Summary
نقدم هنا، وضع بروتوكول للسماح للقياس الكمي الدقيق من الميتوكوندريا الحمض النووي (متدنا) مثلايشن. في هذا البروتوكول، يصف لنا هضم الأنزيمي للحمض النووي مع بامهي مقترنة بخط أنابيب تحليل bioinformatic التي يمكن استخدامها لتجنب المبالغة في تقدير مستويات مثلايشن متدنا الناجم عن هيكل متدنا الثانوية.
Abstract
التحديد الكمي للحمض النووي مثلايشن يمكن تحقيقه باستخدام تسلسل بيكبريتيت، الذي يستفيد من ممتلكات بيكبريتيت الصوديوم تحويل أونميثيلاتيد السيتوزين اليوراسيل، في سياق الحمض النووي واحد-الذين تقطعت بهم السبل. يمكن أن يكون تسلسل بيكبريتيت المستهدفة (باستخدام PCR) أو تنفيذها على الجينوم كله ويوفر الكمي المطلق مثلايشن السيتوزين في القاعدة-قرار واحد. نظراً للطابع المميز للحمض النووي--والميتوكوندريا، لا سيما في هيكل الثانوية، ينبغي أدابتيونس بيكبريتيت يسلسل طرق التحقيق مثلايشن السيتوزين في متدنا. هيكل التعليم الثانوي والعالي من متدنا يمكن أن يؤدي في الواقع إلى بيكبريتيت تسلسل القطع الأثرية المؤدية إلى إيجابيات كاذبة بسبب وصول الفقراء تمسخ ناقصة بيكبريتيت الحمض النووي واحد-الذين تقطعت بهم السبل. هنا، يمكننا وصف بروتوكول باستخدام هضم الأنزيمي للحامض النووي مع بامهي مقترنة بأنابيب تحليل بيوينفورماتيك للسماح بالقياس الكمي الدقيق من السيتوزين مستويات مثلايشن في متدنا. وبالإضافة إلى ذلك، يمكننا توفير مبادئ توجيهية لتصميم كبسولة تفجير تسلسل بيكبريتيت محددة إلى متدنا، تفاديا لاستهداف شرائح "النووية المتقدرية" غير مرغوب فيها (نومتس) إدراج الجينوم النووي.
Introduction
الجينوم المتقدرية بنية دائرية، مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل من حوالي 16.5-كيلو قاعدة (kb) منذ فترة طويلة، يشكل حبلا خفيفة وثقيلة. جينوم المتقدرية موجود في نسخ متعددة داخل كل خلية، الأمهات-الموروثة، وترميز المكونات الأساسية ل مجمعات سلسلة التنفس1. مماثلة للجينوم البكتيري وخلافا للجينوم النووي، الجينوم المتقدرية هو نظمت في عدة هياكل التعليم الثانوي والعالي، كما هو الحال في هياكل ملفوف وسوبيركويليد2، التي يمكن أن تجعل الوصول الصعب أثناء تسلسل 3من التجارب.
في النواة، مثلايشن من الحمض النووي هو علامة جينية درس على نطاق واسع أن يؤدي دوراً في عمليات عديدة، ولا سيما في تنظيم التعبير الجيني. في جينومات الثدييات، مثلايشن الحمض النووي يحدث أساسا في 5-موقف حلقة بيريميدين ديوكسيسيتيدينيس، معظمهم في دينوكليوتيديس الفريق الاستشاري (أو الدليل). يوجد مثلايشن السيتوزين في 70 في المائة من جميع البد في الجينوم من خلايا جسدية وحسابات ~ 1 في المائة من مجموع قواعد الحمض النووي4. ميثيليشنز الحمض النووي قد وصفت أيضا في سياقات غير المعبأة، مثل اتفاق السلام الشامل ولجنة مناهضة التعذيب، والحزب الشيوعي الصيني، وتوجد بكميات مختلفة في الحمض النووي، بقيم تصل إلى 25 في المائة من جميع سيتوسينيس ميثليته في الخلايا الجذعية الجنينية5،،من67.
بينما مثلايشن السيتوزين الجينوم النووي مقبول على نطاق واسع، وجود الميتوكوندريا الحمض النووي (متدنا) مثلايشن لا تزال مثيرة للجدل. مثلايشن متدنا التحقيق الأولى دراسة أجريت في الخلايا المستزرعة حيث سهولة تم اكتشاف مثلايشن متدنا، على الرغم من أن مستويات أدنى بالمقارنة مع الحمض النووي8. في الخلايا البشرية وموريني، اكتشفت أيضا مثلايشن متدنا عند مستويات منخفضة (2-5%). استخدام فحوصات الاعتماد على التقاط ميثيلسيتوسيني 5 مثل ميثليته الحمض النووي إيمونوبريسيبيتيشن (مدب) تليها PCR الكمي، مثلايشن متدنا واكتشفت أيضا في مختلف الماوس والإنسان وخلايا خطوط9،10، 11،12. استخدام الأجسام المضادة ضد 5-ميثيلسيتوسيني في تحليل إليزا أو الكتلي، تم الكشف عن مستويات كبيرة من الحمض النووي مثلايشن من الكسور المتقدرية المنقي13،،من1415، 16-ومع ذلك، يستخدم معظم فحوصات في الدراسات السالفة الذكر التقنيات التي لم تصمم لتقديم التقدير الكمي المطلق مثلايشن الحمض النووي في القاعدة واحدة-القرار.
تحليل كمي مثلايشن الحمض النووي يمكن أن يتحقق بأسلوب المسمى "بيكبريتيت التسلسل"، الذي يستفيد من ممتلكات بيكبريتيت الصوديوم تحويل أونميثيلاتيد السيتوزين اليوراسيل في واحد--الذين تقطعت بهم السبل الحمض النووي سياق17 . باستخدام تسلسل بيكبريتيت، كشف كوكبة من الدراسات عن وجود مثلايشن السيتوزين على مختلف المستويات. واكتشفت متدنا مثلايشن في منطقة د-حلقة أو 12S منطقة 16S سهولة في البشرية18،19،20،21،،من2223 والماوس24 الأنسجة والخلايا، ولكن مع التقلبات مثيرة للاهتمام، من 1-20% من مجموع سيتوسينيس عبر الدراسات.
