Este protocolo describe los pasos críticos y precauciones necesarias para realizar la célula multiplex transcripción reversa reacción en cadena polimerasa después de patch-clamp. Esta técnica es un método simple y eficaz para analizar el perfil de expresión de un conjunto predeterminado de genes de una sola célula caracterizada por grabaciones de patch-clamp.
La corteza cerebral está compuesta por numerosos tipos celulares exhibe varias características morfológicas, fisiológicas y moleculares. Esta diversidad dificulta la identificación y caracterización de estos tipos de celulares, requisitos previos para el estudio de sus funciones específicas. Este artículo describe el protocolo de reacción en cadena (RT-PCR) multiplex unicelular transcripción reversa polimerasa, que permite, después de patch-clamp en rebanadas, para detectar simultáneamente la expresión de decenas de genes en una sola celda. Este sencillo método puede aplicarse con caracterización morfológica y es ampliamente aplicable para determinar los rasgos fenotípicos del diversos tipos celulares y su entorno celular particular, como en las proximidades de los vasos sanguíneos. El principio de este protocolo es para registrar un celular con la técnica de patch-clamp, cosecha e invertir transcribir su contenido citoplásmico, y para detectar cualitativamente la expresión de un conjunto predefinido de genes por multiplex PCR. Requiere un diseño cuidadoso de la abrazadera del remiendo intracelular solución compatible con RT-PCR y primers PCR. Para asegurar una transcripción selectiva y confiable detección, esta técnica también requiere controles apropiados de citoplasma cosechar a pasos de amplificación. Aunque aquí debe ser estrictamente precauciones, prácticamente cualquier laboratorio electrofisiológico puede usar el múltiplex célula técnica de RT-PCR.
La corteza cerebral comprende numerosos tipos de células intervienen en diversos procesos fisiológicos. Su identificación y caracterización, un requisito previo para la comprensión de sus funciones específicas, pueden ser muy difíciles dada la gran diversidad morfológica, fisiológica y molecular que caracteriza los tipos de células corticales1 ,2,3,4.
Sola célula multiplex RT-PCR se basa en la combinación de técnicas de RT-PCR y abrazadera del remiendo. Puede probar al mismo tiempo la expresión de más de 30 genes predefinidos en células electrophysiologically identificados5. La inclusión de un trazador neuronal en la pipeta de grabación adicional permite la caracterización morfológica de las células registradas después de la revelación histoquímicas6,7,8,9, 10. es una técnica muy útil para la clasificación de tipos neuronales basados en análisis multivariado de sus rasgos fenotípicos5,9,10,11,12 ,13,14. Sola celda multiplex RT-PCR también se adapta a la caracterización de células no-neuronales tales como astrocytes15,16,17y puede aplicarse prácticamente a cada cerebro estructura18, 19,20,21,22,23 y célula tipo, asumiendo que pueden grabarse en configuración de celulares.
Esta técnica es muy conveniente para la identificación de fuentes celulares y/o objetivos de transmisión sistemas7,8,15,16,20,21, 24,25,26,27,28, especialmente cuando carecen de anticuerpos específicos. Se basa en grabaciones de patch-clamp de células identificados visualmente29y así también permite la segmentación de células en un entorno específico celular8,15,16. Además desde la Citoarquitectura del tejido de cerebro se conserva en rebanadas de cerebro, este enfoque también permite el estudio de las relaciones anatómicas de las células caracterizadas con elementos neuronales y no neuronales7,8 , 18.
Ya que esta técnica es limitada por la cantidad de citoplasma cosechada y por la eficacia de la RT, la detección de mRNA expresado en número de copias bajo puede ser difícil. Aunque otros enfoques basados en la tecnología RNaseq permiten analizar el transcriptoma conjunto de células3,4,30,31, que no necesariamente necesitan caros secuenciadores de alto rendimiento disponible en cada laboratorio. Puesto que la técnica de RT-PCR multiplex de unicelular utiliza PCR de punto final, sólo requiere termocicladores ampliamente disponibles. Puede desarrollarse fácilmente en laboratorios equipados con configuraciones electrofisiológicos y no requiere de equipo costoso. Puede proporcionar, dentro de un día, un análisis cualitativo de la expresión de un conjunto predefinido de genes. Por lo tanto, este enfoque ofrece un fácil acceso a la caracterización molecular de las células de una manera rápida.
Sola célula multiplex RT-PCR después de patch-clamp puede probar confiablemente y simultáneamente la expresión de más de 30 genes en células electrophysiologically identificados5. Análisis de expresión génica a nivel unicelular requiere iniciadores PCR altamente eficientes. Uno de los pasos más limitantes es la colección de contenido de la celda. Su eficiencia depende del diámetro de la punta de la pipeta de parche, que debe ser tan grande como sea posible mientras que el tamaño de ce…
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos al Dr. Alexandre Mourot sus comentarios sobre el manuscrito. Este trabajo fue financiado por becas de la Agence Nationale de la Recherche (ANR 2011 MALZ 01 003; ANR-15-CE16-0010 y ANR-17-CE37-0010-03), BLG es apoyado por becas de la Fondation pour la Recherche sur Alzheimer. Agradecemos la facilidad animal de los IBPS (París, Francia).
