereldwijd moeten met een vorm van de ziekte3,4,5,6,7 leven zal. Primaire open hoek glaucoom (POAG), het meest voorkomende type glaucoom, wordt gekenmerkt door een daling in aqueous humor (AH) uitstroom leidt tot verhoogde intraoculaire druk (IOP)8,9,10, 11,12,13,143,15,16,17,18. Linker onbehandeld, chronisch verhoogde IOP leidt tot progressieve en onomkeerbare schade aan de retina en oogzenuw hoofd veroorzaakt radiale blindheid1,2,19. Alle huidige methoden voor het vertragen van de progressie van glaucoom focus op vermindering van de IOP, hetzij door het verminderen van het percentage van de productie van AH door het straalvormig lichaam of verbetering van het uitstroom1,8,9, 10 , 11 , 12 , 13 , 14. het trabecular gevlochten (TM) speelt een cruciale rol bij het reguleren van de primaire AH uitstroom pathway actief en zijn onjuiste functie is een oorzakelijke factor voor hypertensieve glaucoom,1,,2,19. Echter de moleculaire mechanismen gekoppeld TM dysfunctie en hoe regelt het AH drainage worden nog niet volledig begrepen en is momenteel een belangrijk aandachtspunt van glaucoom onderzoek1,2,19, 20. terwijl verschillende genoom-brede vereniging studies (GWAS) een aantal genen aan glaucoom en een verhoogde weerstand tegen AH uitstroom faciliteit in de TM hebt gekoppeld, de exacte moleculaire mechanismen die leiden tot de ziekte niet nog volledig begrepen21 , 22 , 23 , 24 , 25.
Dierlijke modellen hebben aanzienlijk verbeterd onze huidige kennis van de progressie van de ziekte in glaucoom (uitgebreid herzien in3,15,16,26,27,28, 29,30,31,32,33). Verschillende baanbrekende methoden hebben ontwikkeld om te bestuderen van de TM34,35,,36 en deze methoden hebben wijd verbeid gebruikt om ons huidige begrip van normale en zieke weefsel. Een gebied dat is niet uitgebreid onderzocht is het gebruik van genetisch gemodificeerde Muismodellen te bestuderen van de moleculaire mechanismen van TM mislukking. Transgene knock-in en knock-out muis studies van TM verbonden genen, zoals Myocilin (Myoc)37,38 en39van het Cyp1b1, zijn de belangrijkste instrumenten voor het bestuderen van de moleculaire mechanismen van TM functie. Begrijpelijk, de geringe omvang van de TM in muizen vertegenwoordigt een ernstige hindernis die moet worden overwonnen om te beginnen met het bestuderen van dit weefsel. Muismodellen vertegenwoordigen een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van de genetica en de moleculaire mechanismen van ziekte, hoewel de vooruitgang in de LCM technologieën bieden de noodzakelijke hulpmiddelen om de studie van de kleinste en meest delicate weefsels, met inbegrip van de TM machtigen.
In dit verslag wordt een robuust en reproduceerbare methode beschreven voor de LCM van hoogverrijkt TM van muis ogen samen met de latere RNA isolatie en versterking voor downstream expressie analyse. Soortgelijke methoden hebben met succes gebruikt bij muizen te isoleren van andere soorten oog weefsels40,41,42,43,44, de methodologie die hierin gemeld kan worden toegepast op andere discrete weefsels van het oog om te studeren van RNA, microRNA, DNA en proteïnen. Belangrijk is dat maakt deze techniek het gebruik van genetisch gemodificeerde muizen voor een beter begrip van de moleculaire pathogenese van TM waardevermindering in glaucoom en oculaire ziekte3,15,16,17 ,18,26,31,45,46. De mogelijkheid om te isoleren van de TM van muis ogen door LCM zullen een handige techniek bij het verkrijgen van meer inzicht in de moleculaire mechanismen van verschillende oogbeschadigingen en/of ziekten.