بالمقارنة مع العديد من هذه الدراسات، المتنازع عليها وجود متدنا مثلايشن3،25،،من2627 سوى عدد قليل من الدراسات، بما في ذلك من مجموعتنا، أو يتشكك في صلة بيولوجية مستويات منخفضة جداً من متدنا مستويات (أقل من 2%)28. في الآونة الأخيرة، أبلغنا بمراقبة قطعة أثرية بيكبريتيت-تسلسل المحتملة في تسلسل بيكبريتيت المتقدرية كله3. وقدمنا الأدلة الثانوية بنية الحمض النووي يمكن أن تؤدي إلى إيجابيات كاذبة في تسلسل بيكبريتيت، يمثلهم وبالتالي مستويات مثلايشن. نحن نقدم هنا بروتوكولا لمنع قطعة أثرية من بيكبريتيت-تحويل متدنا. يستخدم هذا البروتوكول هضم الأنزيمي بسيطة من الحمض النووي لتعطيل الهياكل الثانوية متدنا والسماح بالوصول الكامل إلى بيكبريتيت عقب بيكبريتيت تسلسل بروتوكول. وبالإضافة إلى ذلك، نحن نقدم خط أنابيب بيوينفورماتيك مصاحبة لتحليل تسلسل بيكبريتيت.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-إنزيم التقييد في المعاملة
- لينيريزي متدنا بمعاملة مجموع الحمض النووي البشري مع إنزيم التقييد بامهي، أن التخفيضات في موقف 14258 في الحمض النووي الإنسان.
ملاحظة: للماوس الحمض النووي، واستخدام إنزيم التقييد بجليي تحت ظروف مماثلة أدناه. - لكل عينة حيث يتم مثلايشن متدنا لتقييم وإعداد أنبوب رد فعل 0.2 مل واحد وإضافة التالية ميكس: 3 ميكروغرام المجينية الحمض النووي (الكمية حسب فلوروميتري)، 15 ميكروليتر المخزن المؤقت 3، 3 ميكروليتر بامهي والمياه تصل إلى 150 ميكروليتر
- ضع الأنابيب في cycler حرارية ح 4 في 37 درجة مئوية.
2-بيكبريتيت التحويل
- تحويل الحمض النووي بامهي معاملة استخدام بيكبريتيت الصوديوم كما هو موضح في مكان آخر من29.
- استخدام 200-500 نانوغرام بامهي-التعامل مع الحمض النووي لكل رد فعل التحويل في إجمالي حجم 20 ميكروليتر. أن استعادة الحمض النووي هي 50-70%.
- الوت الحمض النووي بيكبريتيت تحويلها في 10 ميكروليتر شطف العازلة.
- تحديد كمية الحمض النووي واحد-الذين تقطعت بهم السبل التي فلوروميتري.
- اختياري: تخزين بيكبريتيت تحويل الحمض النووي في-20 درجة مئوية قبل الشروع في ما تبقى من البروتوكول. للتخزين على المدى الطويل، تخزين بيكبريتيت تحويل الحمض النووي في-80 درجة مئوية
3-تصميم بيكبريتيت ترتيب الإشعال
- تصميم كبسولة تفجير لتسلسل بيكبريتيت استخدام أدوات الإنترنت ميثبريمير30 و31،بيسيرتش32.
ملاحظة: تسمح ميثبريمير وبيسيرتش للبحث عن تسلسل الملزمة التمهيدي على تسلسل الجينوم حيث يتم تحويل سيتوسينيس إلى ثيمينيس، وبالمثل إلى بيكبريتيت بعد انتهاء العلاج. - للتضخيم الأمثل وغير منحازة، تجنب دينوكليوتيديس البد في كبسولة تفجير وتصميم حجم amplicon بين 100-300 بي بي.
- التأكد من وجود كبسولة تفجير تصميم محددة للحمض النووي استخدام الدالة بيسيرتش البحث التمهيدي. إدراج الإشعال بيكبريتيت مصممة بالفعل تحويل ووضع علامة في المربع بيكبريتيت وتشمل جينوم مرجع ومعلمات PCR.
ملاحظة: سيتم عرض قائمة بمنتجات PCR ممكن. - نسخ الأعلى تسلسل التمهيدي 1-5 ولصقها في نموذج طلب لتوليف اليغنوكليوتيد.
ملاحظة: قائمة بالإنسان ويتم عرض تسلسل التمهيدي متدنا الماوس التي قد تم التحقق من صحتها في المختبر في الجدول 1. - تحويل اختبار كبسولة تفجير باستخدام بيكبريتيت PCR بعد [اغروس] هلام التفريد كما هو موضح في الخطوة 4. اختبار وتحسين أزواج التمهيدي كل على حدة والتأكد من حجم amplicon الصحيح يظهر على [اغروس] هلام.
ملاحظة: إذا كان هناك حاجة إلى أجهزة الإشعال المتنوعة، إضافة كبسولة تفجير متعددة لأحد واحد تفاعل PCR وتصور منتجات PCR على [اغروس] هلام التفريد، أو أسلوب أكثر مثل التفريد polyacrylamide هلام، لتمييز منتجات مماثلة الحجم.