MACAW v.2.0.5 | NCBI | Multiple alignement for primer design | |
Dithiothreitol | VWR | 443852A | RT |
Random primers | Sigma-Aldrich (Merck) | 11034731001 | RT |
dNTPs | GE Healthcare Life Sciences | 28-4065-52 | RT and PCR |
RNasin Ribonuclease Inhibitors | Promega | N2511 | RT |
SuperScript II Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18064014 | RT |
Taq DNA Polymerase | Qiagen | 201205 | PCR |
Mineral Oil | Sigma-Aldrich (Merck) | M5904-5ML | PCR |
PCR primers | Sigma-Aldrich (Merck) | PCR / desalted and diluted at 200 µM | |
Tubes, 0.5 mL, flat cap | ThermoFisher Scientific | AB0350 | RT and PCR |
BT10 Series – 10 µL Filter Tip | Neptune Scientific | BT10 | RT and PCR |
BT20 Series – 20 µL Filter Tip | Neptune Scientific | BT20 | RT and PCR |
BT200 Series – 200 µL Filter Tip | Neptune Scientific | BT200 | RT and PCR |
BT1000 Series – 1000 µL Filter Tip | Neptune Scientific | BT1000.96 | RT and PCR |
DNA Thermal Cylcer | Perkin Elmer Cetus | PCR | |
Ethidium Bromide | Sigma-Aldrich (Merck) | E1510-10ML | Agarose gel electrophoresis |
Tris-Borate-EDTA buffer | Sigma-Aldrich (Merck) | T4415-1L | Agarose gel electrophoresis |
UltraPure Agarose | Life Technologies | 16500-500 | Agarose gel electrophoresis |
ΦX174 DNA-Hae III Digest | NEB (New England BioLabs) | N3026S | Agarose gel electrophoresis |
EDA 290 | Kodak | Agarose gel electrophoresis | |
Electrophoresis Power supply EPS 3500 | Pharmacia Biotech | Agarose gel electrophoresis | |
Midi Horizontal Elecrophoresis Unit Model SHU13 | Sigma-Aldrich (Merck) | Agarose gel electrophoresis | |
Smooth paper with satin appearance | Fisherbrand | 1748B | Patch clamp internal solution |
Potassium Hydroxyde | Sigma-Aldrich (Merck) | 60377 | Patch clamp internal solution |
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid | Sigma-Aldrich (Merck) | E3889 | Patch clamp internal solution |
HEPES | Sigma-Aldrich (Merck) | H4034 | Patch clamp internal solution |
Potassium D-gluconate | Sigma-Aldrich (Merck) | G4500 | Patch clamp internal solution |
Magnesium chloride solution | Sigma-Aldrich (Merck) | M1028 | Patch clamp internal solution |
5500 Vapor Pressure Osmometer | Wescor | Patch clamp internal solution | |
Biocytin | Sigma-Aldrich (Merck) | B4261 | Patch clamp internal solution |
Sucrose | Sigma-Aldrich (Merck) | S5016 | Slice preparation |
D-(+)-Glucose monohydrate | Sigma-Aldrich (Merck) | 49159 | Slice preparation |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich (Merck) | S6191 | Slice preparation |
Potassium chloride | Sigma-Aldrich (Merck) | 60128 | Slice preparation |
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich (Merck) | 31437-M | Slice preparation |
Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich (Merck) | S5011 | Slice preparation |
Magnesium chloride solution | Sigma-Aldrich (Merck) | 63069 | Slice preparation |
Calcium chloride solution | Sigma-Aldrich (Merck) | 21115 | Slice preparation |
Kynurenic acid | Sigma-Aldrich (Merck) | K3375 | Slice preparation |
Isoflurane | Piramal Healthcare UK | Slice preparation | |
VT 1000S | Leica Biosystems | 14047235613 | Slice preparation |
Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich (Merck) | H1009 | Patch Clamp set-up cleaning |
Thin Wall Glass Capillaries with filament | World Precision Instruments | TW150F-4 | Patch Clamp |
PP-83 | Narishige | Patch Clamp | |
Eppendorf Microloader | Eppendorf | 5242956003 | Patch Clamp |
BX51WI Upright microscope | Olympus | Patch Clamp | |
XC-ST70/CE CCD B/W VIDEO CAMERA | Sony | Patch Clamp | |
Axopatch 200B Amplifier | Molecular Devices | Patch Clamp | |
Digidata 1440 | Molecular Devices | Patch Clamp | |
pCLAMP 10 software suite | Molecular Devices | Patch Clamp | |
10 mL syringe | Terumo | SS-10ES | Expelling |
E Series with Straight Body (Holder) | Phymep | 64-0997 | Expelling |
Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich (Merck) | S7907 | Histochemical revelation |
Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich (Merck) | S8282 | Histochemical revelation |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich (Merck) | P6148 | Histochemical revelation |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich (Merck) | X100 | Histochemical revelation |
Gelatin from cold water fish skin | Sigma-Aldrich (Merck) | G7041 | Histochemical revelation |
Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate | ThermoFisher Scientific | S11223 | Histochemical revelation |
24-well plate | Greiner Bio-One | 662160 | Histochemical revelation |