패치 클램프 후 단일 셀 다중 반전 녹음 방송 연쇄 반응
Summary
이 프로토콜에는 중요 한 단계 및 패치 클램프 후 단일 셀 다중 반전 녹음 방송 연쇄 반응 하는 데 필요한 조치 설명 합니다. 이 기술은 패치 클램프 기록 특징 하나의 세포에서 유전자의 미리 결정 된 집합 식 프로 파일을 분석 하는 간단 하 고 효과적인 방법입니다.
Abstract
대뇌 피 질은 수많은 종류의 세포 다양 한 형태, 생리, 및 분자 기능을 전시로 구성. 이 다양성에는 쉽게 식별 하 고 이러한 세포 유형, 그들의 특정 기능을 공부 하는 전제의 지장을 초래할 수 있습니다. 이 문서에서는 다중 단일 셀 반전 녹음 방송 중 합 효소 연쇄 반응 (RT-PCR) 프로토콜을, 패치 클램프 조각, 기록 후 허용 하는 단일 셀에 유전자의 수만의 표현을 동시에 감지 하는 설명 합니다. 이 간단한 방법 형태학 상 특성을 구현할 수 있다 고 널리 혈관 주변 등 다양 한 세포 유형 및 그들의 특정 세포 환경 phenotypic 특성 결정에 적용 됩니다. 이 프로토콜의 원리 기록 하 패치 클램프 기술 수확 및 역방향 셀의 세포질 내용 녹음 이며 질적으로 감지 하 여 유전자의 미리 정의 된 집합의 표현 다중 PCR. PCR 뇌관 및 RT-PCR과 호환 세포내 패치 클램프 솔루션의 설계를 필요합니다. 선택적이 고 신뢰할 수 있는 증명서를 위해 탐지,이 기술은 또한 증폭 단계에 수확 하는 세포질에서 적절 한 컨트롤을 필요 합니다. 여기서 설명 하는 조치를 엄격 하 게 따라야 합니다, 하지만 거의 모든 electrophysiological 실험실 다중 단일 셀 RT-PCR 기법을 사용할 수 있습니다.
Introduction
대뇌 피 질에는 다양 한 생리 적 프로세스에 관련 된 수많은 셀 형식을 구성 되어 있습니다. 그들의 식별 및 특성화, 그들의 특정 기능에 대 한 이해를 전제 조건 매우 도전 수 대뇌 피 질의 세포 유형1 특징 큰 형태, 생리, 및 분자 다양성 부여 2,,34.
단일 셀 다중 RT-PCR 패치 클램프와 RT-PCR 기술의 결합을 기반으로 합니다. 그것은 동시에 electrophysiologically 확인 된 셀5에서 30 개 이상의 미리 정의 된 유전자의 표정을 프로브 수 있습니다. 기록 피 펫 추가에 신경 추적 프로그램의 포함 허용 조직화 학적인 계시6,7,,89, 후 기록 된 세포의 형태학 특성 10. 그것은 그들의 phenotypic 특성5,,910,11,12의 복수 변수 분석에 따라 신경 유형의 분류에 대 한 매우 유용한 기술입니다 ,,1314. 단일 셀 멀티플렉스 RT-PCR은 또한 이다15,,1617, 같은 비 신경 세포의 특성에 적합 하 고 거의 모든 뇌 구조18에 적용 될 수 있습니다. 19,20,21,22,23 및 셀 유형, 가정 그들은 전체 셀 구성에 기록 될 수 있습니다.
이 기술은 세포 소스의 식별 및 전송 시스템7,8,15,,1620,21, 목표에 대 한 매우 편리 하다 24,25,26,,2728, 특정 항 체 부족 하는 경우에 특히. 그것은 시각적으로 식별 된 셀29, 패치 클램프 기록에 의존 하며 따라서 또한 특정 세포 환경8,,1516셀을 대상으로 수 있습니다. 또한 뇌 조직의 cytoarchitecture 두뇌 분할 영역에 유지 됩니다, 이후이 방법은 또한 수 있습니다 신경 및 비 신경 요소7,8 특징이 세포의 해부학 적 관계의 연구를 , 18.