4-بيكبريتيت تحويل بكر واستخراج هلام
- لتضخيم المناطق ذات الاهتمام، أداء PCR استخدام بوليميريز بوليميراز بداية ساخنة. بإيجاز، تحويل مزيج 100 نانوغرام الحمض النووي، 500 ميكرومتر كبسولة تفجير الشعور والإحساس بمكافحة ومزيج دنتب 1 ميليلتر (10 ميكرون لكل دنتب) وبوليميراز في 7.5 يو/رد فعل في إجمالي حجم 50 ميليلتر. "بكر تشغيل" مع الشروط التالية: 5 دقيقة عند 95 درجة مئوية (60 s 94 درجة مئوية؛ 60 s 55 ° C *؛ 60 s 72 درجة مئوية)
دورات 35؛ 10 دقيقة 72 درجة مئوية. استخدام كبسولة تفجير أما بشكل منفصل أو متعدد. - اختياري: عند الإرسال المتعدد الإشعال، استخدام 200 نانوغرام تحويل الحمض النووي وركوب الدراجات الشروط التالية: 5 دقيقة 95 درجة مئوية (60 s 94 درجة مئوية؛ 90 s 55 ° C *؛ 90 s 72 درجة مئوية) دورات 35؛ 10 دقيقة 72 درجة مئوية.
ملاحظة: قد تختلف درجة الحرارة اعتماداً على درجة حرارة ذوبان الإشعال. - تخضع منتجات PCR جل التفريد على [اغروس] 2% على 100 فولت.
- تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية لطيف، استخراج منتجات PCR مع مشرط، وإضافة إلى microtubes. لا تعرض منتجات PCR لضوء الأشعة فوق البنفسجية المفرط لتجنب إتلاف الحمض النووي. تجنب وقت التعريض أكثر من 30 ثانية.
- تنقية منتجات PCR باستخدام هلام التطهير كما هو موضح سابقا3.
- التحديد الكمي لتنقية الحمض النووي من الخطوة 4، 5 باستخدام فلوروميتري. انتقل إلى الخطوة 5 أو تخزين عينات من-20 درجة مئوية.
دورات 35؛ 10 دقيقة 72 درجة مئوية. استخدام كبسولة تفجير أما بشكل منفصل أو متعدد.5-بيكبريتيت تسلسل إعداد المكتبة
- القيام بإعداد المكتبة لتحويل بيكبريتيت منتجات PCR.
اختياري: متعدد المنتجات بكر في هذه المرحلة. - إجراء الإصلاح نهاية استخدام يصل إلى 100 نانوغرام منتج PCR. إضافة 3 ميليلتر نهاية إنزيم الإعدادية وميليلتر 6.5 نهاية إصلاح رد فعل المخزن المؤقت (10 x) للمنتج بكر ميليلتر 55.5 في أنبوب 0.2 مل. ضع واحتضان أنبوب في cycler حرارية لمدة 30 دقيقة عند 20 درجة مئوية تليها 30 دقيقة عند 65 درجة مئوية.
- سد محولات التسلسل بخلط الحمض النووي إصلاحه نهاية مع 15 ميليلتر بلانت/تا ليجاسى ميكس، ميليلتر 2.5 محول ومحسن ربط ميليلتر 1. في حالة استخدام < 100 نانوغرام PCR المنتج كمدخل، تمييع محول 10 مرات.
- ضع المزيج (الخطوة 5.3) في cycler حرارية واحتضان 15 دقيقة عند 20 درجة مئوية. وقفه cycler الحرارية وإضافة 3 ميليلتر المستخدم الإنزيم إلى الأنبوب. خلط ووضع الأنبوب في cycler الحرارية واحتضان 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
- حدد حجم الحمض النووي محول متصلة باستخدام الخرز التثبيت عكسها المرحلة الصلبة (سبري) بنسب متفاوتة من حبات للحمض النووي تبعاً لحجم المنتج PCR.
- أضف 13.5 ميليلتر ح2س متصلة محول الحمض النووي من الخطوة 5-4 و 55 ميليلتر حراكه سبري الخرز. احتضان في درجة حرارة الغرفة للأنبوبة 5 دقيقة ومكان على الوقوف مغناطيسية. عندما يكون الحل واضح، نقل المادة طافية إلى أنبوب جديد وتجاهل أنبوب يحتوي على الخرز.
ملاحظة: المادة طافية تحتوي على الحمض النووي محول متصلة والأجزاء غير المرغوب فيها كبير بد أن الخرز المهملة. - إضافة 25 ميليلتر حراكه سبري الخرز إلى المادة طافية من الخطوة 5، 6، وخلط واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ضع الأنبوب على الوقوف المغناطيسية وتجاهل المادة طافية عند الحل الواضح.
ملاحظة: تتضمن المادة طافية المهملة الحمض النووي غير المرغوب فيه، بينما يرتبط الحمض النووي متصلة محول الخرز. - بينما الأنبوب على الوقوف المغناطيسي، إضافة 200 الإيثانول 80% ميليلتر (طازج) لغسل الخرز. احتضان 30 ثانية، وإزالة وتجاهل المادة طافية. كرر هذه الخطوة لما مجموعة 2 يغسل.
- حبات الهواء الجاف لمدة 5 دقائق في حين الأنبوب في موقف المغناطيسي مع غطاء مفتوحة.
- إزالة الأنبوب من المغناطيس، الوت الحمض النووي في المخزن المؤقت شطف ميليلتر 23 ومزيج. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 دقيقة.
- ضع الأنبوب على الوقوف مغناطيسي وعندما الحل واضح، نقل 2 ميليلتر للوحة بكر 96-جيدا للتضخيم PCR قبل (الخطوة 5.14).
- نقل ميليلتر حوالي 21 الباقي إلى أنبوب 0.2 مل جديد للتضخيم بكر (الخطوة 5.17).
ملاحظة: يجب التأكد من عدم نقل أي حبات الخرز يمكن أن تثبط التفاعلات الانزيمية للخطوات المقبلة. - انتقل إلى الخطوة 5.14 أو تخزين عينات من-20 درجة مئوية.