Protocol
Representative Results
Discussion
De TM speelt een vitale rol in het actief onderhouden homeostatische IOP en zijn dysfunctie wordt algemeen erkend als de belangrijkste oorzakelijke factor voor hypertensieve glaucoom,1,,2,19. Een aantal single nucleotide polymorphisms in verschillende genen geïdentificeerd door GWAS analyse zijn gekoppeld aan verhoogde glaucoom risico en een verhoogde weerstand tegen AH uitstroom faciliteit in de TM; echter, de exacte moleculai…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Materials
| ACTA2 ddPCR Primers (dMmuCPE5117282) | BioRad | 10031252 | FAM |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2946-90004 | |
| Agilent RNA 6000 Pico kit | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| BioRad QX200 Droplet Digital PCR System | BioRad | ||
| Small Paint Brush | |||
| Charged Glass Microscope Slide | Thermo scientific | 4951PLUS-001 | |
| Cresyl Violet Acetate | Sigma Aldrich | C5042 | |
| Curved Scissors | |||
| Eosin Y dye | Thermo scientific | 71204 | |
| Ethanol | |||
| Forceps | Curved and Serrated tip (preferred tip size: 0.5 x 0.4 mm) | ||
| HemaCen | American MasterTech | STHEM30 | |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4368814 | |
| Hsp90a ddPCR Primers(dMmuCPE5097465) | BioRad | 10031255 | VEX |
| Leica CM1850 Cryostat | Leica | ||
| Millex-GS filter unit | EMD Millipore | SLGS033SB | 0.22 µm |
| MMI CellCut UV Cutting Model | Molecular Machines & Industries | LCM intrument | |
| MMI CellTools Software | Molecular Machines & Industries | 50202 | LCM software |
| Sample Tube for Laser Capture Microdisssection | ASEE Products | ST-LMD-M-500 | Isolation Cap Tube/Manufactured by Microdissect GmBH in Germany and distrubted by ASEE Products |
| Sample Tube for Laser Capture Microdisssection (Alternative) | Molecular Machines & Industries | ||
| modified Harris Hematoxylin | Thermo scientific | 7211 | FAM |
| MYOC ddPCR Primers (dMmuCPE5095712) | BioRad | 10031252 | |
| PBS | |||
| Memebrane Slides, RNase Free | ASEE Products | FS-LMD-M-50r | Polyethylene terephthalate (PET) membrane/Manufactured by Microdissect GmBH in Germany and distrubted by ASEE Products |
| Memebrane Slides, RNase Free (Alternative) | Molecular Machines & Industries | 50102 | |
| Rapid Fix | Thermo scientific | 6764212 | H&E staining |
| RLT Buffer | Qiagen | 79216 | lysis bufffer used for LCM samples |
| RNAseZap | Sigma | R2020 | RNase decontamination solution |
| Protect RNA RNAse Inhibitor | Sigma Aldrich | R7397 | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | RNA isolation kit |
| SMART-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit | Takara Clontech | 634888 | low input RNA to cDNA kit for LCM samples |
| SuperMix (no dUTP) | BioRad | 1863023 | digital PCR master mix |
| Tissue-Tek Cryomold (25mm x 20mm x5mm) | Sakura | 4557 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura | 4583 | |
| Stratalinker UV Crosslinker | Stratagene | 400075 | |
| Xylene | Macron | 8668 |
References
- Foster, P. J., Buhrmann, R., Quigley, H. A., Johnson, G. J. The definition and classification of glaucoma in prevalence surveys. British Journal of Ophthalmology. 86 (2), 238-242 (2002).
- Quigley, H. A. Glaucoma. Lancet. 377 (9774), 1367-1377 (2011).
- Dismuke, W. M., Overby, D. R., Civan, M. M., Stamer, W. D. The Value of Mouse Models for Glaucoma Drug Discovery. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 32 (8), 486-487 (2016).
- Quigley, H. A. Number of people with glaucoma worldwide. British Journal of Ophthalmology. 80 (5), 389-393 (1996).
- Quigley, H. A., Broman, A. T. The number of people with glaucoma worldwide in 2010 and 2020. British Journal of Ophthalmology. 90 (3), 262-267 (2006).
- Resnikoff, S., et al. Global data on visual impairment in the year 2002. Bulletin World Health Organization. 82 (11), 844-851 (2004).
- Thylefors, B., Negrel, A. D., Pararajasegaram, R., Dadzie, K. Y. Global data on blindness. Bulletin World Health Organization. 73 (1), 115-121 (1995).