이 기술은 수확된 세포질의 크기와 RT의 효율에 의해 제한 된 있기 때문에, 낮은 복사 번호에서 표현 하는 mRNA의 검출은 어려울 수 있습니다. RNaseq 기술에 따라 다른 접근 분석 하는 단 세포3,4,,3031, 전체 transcriptome 있게 비록 그들은 반드시 높은 처리량 비싼 시퀀서 필요 모든 실험실을 사용할 수 있습니다. 단일 셀 다중 실시간 PCR 기술을 사용 하므로 끝점 PCR, 그것만 널리 thermocyclers를 요구 한다. 그것은 실험실을 갖춘 electrophysiological 설정에서 쉽게 개발 될 수 있다 하 고 비싼 장비가 필요 하지 않습니다. 그것은 제공할 수 있습니다, 어느 날, 내 유전자의 미리 정의 된 집합의 식에 대 한 질적 분석. 따라서,이 방법은 신속한 방식으로 단일 세포의 분자 특성에 대 한 쉬운 액세스를 제공합니다.
Protocol
동물을 사용 하 여 모든 실험 절차 프랑스 규정 (코드 농촌 R214/87 R214/130)에 따라에서 수행 했다 및 유럽 경제 공동체 (86/609/EEC) 및 프랑스 국가 헌장의 윤리 지침을 준수 동물 실험의 윤리. 모든 프로토콜 찰스 다윈 윤리 위원회에 의해 승인 하 고 교육 및 연구 (승인 2015 061011367540)의 프랑스 정부에 제출 했다. IBPS 동물 시설 (A75-05-24) 프랑스 당국에 의해 공인 됩니다. 1. 예비 고려 ?…
Representative Results
멀티플렉스 RT-PCR의 대표 유효성 검사는 그림 3에 표시 됩니다. 프로토콜은 12 다른 유전자의 표현을 동시에 조사 하도록 설계 되었습니다. 기공을 글루타민 산 염 운송업 자 vGluT1 glutamatergic 신경42에 대 한 긍정적인 제어로 찍은. GABA 합성 효소 (GAD65와 갓 67), Neuropeptide Y (NPY), 및 Somatostatin (SOM) GABAergic 수3,,…
Discussion
단일 셀 다중 RT-PCR 후 패치 클램프 동시에 하 고 확실 하 게 electrophysiologically 확인 된 셀5에서 30 개 이상의 유전자의 표현을 조사할 수 있습니다. 단일 셀 수준에서 유전자 발현을 분석 고효율 PCR 뇌관을 요구 한다. 가장 제한 단계 중 하나를 셀의 내용의 모음입니다. 그것의 효율성은 셀 크기를 일치 하는 동안 가능한 한 크게 해야 패치 피 펫 팁의 직경에 따라 다릅니다. 1-2 µ m 오…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
원고에 대 한 그의 의견에 감사 박사 알렉산더 Mourot 하 고. 이 작품은 직원 회 드 라 검색 (ANR 2011 MALZ 003 01;에서 교부 금에 의해 지원 되었다 ANR-15-CE16-0010 고 ANR-17-CE37-0010-03), BLG Fondation 부 라 검색 르 츠에서에서 친교에 의해 지원 됩니다. 우리는 IBPS (파리, 프랑스)의 동물 시설 감사.