- إجراء PCR قبل التضخيم ب RT-qPCR لتقدير عدد الدورات اللازمة لتضخيم الحمض النووي محول متصلة. كل رد فعل، إضافة ما يلي في بكر 96-جيدا لوحة تحتوي على الحمض الخلوي الصبغي 2 ميليلتر (الخطوة 5.11): 0.4 ميليلتر الفهرس التمهيدي، ميليلتر العالمية 0.4 PCR التمهيدي، 7.2 ميليلتر ح2س، 10 ميليلتر RT-قبكر ميكس الرئيسي.
- ضع اللوحة في جهاز PCR الوقت الحقيقي واللوحة رهنا بالشروط التالية: 30 ثانية عند 98 درجة مئوية (10 s 98 درجة مئوية؛ 75 s 65 درجة مئوية) دورات 20؛ 5 دقيقة 65 درجة مئوية.
- تقدير عدد دورات التضخيم اللازم لكل عينة بطرح قيمة الأشعة المقطعية واحدة Ct-قيمة التضخيم قبل RT-قبكر الموافق لنهاية المرحلة الخطية لتفاعل PCR.
- تضخيم الحمض النووي من الخطوة 5.12 محول متصلة بخلط: الحمض النووي ميليلتر 21، 25 ميليلتر بكر ميكس الرئيسية، 1 ميليلتر الفهرس التمهيدي، 1 ميليلتر "بكر العالمي" التمهيدي وسين ميليلتر 2 ح2 Cycler حرارية، تخضع كل عينة على الشروط التالية: 30 ثانية عند 98 درجة مئوية (10 s 98 درجة مئوية؛ 75 s 65 درجة مئوية) دورات [Ct المحسوبة من الخطوة 5، 16]؛ 5 دقيقة 65 درجة مئوية.
ملاحظة: تذكر لاستخدام واحد الفهرس التمهيدي كل عينة فقط للسماح للإرسال المتعدد. يتم إدراج الفهرس أثناء ال [بكر]. - تنقية تضخيم "الحمض النووي سبري" الخرز والوت في المخزن المؤقت شطف ميليلتر 22.
- مراقبة نوعية المكتبة بأسلوب جل التفريد أو بديل. ابحث عن مكتبة الصحيح ذروة الأحجام (حجم المنتج (المنتجات) PCR بالإضافة إلى محول).
- تقدير متوسط حجم قاعدة بين زوج من المنتج مكتبة عن طريق تحليل لطاخة: في إعدادات عمومية متقدمة، انقر نقراً مزدوجاً فوق "الجدول" إطار تحليل اللطاخة. تعريف المنطقة من شركة بريتيش بتروليوم 100-1000 ثم انقر فوق موافق. تحت الجدول المنطقة، تظهر المنطقة المحددة ويتم حساب متوسط حجم المكتبة (bp).
- تحديد المكتبات التي فلوروميتري. انتقل إلى الخطوة 6 أو مكتبات مخزن في-20 درجة مئوية.
6-القادم جيل التسلسل
- حساب تركيز نانومتر المكتبات باستخدام الصيغة:
- تمييع المكتبات إلى نانومتر نانومتر نفسه على تركيز مثلاً 2 (اختر 4 نانومتر، 2 نانومتر، 1 نانومتر، أو 0.5 نانومتر تبعاً لتركيزات المكتبة). تجمع جميع المكتبات لتحقيق مجموعة مكتبات شمال البحر الأبيض المتوسط 2.
- تؤذي وتمييع اتباع تسلسل الصك دليل المكتبات. باختصار: تجريدها تجمع شمال البحر الأبيض المتوسط 2 بإضافة 0.2 N هيدروكسيد الصوديوم واحتضان في درجة حرارة الغرفة للحد الأدنى 5 ديلوتى تجمع التشويه والتحريف إلى إضعاف نهائي من 10:00 م. تؤذي وتمييع مكتبة تحكم متاحة تجارياً إلى إضعاف نهائي 12:05 م. إلى أنبوب جديد، يخلط تجمع 10:00 م 20% 12:05 م مكتبة عنصر تحكم.
ملاحظة: التحويل بيكبريتيت يدخل التعقيد منخفضة جداً. 20% التحكم مكتبة سبايك-سيؤدي إلى في تسلسل نوعية أفضل. - تشغيل 150 bp إقران في نهاية تسلسل باستخدام أداة تسلسل عميق.
7-الحسابية التحليل-تقدير مستويات مثلايشن
- إنشاء ملفات.fastq (وتسمى هنا sample1_R1.fastq.gz و sample1_R2.fastq.gz)، وإنشاء فهرس بيسمارك الجينوم الكامل للفائدة (هنا في مجلد يسمى بيسماركينديكس) وتأكد من أن تسلسل الجينوم شرم متوفر في فاستا تنسيق (هنا في مجلد يسمى شرم).
- قبل عملية ما يلي لإزالة المحولات والتحيز التي أدخلها في كبسولة تفجير: استخدم أداة Trim_galore33. إزالة النيوكليوتيدات اثنين من 5 ' نهاية كل من يقرأ الأمام وعكس.
trim_galore-clip_R1 2-clip_R2 2-س./--إقران trim1-sample1_R1.fastq.gz sample1_R2.fastq.gz - قم بمحاذاة يقرأ المجهزة مسبقاً للجينوم الكامل استخدام بيسمارك34
بيسمارك-تتوافق-أم-س././بيسماركينديكس/-1./sample1_R2_val_2.fq.gz./sample1_R1_val_1.fq.gz-2
ملاحظة: إذا كان يتم استخدام راصفة آخر، تأكد من أن يتم تجاهل ما يلي: أن لا تكون محاذاة فريد. - استخراج يقرأ الخرائط كروموسوم م، هنا باستخدام سامتولس35
سامتولس فرز أم-l 0-O-o sample1_sorted.bam
sample1_R1_val_1_bismark_bt2_pe.bam
سامتولس فهرس sample1_sorted.bam
عرض سامتولس-يو sample1_sorted.bam شرم | سامتولس فرز أم-O-n-o sample1_chrM.bam - استخراج معلومات مثلايشن
bismark_methylation_extractor-س-CX-cytosine_report-شاملة-genome_folder-/./sample1_chrM.bam شرم - تستخدم في.bedGraph أو في.cov أو الملفات CX_report.txt لمزيد من التحليل. استخدام الملف sample1_chrM.CX_report.txt للتصور والاختبار.