- . Comparison of glaucomatous progression between untreated patients with normal-tension glaucoma and patients with therapeutically reduced intraocular pressures. Collaborative Normal-Tension Glaucoma Study Group. American Journal of Ophthalmology. 126 (4), 487-497 (1998).
- . The effectiveness of intraocular pressure reduction in the treatment of normal-tension glaucoma. Collaborative Normal-Tension Glaucoma Study Group. American Journal of Ophthalmology. 126 (4), 498-505 (1998).
- . The Advanced Glaucoma Intervention Study (AGIS): 7. The relationship between control of intraocular pressure and visual field deterioration.The AGIS Investigators. American Journal of Ophthalmology. 130 (4), 429-440 (2000).
- Anderson, D. R. Collaborative normal tension glaucoma study. Current Opinion Ophthalmology. 14 (2), 86-90 (2003).
- Kass, M. A., et al. The Ocular Hypertension Treatment Study: a randomized trial determines that topical ocular hypotensive medication delays or prevents the onset of primary open-angle glaucoma. Archives of Ophthalmology. 120 (6), 701-713 (2002).
- Gordon, M. O., et al. The Ocular Hypertension Treatment Study: baseline factors that predict the onset of primary open-angle glaucoma. Archives of Ophthalmology. 120 (6), (2002).
- Leske, M. C., et al. Factors for glaucoma progression and the effect of treatment: the early manifest glaucoma trial. Archives of Ophthalmology. 121 (1), 48-56 (2003).
- Chen, S., Zhang, X. The Rodent Model of Glaucoma and Its Implications. Asia-Pacific Journal Ophthalmology (Phila). 4 (4), 236-241 (2015).
- Fernandes, K. A., et al. Using genetic mouse models to gain insight into glaucoma: Past results and future possibilities. Experimental Eye Research. 141, 42-56 (2015).
- Howell, G. R., Libby, R. T., John, S. W. Mouse genetic models: an ideal system for understanding glaucomatous neurodegeneration and neuroprotection. Progress in Brain Research. 173, 303-321 (2008).
- John, S. W., Anderson, M. G., Smith, R. S. Mouse genetics: a tool to help unlock the mechanisms of glaucoma. Journal of Glaucoma. 8 (6), 400-412 (1999).
- Braunger, B. M., Fuchshofer, R., Tamm, E. R. The aqueous humor outflow pathways in glaucoma: A unifying concept of disease mechanisms and causative treatment. Eurupean Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 95 (Pt B), 173-181 (2015).
- Weinreb, R. N., et al. Primary open-angle glaucoma. Nature Reviews Disease Primers. 2 (16067), (2016).
- Burdon, K. P. Genome-wide association studies in the hunt for genes causing primary open-angle glaucoma: a review. Clinical and Experimental Ophthalmology. 40 (4), 358-363 (2012).
- Iglesias, A. I., et al. Genes, pathways, and animal models in primary open-angle glaucoma. Eye (London). 29 (10), 1285-1298 (2015).
- Jakobs, T. C. Differential gene expression in glaucoma. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (7), (2014).
- Jeck, W. R., Siebold, A. P., Sharpless, N. E. Review: a meta-analysis of GWAS and age-associated diseases. Aging Cell. 11 (5), 727-731 (2012).
- Sakurada, Y., Mabuchi, F. Advances in glaucoma genetics. Progress in Brain Research. 220, 107-126 (2015).
- Agarwal, R., Agarwal, P. Rodent models of glaucoma and their applicability for drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 12 (3), 1-10 (2017).
- Aires, I. D., Ambrosio, A. F., Santiago, A. R. Modeling Human Glaucoma: Lessons from the in vitro Models. Ophthalmic Research. 57 (2), 77-86 (2016).
- Burgoyne, C. F. The non-human primate experimental glaucoma model. Experimental Eye Research. 141, 57-73 (2015).
- Morgan, J. E., Tribble, J. R. Microbead models in glaucoma. Experimental Eye Research. 141, 9-14 (2015).
- Morrison, J. C., Cepurna, W. O., Johnson, E. C. Modeling glaucoma in rats by sclerosing aqueous outflow pathways to elevate intraocular pressure. Experimental Eye Research. 141, 23-32 (2015).