Materials
| MACAW v.2.0.5 | NCBI | Multiple alignement for primer design | |
| Dithiothreitol | VWR | 443852A | RT |
| Random primers | Sigma-Aldrich (Merck) | 11034731001 | RT |
| dNTPs | GE Healthcare Life Sciences | 28-4065-52 | RT and PCR |
| RNasin Ribonuclease Inhibitors | Promega | N2511 | RT |
| SuperScript II Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18064014 | RT |
| Taq DNA Polymerase | Qiagen | 201205 | PCR |
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich (Merck) | M5904-5ML | PCR |
| PCR primers | Sigma-Aldrich (Merck) | PCR / desalted and diluted at 200 µM | |
| Tubes, 0.5 mL, flat cap | ThermoFisher Scientific | AB0350 | RT and PCR |
| BT10 Series – 10 µL Filter Tip | Neptune Scientific | BT10 | RT and PCR |
| BT20 Series – 20 µL Filter Tip | Neptune Scientific | BT20 | RT and PCR |
| BT200 Series – 200 µL Filter Tip | Neptune Scientific | BT200 | RT and PCR |
| BT1000 Series – 1000 µL Filter Tip | Neptune Scientific | BT1000.96 | RT and PCR |
| DNA Thermal Cylcer | Perkin Elmer Cetus | PCR | |
| Ethidium Bromide | Sigma-Aldrich (Merck) | E1510-10ML | Agarose gel electrophoresis |
| Tris-Borate-EDTA buffer | Sigma-Aldrich (Merck) | T4415-1L | Agarose gel electrophoresis |
| UltraPure Agarose | Life Technologies | 16500-500 | Agarose gel electrophoresis |
| ΦX174 DNA-Hae III Digest | NEB (New England BioLabs) | N3026S | Agarose gel electrophoresis |
| EDA 290 | Kodak | Agarose gel electrophoresis | |
| Electrophoresis Power supply EPS 3500 | Pharmacia Biotech | Agarose gel electrophoresis | |
| Midi Horizontal Elecrophoresis Unit Model SHU13 | Sigma-Aldrich (Merck) | Agarose gel electrophoresis | |
| Smooth paper with satin appearance | Fisherbrand | 1748B | Patch clamp internal solution |
| Potassium Hydroxyde | Sigma-Aldrich (Merck) | 60377 | Patch clamp internal solution |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid | Sigma-Aldrich (Merck) | E3889 | Patch clamp internal solution |
| HEPES | Sigma-Aldrich (Merck) | H4034 | Patch clamp internal solution |
| Potassium D-gluconate | Sigma-Aldrich (Merck) | G4500 | Patch clamp internal solution |
| Magnesium chloride solution | Sigma-Aldrich (Merck) | M1028 | Patch clamp internal solution |
| 5500 Vapor Pressure Osmometer | Wescor | Patch clamp internal solution | |
| Biocytin | Sigma-Aldrich (Merck) | B4261 | Patch clamp internal solution |
| Sucrose | Sigma-Aldrich (Merck) | S5016 | Slice preparation |
| D-(+)-Glucose monohydrate | Sigma-Aldrich (Merck) | 49159 | Slice preparation |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich (Merck) | S6191 | Slice preparation |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich (Merck) | 60128 | Slice preparation |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich (Merck) | 31437-M | Slice preparation |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich (Merck) | S5011 | Slice preparation |
| Magnesium chloride solution | Sigma-Aldrich (Merck) | 63069 | Slice preparation |
| Calcium chloride solution | Sigma-Aldrich (Merck) | 21115 | Slice preparation |
| Kynurenic acid | Sigma-Aldrich (Merck) | K3375 | Slice preparation |
| Isoflurane | Piramal Healthcare UK | Slice preparation | |
| VT 1000S | Leica Biosystems | 14047235613 | Slice preparation |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich (Merck) | H1009 | Patch Clamp set-up cleaning |
| Thin Wall Glass Capillaries with filament | World Precision Instruments | TW150F-4 | Patch Clamp |
| PP-83 | Narishige | Patch Clamp | |
| Eppendorf Microloader | Eppendorf | 5242956003 | Patch Clamp |
| BX51WI Upright microscope | Olympus | Patch Clamp | |
| XC-ST70/CE CCD B/W VIDEO CAMERA | Sony | Patch Clamp | |
| Axopatch 200B Amplifier | Molecular Devices | Patch Clamp | |
| Digidata 1440 | Molecular Devices | Patch Clamp | |
| pCLAMP 10 software suite | Molecular Devices | Patch Clamp | |
| 10 mL syringe | Terumo | SS-10ES | Expelling |
| E Series with Straight Body (Holder) | Phymep | 64-0997 | Expelling |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich (Merck) | S7907 | Histochemical revelation |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich (Merck) | S8282 | Histochemical revelation |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich (Merck) | P6148 | Histochemical revelation |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich (Merck) | X100 | Histochemical revelation |
| Gelatin from cold water fish skin | Sigma-Aldrich (Merck) | G7041 | Histochemical revelation |
| Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate | ThermoFisher Scientific | S11223 | Histochemical revelation |
| 24-well plate | Greiner Bio-One | 662160 | Histochemical revelation |
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Citer Cet Article
Devienne, G., Le Gac, B., Piquet, J., Cauli, B. Single Cell Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction After Patch-clamp. J. Vis. Exp. (136), e57627, doi:10.3791/57627 (2018).