- أداء القطع كذلك في الخطوة تجهيزها، إذا كان يتم استجوابه عدة مناطق وتحيز التمهيدي قد تكون مرئية في مؤامرات M-التحيز التي تم إنشاؤها أثناء التعيين. أرجع إلى وثائق بيسمارك للحصول على مزيد من المعلومات.
8-الحسابية التحليل-اختبار الفروق
- تأكد من أن الملف CX_report.txt يحتوي على 7 أعمدة، كروموسوم (شرم هنا)، والموقف، وحبلا، عدد القراءات ميثليته، عدد القراءات أونميثيلاتيد وسياق ج وتسلسل المحيطة بها، لكل ج على كروموسوم م.
- كما CX_report يغطي شرم في مجملها، التحقق من مجموعة فرعية إلى region(s) الذي يتم تضخيمه.
- استخدام الاختبارات غير حدودي للفروق بين العينات، مثل اختبار الصيادين الضبط للفرد ج أو علامة اختبار لمنطقة بأكملها.
ملاحظة: القياس الكمي سوف غالباً ما تكون قريبة من مثلايشن 0%، وهو السبب في افتراض الحالة الطبيعية غير الملائمة. - وبالمثل، للتصور، أما تصور قوانتيليس أو حساب فترات الثقة نسبة ثنائي الحد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
خطوتين في هذا البروتوكول الحاسمة عند التحقيق مثلايشن متدنا. 1) افتتاح هيكل الثانوية و 2) تصميم كبسولة تفجير الخاصة بالحمض النووي mitochondrial.
بهضم الحمض النووي الجينوم البشري مع إنزيم التقييد بامهي (الشكل 1)، سيتم قطع بنية الحمض النووي mitochondrial الموضع النوكليوتيدات 14,258 وسيتم فتح هيكل الثانوية.
الأضرار الممكنة بتحويل بيكبريتيت مع بنية سليمة متدنا ثانوية من المحتمل جداً أن نبالغ في تقدير معدل أونكونفيرسيون متدنا. بيكبريتيت التسلسل، معدل أونكونفيرسيون متدنا تم التحقيق فيها وفي عسر الهضم ويهضم مجموع الحمض النووي من الخلايا البشرية الهيكل العظمى والعضلات، وفي 5 مناطق مختلفة من الجينوم المتقدرية: حلقة التشرد (د-حلقة)، الحمض الريبي النووي النقال الريبوسوم فينيلألانين و 12S (الحمض الريبي النووي النقال-و + 12S)، 16S الريبوسوم (16)، NADH نازعة 5 (ND5) والجينات ترميز مرناً الفسفرة ب (سيتب) (الشكل 2). معدل أونكونفيرسيون تراوحت بين 0-15.1 في المائة في جميع المناطق التحقيق متدنا عسر الهضم. ومع ذلك، عندما كان يهضم الحمض النووي قبل التحويل بيكبريتيت، انخفض معدل أونكونفيرسيون بحد أقصى 1% في جميع المناطق (الشكل 3). وهكذا، توضح أهمية الهضم بامهي قبل التحويل بيكبريتيت لتجنب المبالغة في تقدير مستويات مثلايشن متدنا.
تلوث الحمض النووي أمر لا مفر منه عند عزل جينوم mitochondrial ومنذ تم نسخ تقريبا كامل الجينوم المتقدرية في الجينوم النووي، قد أدت إلى عمليات الإدراج النووية المتقدرية الجينوم ووصف النووي شرائح المتقدرية (نومتس)36. للتأكد من أن مستويات مثلايشن تحليل الحمض النووي مطابقة للحمض النووي ولا نومتس، أهمية الأبعد لتصميم أجهزة الإشعال الخاصة بالمجين المتقدرية. ويبين الشكل 4 كيفية التحقق من التحديد التمهيدي ويعرض الجدول 1 البشرية وتسلسلات التمهيدي متدنا الماوس.
| الاسم | التسلسل | موقف | حجم أمبليكون | درجة حرارة انلينغ | ضفيرة | ||
| البشرية | |||||||
| د-التكرار الحلقي | F: آآتكتاتكاكككتاتاك | ||||||
| R: جتجااتتتتتجتاتجاتجت | 6-298 | 292 | 55 درجة مئوية | أنتيسينسي | |||
| د-التكرار الحلقي | F: كاتاكاااااتتككاككااك | ||||||
| R: ججاااتاتجتجتاجت | 279-458 | 179 | 55 درجة مئوية | أنتيسينسي | |||
| 12S + TF | F: تتاتاتاكتاككتككتك | ||||||
| R: جتجتتجاتجتتجتتتتتتتج | 577-765 | 188 | 55 درجة مئوية | أنتيسينسي | |||
| 16S | F: آتااتتاتاجتتتتااتاتاات | ||||||
| R: تاكتاتاااتكتاكاتاتاكتاكتك | 2763-2873 | 110 | 53 درجة مئوية | معنى | |||
| سيتب | F: جتاتاتتتتتتجتتجتاتاتاجتا | ||||||
| R: ككتكااتتكاتااكتااتكتاتكك | 15091-15243 | 152 | 55 درجة مئوية | معنى | |||
| الماوس | |||||||
| 12S | F: أكاكاتاكااككتككاتااك | ||||||
| R: جاجتاتاتتاجتاات | 111-287 | 176 | 53 درجة مئوية | أنتيسينسي | |||
| 16S | F: آآتتككاتكتككااكاتاك | ||||||
| R: تتجاتتتتتتتتتاغت | 1749-1896 | 147 | 53 درجة مئوية | أنتيسينسي | |||
| سيتب | F: كتاكااااكاككتاتاكااك | ||||||
| R: أجتجتاتجتاجاااجا | 14129-14307 | 178 | 55 درجة مئوية | أنتيسينسي | |||
| 16S | F: أجاجااتاجاجتاتتتاتااتاج | ||||||
| R: كتااااكاااتتتااتكتاك | 2576-2727 | 151 | 55 درجة مئوية | معنى | |||
| الاستعراضات المتعمقة | F: تاجتاتاجتتجاتاتاجتجا | ||||||
| R: تاااكككتاتااااتاتاتككتاتا | 12659-12910 | 251 | 55 درجة مئوية | معنى | |||
| سيتب | F: تججتتتتتتتاجاجتتجتتا | ||||||
| R: كاتااااتاكتككاتاتتكااتتك | 14242-14504 | 262 | 55 درجة مئوية | معنى | |||
الجدول 1: تسلسل التمهيدي للإنسان والفأر متدنا. ملاحظة أن الصلب درجات الحرارة من [بكر] كبسولة تفجير تختلف نظراً للاختلافات في درجة حرارة ذوبان كبسولة تفجير.