- Overby, D. R., Clark, A. F. Animal models of glucocorticoid-induced glaucoma. Experimental Eye Research. 141, 15-22 (2015).
- Rybkin, I., Gerometta, R., Fridman, G., Candia, O., Danias, J. Model systems for the study of steroid-induced IOP elevation. Experimental Eye Research. 158, 51-58 (2016).
- Zernii, E. Y., et al. Rabbit Models of Ocular Diseases: New Relevance for Classical Approaches. CNS & Neurological Disorders – Drug Targets. 15 (3), 267-291 (2016).
- Gong, H., Ruberti, J., Overby, D., Johnson, M., Freddo, T. F. A new view of the human trabecular meshwork using quick-freeze, deep-etch electron microscopy. Experimental Eye Research. 75 (3), 347-358 (2002).
- Hoerauf, H., et al. Transscleral optical coherence tomography: a new imaging method for the anterior segment of the eye. Archives of Ophthalmology. 120 (6), 816-819 (2002).
- Tomarev, S. I., Wistow, G., Raymond, V., Dubois, S., Malyukova, I. Gene expression profile of the human trabecular meshwork: NEIBank sequence tag analysis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44 (6), 2588-2596 (2003).
- Kim, B. S., et al. Targeted disruption of the myocilin gene (Myoc) suggests that human glaucoma-causing mutations are gain of function. Molecular and Cellular Biology. 21 (22), 7707-7713 (2001).
- Gould, D. B., et al. Genetically increasing Myoc expression supports a necessary pathologic role of abnormal proteins in glaucoma. Molecular and Cellular Biology. 24 (20), 9019-9025 (2004).
- Teixeira, L., Zhao, Y., Dubielzig, R., Sorenson, C., Sheibani, N. Ultrastructural abnormalities of the trabecular meshwork extracellular matrix in Cyp1b1-deficient mice. Veterinary pathology. 52 (2), 397-403 (2015).
- Hackler, L., Masuda, T., Oliver, V. F., Merbs, S. L., Zack, D. J. Use of laser capture microdissection for analysis of retinal mRNA/miRNA expression and DNA methylation. Retinal Development: Methods and Protocols. 884, 289-304 (2012).
- Gipson, I. K., Spurr-Michaud, S., Tisdale, A. Human conjunctival goblet cells express the membrane associated mucin MUC16: Localization to mucin granules. Experimental Eye Research. 145, 230-234 (2016).
- Sweigard, J. H., et al. The alternative complement pathway regulates pathological angiogenesis in the retina. The FASEB Journal. 28 (7), 3171-3182 (2014).
- Marko, C. K., et al. Spdef null mice lack conjunctival goblet cells and provide a model of dry eye. The American Journal of Pathology. 183 (1), 35-48 (2013).
- Huynh, S., Otteson, D. Optimizing Laser Capture Microdissection to Study Spatiotemporal Gene Expression in the Retinal Ganglion Cell Layer. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (15), 2469-2469 (2013).
- Cone, F. E., Gelman, S. E., Son, J. L., Pease, M. E., Quigley, H. A. Differential susceptibility to experimental glaucoma among 3 mouse strains using bead and viscoelastic injection. Experimental Eye Research. 91 (3), 415-424 (2010).
- McKinnon, S. J., Schlamp, C. L., Nickells, R. W. Mouse models of retinal ganglion cell death and glaucoma. Experimental Eye Research. 88 (4), 816-824 (2009).
- Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7 (3), (2006).
- Hardy, K. M., Hoffman, E. A., Gonzalez, P., McKay, B. S., Stamer, W. D. Extracellular trafficking of myocilin in human trabecular meshwork cells. Journal of Biological Chemistry. 280 (32), 28917-28926 (2005).
- Morgan, J. T., et al. Human trabecular meshwork cells exhibit several characteristics of, but are distinct from, adipose-derived mesenchymal stem cells. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 30 (2-3), 254-266 (2014).
- Hindson, C. M., et al. Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR. Nature Methods. 10 (10), 1003-1005 (2013).
- Wang, W. Z., Oeschger, F. M., Lee, S., Molnar, Z. High quality RNA from multiple brain regions simultaneously acquired by laser capture microdissection. BMC Molecular Biology. 10 (69), (2009).
- Cummings, M., et al. A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue. Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).
