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Abstract
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Neurosciences

Monocellulaire Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction après Patch-clamp

Published: June 20, 2018
doi:
10.3791/57627
, , ,
1UPMC Univ Paris 06, INSERM, CNRS, Neuroscience Paris Seine – Institut de Biologie Paris Seine (NPS – IBPS),Sorbonne Université

Summary

Ce protocole décrit les étapes critiques et les précautions nécessaires afin d’effectuer seule cellule transcription réverse multiplex PCR après patch clamp. Cette technique est une méthode simple et efficace pour analyser le profil d’expression d’un ensemble prédéterminé de gènes d’une cellule unique, caractérisé par des enregistrements de patch clamp.

Abstract

Le cortex cérébral se compose de nombreux types de cellules présentant des caractéristiques morphologiques, physiologiques et moléculaires différents. Cette diversité entrave faciliter l’identification et la caractérisation de ces types de cellules, prérequis pour étudier leurs fonctions spécifiques. Cet article décrit le Protocole multiplex unicellulaire transcription réverse polymérase PCR (RT-PCR), qui permet de détecter simultanément l’expression de plusieurs dizaines de gènes dans une seule cellule, après enregistrement en tranches, patch clamp. Cette méthode simple peut être implémentée avec caractérisation morphologique et est largement applicable pour déterminer les caractéristiques phénotypiques de divers types de cellules et de leur environnement cellulaire particulière, comme dans les environs de vaisseaux sanguins. Le principe de ce protocole est d’enregistrer une cellule avec la technique de patch clamp, de récolter et d’inverser transcrire son contenu cytoplasmique, et de déceler qualitativement l’expression d’un ensemble prédéfini de gènes par multiplex PCR. Elle nécessite une conception soignée des amorces de PCR et intracellulaire patch-clamp de la solution compatible avec la RT-PCR. Afin d’assurer une transcription sélective et fiable detection, cette technique requiert également des contrôles appropriés de cytoplasme récolte aux étapes de l’amplification. Bien que nous discutées des précautions doivent être strictement respectées, pratiquement n’importe quel laboratoire électrophysiologique peut utiliser la cellule technique RT-PCR multiplexe.

Introduction

Le cortex cérébral se compose de nombreux types de cellules impliquées dans divers processus physiologiques. Leur identification et leur caractérisation, une condition préalable à la compréhension de leurs fonctions spécifiques, peuvent être très difficiles étant donné la grande diversité morphologique, physiologique et moléculaire qui caractérise les cellules corticales types1 ,2,3,4.

Single-cell RT-PCR multiplex repose sur la combinaison de patch clamp et techniques de RT-PCR. Il peut sonder simultanément l’expression de plus de 30 gènes prédéfinis dans les cellules identifiées rhinophore5. L’inclusion d’un traceur neuronale dans la pipette d’enregistrement supplémentaires permet la caractérisation morphologique des cellules enregistrés après la révélation histochimiques6,7,8,9, 10. c’est une technique très utile pour la classification des types neurones basée sur une analyse multivariée de leurs caractères phénotypiques5,9,10,11,12 ,13,14. Monocellulaire de RT-PCR multiplex est également adapté à la caractérisation des cellules non neuronales comme les astrocytes15,16,17et peut être appliqué de manière pratiquement à chaque cerveau structure18, 19,20,21,22,23 et cellule de type, en supposant qu’ils peuvent être enregistrés dans la configuration de la cellule entière.

Cette technique est très pratique pour l’identification des sources cellulaires ou cibles de transmission systèmes7,8,15,16,20,21, 24,25,26,27,28, surtout quand les anticorps spécifiques font défaut. Il s’appuie sur des enregistrements de patch clamp de cellules identifiées visuellement29et donc permet également le ciblage des cellules dans un environnement cellulaire spécifique8,15,16. En outre puisque la cytoarchitecture du tissu cérébral est conservé dans des tranches de cerveau, cette approche permet également l’étude des relations anatomiques des cellules caractérisés avec éléments neuronaux et non neuronales7,8 , 18.