الشكل 1 : جل التفريد الحمض النووي هضمها بامهي، أو عسر الهضم. الحمض النووي من الهيكل العظمى والعضلات البشرية دون علاج أو تعامل مع بامهي ح 4 في 37 درجة مئوية وتم تشغيل التفريد جل على 1.5% [اغروس] هلام. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : خريطة الجينوم البشري المتقدرية. يتم عرض مناطق الجينوم المتقدرية بيكبريتيت التسلسل والموقع بامهي إنزيم التقييد بالتحقيق. الحمض النووي يحتوي على 2 الريباسي الكشف مرناس 13 و 22 نقل الكشف. المختصرات: فH1: الثقيلة-حبلا المروج 1؛ فH2: تعزيز الثقيلة-ستراند 2؛ PL: المروج حبلا الخفيفة؛ أوه: أصل النسخ المتماثل من الثقيلة-حبلا؛ سلام: مصدر للنسخ المتماثل من الضوء-حبلا. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : بامهي الهضم قبل التحويل بيكبريتيت يقلل من معدل أونكونفيرسيون متدنا في خلايا العضلات الهيكلية البشرية. حسب تسلسل بيكبريتيت، تم استجواب عسر الهضم وهضمها mitochondrial DNA أونكونفيرسيون النسبة المئوية في خمس مناطق مختلفة لجينوم الميتوكوندريا في الخلايا البشرية الهيكل العظمى والعضلات (N= 3). المربع الكامل يمثل مواقع البد، ويمثل ساحة مفتوحة مواقع غير المعبأة. يتم عرض النتائج مع فاصل زمني دقيقة-ماكس واختبار علامة كان يستخدم لاختبار الفروق أونكونفيرسيون كبيرة. د-حلقة (6-298) P= 1.83E-42؛ د-حلقة (279-458): P= 4.55E-13؛ الحمض الريبي النووي النقال-و + 12S: P= 8.38E-16؛ 16S: P= 5.91E-06؛ ND5: P= 1.70E-05؛ سيتب: P= 2.69E-10. د-حلقة (6-298) أصل النسخ المتماثل والحمض الريبي النووي النقال-و + 12S تشمل حبلا الثقيلة المروج 2. هذه البيانات قد تم نشرها في أماكن أخرى 3. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 : استخدام بيسيرتش للتحقق من التحديد التمهيدي نحو الجينوم المتقدرية. A) تسلسل تحويل بيكبريتيت التمهيدي يتم إضافتها إلى الدالة بيسيرتش "البحث التمهيدي" (http://bisearch.enzim.hu/?m=genompsearch). مربع بيكبريتيت هو قليلاً، ومحددا جينوم مرجع. ب) مثال للمنتجات PCR المحتملة التي ولدت في سلاسل الإحساس و antisense. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا، نحن نقدم بروتوكول بيكبريتيت التسلسل الذي تم تصميمه خصيصا لاستجواب مثلايشن متدنا. الخلافات مع بيكبريتيت-تسلسل البروتوكولات المستخدمة للحمض النووي يكمن في الاستفادة من خطوة سابقة تقييد إنزيم هضم وتحليل بيوينفورماتيك الحزب الحاكم من الإيجابية الكاذبة الناجمة عن تسلسل نومت.
ونحن نقدم بروتوكولا لتجنب التحف بيكبريتيت التسلسل عند التحقيق مثلايشن متدنا. وكانت التحف تسلسل بيكبريتيت المؤدية إلى إيجابيات كاذبة سبق الإبلاغ عنها37. إزالة عدم كفاية البروتينات التبعي الحمض النووي من البروتيناز ك قد وصف37. تمسخ غير كاملة أو جزئية ريانيلينج يمكن أن يؤدي إلى الامتدادات التحويل غير مكتملة، وربما عن طريق خفض وصول بيكبريتيت إلى واحد--الذين تقطعت بهم السبل الحمض النووي37. يمكن أن يكون القطع الأثرية لاحقاً في اللعب في متدنا حيث بنية ثانوي سوف تنال من الوصول إلى سيتوسينيس. على حد علمنا، سجلت إضافة خطوة الهضم إنزيم التقييد قبل التحويل بيكبريتيت في السياق تقدير مثلايشن متدنا أولاً في عام 20163،28. في أيدينا جداً، خفضت الهضم السابقة مع إنزيم التقييد كتر واحد كبير الكشف عن3،سيتوسينيس غير محولة28.
هنا، نحن نقدم خط أنابيب بيوينفورماتيك لتحليل نتائج التسلسل بيكبريتيت والكشف عن التحف بيكبريتيت التسلسل في سياق تسلسل الجينوم كله المتقدرية بيكبريتيت. ينشأ هذا الأسلوب من ملاحظتنا أن متدنا معدل التحويل غير كان ارتباطاً عكسيا مع تسلسل عمق3،28. هذه الملاحظة تشير إلى أن هيكل التعليم الثانوي والتعليم العالي حتى متدنا يضعف تجزئة متدنا في مناطق معينة أثناء تشييد المكتبات التسلسل، ويمكن أن تعوق أيضا حق الوصول الكامل بيكبريتيت الصوديوم إلى متدنا. منذ الهضم مع إنزيم كتر واحد إصدارات هياكل التعليم الثانوي والعالي، النتائج التي توصلنا إليها تشير إلى أن هيكل متدنا مصدر بيكبريتيت قطعة أثرية والتحقق من صحة الأساليب الموضحة هنا للتحديد الكمي مثلايشن السيتوزين في متدنا.
أن التلوث لا مفر منه للحمض النووي في إعداد المتقدرية يشكل تحديا. وهذا يؤدي إلى التلوث في تسلسل نومت في ما يلي التسلسل، الذي قد تحيز تقدير مثلايشن السيتوزين في متدنا، حتى عند أداء مستهدفة وتسلسل الجينوم ليس كله المتقدرية بيكبريتيت. لتجنب مثل هذا التحيز، يسمح تصميم الإشعال تسلسل بيكبريتيت فريدة من نوعها لاستبعاد التلوث مع مثلايشن في نومتس. نومتس تمتد بعض المناطق للإنسان والجينوم المتقدرية الماوس مع هوية 100%، ومن المستحيل، ولذلك، تصميم كبسولة تفجير فريدة في بعض المناطق متدنا. عند القيام بالجينوم كله المتقدرية بيكبريتيت التسلسل، التسلسل الطويل ما يلي: يمكن أن تخفف من التمييز بين متدنا ونومتس. ضمان مواءمة ما يلي: الجينوم كله واستخدامه فقط يمكن كذلك ما يلي: تعيين فريد للجينوم المتقدرية الكشف عن مثلايشن متدنا.
وأخيراً، هذا البروتوكول يمكن استخدام خارج مورثات الميتوكوندريا، على سبيل المثال، في حالات أخرى لتسلسل بيكبريتيت حيث بنية الحمض النووي الثانوية يمثل مصدرا محتملاً للقطع الأثرية. يمكن أن يحقق الاقتران بين مستويات مثلايشن وعمق التسلسل تقييم الحاجة إلى هضم مع إنزيم التقييد قبل تسلسل بيكبريتيت تسلسل الحمض النووي المعقدة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب قد لا يوجد تضارب المصالح المالية تعلن.
Acknowledgments
نوفو نورديسك مؤسسة مركز أبحاث الأيض الأساسية مركز بحوث مستقلة في جامعة كوبنهاغن ممولة جزئيا من قبل منحة غير مقيد من مؤسسة نوفو نورديسك.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BamHI | New England BioLabs | # R0136 | |
| EZ DNA methylation-lightning kit | Zymo Research | # D5030 | |
| Qubit ssDNA assay | Thermo Fisher Scientific | # Q10212 | |
| Qubit assay tubes | Thermo Fisher Scientific | # Q32856 | |
| HotStarTaq plus DNA polymerase kit | Qiagen | # 203603 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | # 28704 | |
| NEBNext Ultra DNA Library Kit for Illumina | New England BioLabs | # E7370S | |
| NEBNext Multiplex Oligoes for Illumina | New England BioLabs | # E7335S | |
| AMPure XP Beads | Beckman Coulter | # A63881 | |
| High Sensitivity DNA chip | Agilent | # 5067-4626 | |
| Qubit high sensitivity dsDNA assay | Thermo Fisher Scientific | # Q33230 | |
| MiSeq reagent kit v2 300 cycles | Illumina | # MS-102-2003 | |
| PhiX control v3 | Illumina | # FC-110-3001 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | # S5881 | |
| Thermal cycler C1000 | Biorad | # 1851148 | |
| CFX96 Real-Time PCR detection system | Biorad | #1855195 | |
| Qubit Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | # Q33226 | |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent | # G2939BA | |
| MiSeq instrument | Illumina | # SY-410-1003 |
References
- Falkenberg, M., Larsson, N. -G., Gustafsson, C. M. DNA replication and transcription in mammalian mitochondria. Annu Rev Biochem. 76, 679-699 (2007).
- Kolesar, J. E., Wang, C. Y., Taguchi, Y. V., Chou, S. -H., Kaufman, B. A. Two-dimensional intact mitochondrial DNA agarose electrophoresis reveals the structural complexity of the mammalian mitochondrial genome. Nucleic Acids Res. 41 (4), e58 (2013).
- Mechta, M., Ingerslev, L. R., Fabre, O., Picard, M., Barres, R. Evidence Suggesting Absence of Mitochondrial DNA Methylation. Front Genet. 8, 166 (2017).
- Ehrlich, M., Gama-Sosa, M. A., et al. Amount and distribution of 5-methylcytosine in human DNA from different types of tissues of cells. Nucleic Acids Res. 10 (8), 2709-2721 (1982).
- Lister, R., Pelizzola, M., et al. Human DNA methylomes at base resolution show widespread epigenomic differences. Nature. 462 (7271), 315-322 (2009).
- Yan, J., Zierath, J. R., Barres, R. Evidence for non-CpG methylation in mammals. Exp Cell Res. 317 (18), 2555-2561 (2011).
- Patil, V., Ward, R. L., Hesson, L. B. The evidence for functional non-CpG methylation in mammalian cells. Epigenetics. 9 (6), 823-828 (2014).
- Nass, M. K. Differential methylation of mitochondrial and nuclear DNA in cultured mouse, hamser and virus trasnforemd hamser cells in vivo and in vitro methylation. J Mol Biol. 80 (1), 155-175 (1973).