Puisque cette technique est limitée par la quantité de cytoplasme récolté et de l’efficacité de la RT, la détection des ARNm exprimée au nombre de copies basse peut être difficile. Bien que les autres approches basées sur la technologie RNaseq permettent d’analyser le transcriptome entière de cellules individuelles3,4,30,31, dont ils ont besoin les coûteux séquenceurs haut débit pas nécessairement disponible pour chaque laboratoire. Étant donné que la technique de RT-PCR multiplexe unicellulaire utilise PCR point final, il suffit de thermocycleurs largement disponibles. Il peut être facilement développé dans des laboratoires équipés avec des configurations électrophysiologiques et ne nécessite pas de matériel coûteux. Il peut fournir, dans la journée, une analyse qualitative de l’expression d’un ensemble prédéfini de gènes. Ainsi, cette approche offre un accès facile à la caractérisation moléculaire des cellules individuelles d’une manière rapide.

Protocol

Toutes les procédures expérimentales chez l’animal a eu lieu en stricte conformité avec les règlements Français (Code Rural R214/87 à R214/130) et sont conformes à l’éthique professionnelle de la Communauté économique européenne (86/609/CEE) et la Charte nationale Français sur l’éthique de l’expérimentation animale. Tous les protocoles ont été approuvés par le Comité d’éthique de Charles Darwin et soumis au Ministère Français de l’éducation et de la recherche (approbation 2015 0610113675…

Representative Results

Une validation représentative de RT-PCR multiplex est illustrée à la Figure 3. Le protocole a été conçu pour sonder simultanément l’expression des gènes différents 12. Le vGluT1 du transporteur vésiculaire glutamate a été pris comme un témoin positif de neurones glutamatergiques42. Le GABA de synthèse des enzymes (GAD65 et GAD 67), Neuropeptide Y (NPY) et la somatostatine (SOM) ont été utilisés comme marqueurs de GAB…

Discussion

Single cell RT-PCR multiplex après que patch clamp peut sonder, simultanément et de manière fiable, l’expression de plus de 30 gènes dans les cellules identifiées rhinophore5. Analyse de l’expression des gènes au niveau de la cellule unique nécessite des amorces PCR hautement efficaces. Une des étapes plus limitants est la collection de contenu de la cellule. Son efficacité dépend du diamètre de l’embout de la pipette de patch, qui doit être aussi large que possible tout en corre…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions le Dr Alexandre Mourot pour ses commentaires sur le manuscrit. Ce travail a été soutenu par des subventions de l’Agence Nationale de la Recherche (ANR 2011 MALZ 01 003 ; ANR-15-CE16-0010 et ANR-17-CE37-0010-03), BLG est pris en charge par la bourse de la Fondation pour la Recherche sur Alzheimer. Nous remercions l’animalerie de le couples (Paris, France).