- Shock, L. S., Thakkar, P. V., Peterson, E. J., Moran, R. G., Taylor, S. M. DNA methyltransferase 1, cytosine methylation, and cytosine hydroxymethylation in mammalian mitochondria. PNAS. 108 (9), 3630-3635 (2011).
- Bellizzi, D., D'Aquila, P., et al. The Control Region of Mitochondrial DNA Shows an Unusual CpG and Non-CpG Methylation Pattern. DNA Res. 20 (6), 537-547 (2013).
- Jia, Y., Li, R., et al. Maternal Low-Protein Diet Affects Epigenetic Regulation of Hepatic Mitochondrial DNA Transcription in a Sex-Specific Manner in Newborn Piglets Associated with GR Binding to Its Promoter. PLoS ONE. 8 (5), e63855 (2013).
- Jia, Y., Song, H., Gao, G., Cai, D., Yang, X., Zhao, R. Maternal Betaine Supplementation during Gestation Enhances Expression of mtDNA-Encoded Genes through D-Loop DNA Hypomethylation in the Skeletal Muscle of Newborn Piglets. J Agric Food Chem. 63 (46), 10152-10160 (2015).
- Infantino, V., Castegna, A., Iacobazzi, F., Spera, I. Impairment of methyl cycle affects mitochondrial methyl availability and glutathione level in Down's syndrome. Mol Genet Metab. 102 (3), 378-382 (2011).
- Chen, H., Dzitoyeva, S., Manev, H. Effect of valproic acid on mitochondrial epigenetics. Eur J Pharmacol. 690 (1-3), 51-59 (2012).
- Dzitoyeva, S., Chen, H., Manev, H. Effect of aging on 5-hydroxymethylcytosine in brain mitochondria. Neurobiol Aging. 33 (12), 2881-2891 (2012).
- Menga, A., Palmieri, E. M., et al. SLC25A26 overexpression impairs cell function via mtDNA hypermethylation and rewiring of methyl metabolism. FEBS J. 284 (6), 967-984 (2017).
- Frommer, M., McDonald, L. E., et al. A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands. PNAS. 89 (5), 1827-1831 (1992).
- Byun, H. -M., Panni, T., et al. Effects of airborne pollutants on mitochondrial DNA Methylation. Part Fibre Toxicol. 10 (1), 1 (2013).
- Janssen, B. G., Byun, H. -M., Gyselaers, W., Lefebvre, W., Baccarelli, A. A., Nawrot, T. S. Placental mitochondrial methylation and exposure to airborne particulate matter in the early life environment: An ENVIRONAGE birth cohort study. Epigenetics. 10 (6), 536-544 (2015).
- Zheng, L. D., Linarelli, L. E., et al. Insulin resistance is associated with epigenetic and genetic regulation of mitochondrial DNA in obese humans. Clin Epigenetics. 7 (1), 1739 (2015).
- Byun, H. -M., Colicino, E., Trevisi, L., Fan, T., Christiani, D. C., Baccarelli, A. A. Effects of Air Pollution and Blood Mitochondrial DNA Methylation on Markers of Heart Rate Variability. J Am Heart Assoc. 5 (4), (2016).
- Bianchessi, V., Vinci, M. C., et al. Mitochondrion. MITOCH. 27 (C), 40-47 (2016).
- Wijst, M. G. P., van Tilburg, A. Y., Ruiters, M. H. J., Rots, M. G. Experimental mitochondria-targeted DNA methylation identifies GpC methylation, not CpG methylation, as potential regulator of mitochondrial gene expression. Sci Rep. 7 (1), 177 (2017).
- Wong, M., Gertz, B., Chestnut, B. A., Martin, L. J. Mitochondrial DNMT3A and DNA methylation in skeletal muscle and CNS of transgenic mouse models of ALS. Front cellr Neurosci. 7, 279 (2013).
- Dawid, I. B. 5-methylcytidylic acid: absence from mitochondrial DNA of frogs and HeLa cells. Science. 184 (4132), 80-81 (1974).
- Gama-Sosa, M. A. Levels and distribution of 5-methylcytosine in Chordate DNA. , 1-201 (1985).
- Hong, E. E., Okitsu, C. Y., Smith, A. D., Hsieh, C. -L. Regionally specific and genome-wide analyses conclusively demonstrate the absence of CpG methylation in human mitochondrial DNA. Mol Cell Biol. 33 (14), 2683-2690 (2013).
- Liu, B., Du, Q., et al. CpG methylation patterns ofhuman mitochondrial DNA. Nature Publishing Group. , 1-10 (2016).
- Donkin, I., Versteyhe, S., et al. Obesity and Bariatric Surgery Drive Epigenetic Variation of Spermatozoa in Humans. Cell Metab. 23 (2), 369-378 (2016).
- Li, L. C., Dahiya, R. MethPrimer: designing primers for methylation PCRs. Bioinformatics. 18 (11), 1427-1431 (2002).
- Tusnády, G. E., Simon, I., Váradi, A., Arányi, T. BiSearch: primer-design and search tool for PCR on bisulfite-treated genomes. Nucleic Acids Res. 33 (1), e9 (2005).
- Arányi, T., Váradi, A., Simon, I., Tusnády, G. E.
- Krueger, F. Trim Galore!. , Available from: http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/ (2018).
- Krueger, F., Andrews, S. R. Bismark: a flexible aligner and methylation caller for Bisulfite-Seq applications. Bioinformatics. 27 (11), 1571-1572 (2011).
- Li, H., Handsaker, B., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
- Ramos, A., Barbena, E., et al. Nuclear insertions of mitochondrial origin: Database updating and usefulness in cancer studies. Mitochondrion. 11 (6), 946-953 (2011).
- Warnecke, P. M., Stirzaker, C., Song, J., Grunau, C., Melki, J. R., Clark, S. J. Identification and resolution of artifacts in bisulfite sequencing. Methods (San Diego, Calif). 27 (2), 101-107 (2002).