Materials

MACAW v.2.0.5 NCBI Multiple alignement for primer design
Dithiothreitol VWR 443852A RT
Random primers Sigma-Aldrich (Merck) 11034731001 RT
dNTPs GE Healthcare Life Sciences 28-4065-52 RT and PCR
RNasin Ribonuclease Inhibitors Promega N2511 RT
SuperScript II Reverse Transcriptase Invitrogen 18064014 RT
Taq DNA Polymerase Qiagen 201205 PCR
Mineral Oil Sigma-Aldrich (Merck) M5904-5ML PCR
PCR primers Sigma-Aldrich (Merck) PCR / desalted and diluted at 200 µM
Tubes, 0.5 mL, flat cap ThermoFisher Scientific AB0350 RT and PCR
BT10 Series – 10 µL Filter Tip Neptune Scientific BT10 RT and PCR
BT20 Series – 20 µL Filter Tip Neptune Scientific BT20 RT and PCR
BT200 Series – 200 µL Filter Tip Neptune Scientific BT200 RT and PCR
BT1000 Series – 1000 µL Filter Tip Neptune Scientific BT1000.96 RT and PCR
DNA Thermal Cylcer Perkin Elmer Cetus PCR
Ethidium Bromide Sigma-Aldrich (Merck) E1510-10ML Agarose gel electrophoresis
Tris-Borate-EDTA buffer Sigma-Aldrich (Merck) T4415-1L Agarose gel electrophoresis
UltraPure Agarose Life Technologies 16500-500 Agarose gel electrophoresis
ΦX174 DNA-Hae III Digest NEB (New England BioLabs) N3026S Agarose gel electrophoresis
EDA 290 Kodak Agarose gel electrophoresis
Electrophoresis Power supply EPS 3500 Pharmacia Biotech Agarose gel electrophoresis
Midi Horizontal Elecrophoresis Unit Model SHU13 Sigma-Aldrich (Merck) Agarose gel electrophoresis
Smooth paper with satin appearance Fisherbrand 1748B Patch clamp internal solution
Potassium Hydroxyde Sigma-Aldrich (Merck) 60377 Patch clamp internal solution
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid Sigma-Aldrich (Merck) E3889 Patch clamp internal solution
HEPES Sigma-Aldrich (Merck) H4034 Patch clamp internal solution
Potassium D-gluconate Sigma-Aldrich (Merck) G4500 Patch clamp internal solution
Magnesium chloride solution Sigma-Aldrich (Merck) M1028 Patch clamp internal solution
5500 Vapor Pressure Osmometer Wescor Patch clamp internal solution
Biocytin Sigma-Aldrich (Merck) B4261 Patch clamp internal solution
Sucrose Sigma-Aldrich (Merck) S5016 Slice preparation
D-(+)-Glucose monohydrate Sigma-Aldrich (Merck) 49159 Slice preparation
Sodium chloride Sigma-Aldrich (Merck) S6191 Slice preparation
Potassium chloride Sigma-Aldrich (Merck) 60128 Slice preparation
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich (Merck) 31437-M Slice preparation
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich (Merck) S5011 Slice preparation
Magnesium chloride solution Sigma-Aldrich (Merck) 63069 Slice preparation
Calcium chloride solution Sigma-Aldrich (Merck) 21115 Slice preparation
Kynurenic acid Sigma-Aldrich (Merck) K3375 Slice preparation
Isoflurane Piramal Healthcare UK Slice preparation
VT 1000S Leica Biosystems 14047235613 Slice preparation
Hydrogen peroxide solution Sigma-Aldrich (Merck) H1009 Patch Clamp set-up cleaning
Thin Wall Glass Capillaries with filament World Precision Instruments TW150F-4 Patch Clamp
PP-83 Narishige Patch Clamp
Eppendorf Microloader Eppendorf 5242956003 Patch Clamp
BX51WI Upright microscope Olympus Patch Clamp
XC-ST70/CE CCD B/W VIDEO CAMERA Sony Patch Clamp
Axopatch 200B Amplifier Molecular Devices Patch Clamp
Digidata 1440 Molecular Devices Patch Clamp
pCLAMP 10 software suite Molecular Devices Patch Clamp
10 mL syringe Terumo SS-10ES Expelling
E Series with Straight Body (Holder) Phymep 64-0997 Expelling
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich (Merck) S7907 Histochemical revelation
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich (Merck) S8282 Histochemical revelation
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich (Merck) P6148 Histochemical revelation
Triton X-100 Sigma-Aldrich (Merck) X100 Histochemical revelation
Gelatin from cold water fish skin Sigma-Aldrich (Merck) G7041 Histochemical revelation
Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate ThermoFisher Scientific S11223 Histochemical revelation
24-well plate Greiner Bio-One 662160 Histochemical revelation
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References

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Citer Cet Article
Devienne, G., Le Gac, B., Piquet, J., Cauli, B. Single Cell Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction After Patch-clamp. J. Vis. Exp. (136), e57627, doi:10.3791/57627 (2018).
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