Summary
여기, 우리는 미토 콘 드리 아 DNA (mtDNA) 메 틸의 정확한 정량화를 허용 하는 프로토콜을 제시. 이 프로토콜에서 우리 BamHI bioinformatic 분석 파이프라인 mtDNA의 이차 구조에 의해 발생 하는 mtDNA 메 틸 화 수준의 과대평가 방지 하는 데 사용할 수 있습니다와 결합으로 DNA의 효소 소화를 설명 합니다.
Abstract
DNA 메 틸 화의 정량화는 황산 시퀀싱, 단일 가닥 DNA 컨텍스트에서 uracil unmethylated 시 토 신을 변환할 나트륨 황산의 재산의 활용을 사용 하 여 얻을 수 있습니다. 중 아 황산 염 연속 수 대상 (PCR를 사용 하 여) 또는 전체 게놈에서 수행 하며 단일 기본 해상도에서 시 토 신 메 틸 화의 절대 정량화. 특히 이차 구조에에서 핵과 미토 콘 드리 아 DNA의 독특한 성격을 감안할 때, 조사에서 mtDNA 시 토 신 메 틸 화 황산 시퀀싱 방법의 적응 해야 한다. MtDNA의 2 차 및 3 차 구조 황산 황산 단일 가닥 dna의 불완전 한 변성 가난한 액세스 인해 가양성을 선도 하는 아티팩트를 시퀀싱 실제로 발생할 수 있습니다. 여기, 우리 사용 하 여 DNA의 효소 소화 BamHI bioinformatic 분석 파이프라인 함께 정확한 정량화의 시 토 신 메 틸 화 수준의 mtDNA에 있도록 하는 프로토콜을 설명 합니다. 또한, 우리는 mtDNA에 황산 시퀀싱 뇌관을 디자인 하기 위한 지침을 제공, 바람직하지 않은 핵 미토 콘 드 리아 세그먼트를 대상으로 하는 피하기 위하여 (NUMTs) 핵 게놈으로 삽입.
Introduction
미토 콘 드리 아 게놈은 약 16.5 킬로 베이스 (kb)의 원형, 더블-좌초 구조, 무거운 및 빛 가닥의 구성. 미토 콘 드리 아 게놈 임산부-상속, 각 셀 내에서 여러 복사본에 존재 이며 호흡 사슬의 단지1의 필수 구성 요소를 인코딩합니다. 마찬가지로 세균성 게놈을 핵 게놈 달리 미토 콘 드리 아 게놈은 구성 수많은 2 차 및 3 차 구조에와 같은 코일 및 supercoiled 구조2는 렌더링할 수 액세스 어려운 시퀀싱 중에 실험3.
핵에서 DNA의 메 틸 화는 유전자 발현의 규칙에 특히 수많은 프로세스에서 역할을 광범위 하 게 공부 epigenetic 표시입니다. 포유류 게놈에서 DNA 메 틸 화는 CG 디 (CpG)에 주로 deoxycytidines의 pyrimidine 링의 5 위치에 주로 발생합니다. 시 토 신 메 틸 화 DNA 기초4체세포와 총의 ~ 1 %의 게놈에서 모든 소비재의 70%에서 발견 된다. DNA methylations CpA, CpT, CpC 등 소비재가 아닌 상황에도 설명 되어 및 배아 줄기 세포5,,67에 모든 methylated cytosines의 25% 까지의 값으로 핵 DNA에 다양 한 금액에 존재.
시 토 신 메 틸 화는 핵 게놈의 널리 인정 하는 동안 미토 콘 드리 아 DNA (mtDNA) 메 틸의 존재가 여전히 논란. 첫 번째 연구 조사 mtDNA 메 틸 핵 DNA8에 비해 낮은 수준에 있지만 mtDNA 메 틸 화는 쉽게 탐지는, 경작된 한 세포에 수행 되었다. 인간과 murine 셀에서 mtDNA 메 틸 또한 낮은 수준 (2-5%)에서 발견 되었다. 갠 DNA immunoprecipitation (MeDIP) 뒤에 양이 많은 PCR 등 5 methylcytosine 캡처에 의존 하는 분석 실험을 사용 하 여, mtDNA 메 틸 화 다양 한 마우스와 인간에서 또한 검색 되었습니다 및 셀 라인9,10, 11,12. ELISA 분석 결과 또는 질량 분석 5-methylcytosine에 대 한 항 체를 사용 하 여, DNA 메 틸 화 상당한 수준의 순화 된 미토 콘 드리 아 분수13,,1415, 에서 발견 되었습니다. 그러나 16., 상기 연구에서 분석의 대부분 단일 기본 해상도에서 DNA 메 틸 화의 절대 정량화를 제공 하기 위해 설계 되지 않은 기술을 사용.
양적 및 resolutive DNA 메 틸 화 분석 단일 가닥 DNA 컨텍스트17 uracil unmethylated 시 토 신을 변환할 나트륨 황산의 재산의 이용 하는 "황산 시퀀싱", 라는 기술에 의해 달성 될 수 있다 . 황산 시퀀싱에 사용 하 여, 연구의 별자리 시 토 신 메 틸 화 다양 한 수준에서의 존재를 감지 했습니다. D 루프 영역, 12S는 또는 16 지역에서 메 틸 화 mtDNA 인간18,19,20,21,,2223 와 마우스24 에서 쉽게 검색 되었습니다. 그러나 조직 및 세포,, 연구에 걸쳐 총 cytosines의 1-20%의 흥미로운 다양성으로.
이러한 수많은 연구에 비해 단지 몇 가지 연구, 우리의 그룹에서 mtDNA 메 틸3,25,,2627 의 존재를 제기 했거나 심문의 생물학 관련성 mtDNA (2%) 아래 레벨28의 매우 낮은 수준. 최근, 우리는 전체 미토 콘 드리 아 황산 시퀀싱3에서 잠재적인 황산 시퀀싱 아티팩트 관측을 했다. 우리는 메 틸 화 레벨을과 대 평가 함으로써 미토 콘 드리 아 DNA의 이차 구조는 황산 시퀀싱에서 false로 되었다면 이어질 수 있는 증거 제공. 여기 mtDNA의 황산-변환의 아티팩트를 방지 하기 위해 프로토콜을 제공 합니다. 이 프로토콜 사용 하 여 DNA의 간단한 효소 소화 mtDNA 보조 구조 발생 하 고 황산 황산 시퀀싱 프로토콜을 다음에 대 한 전체 액세스를 허용. 또한, 우리는 황산 시퀀싱의 분석에 대 한 동반 bioinformatic 파이프라인을 제공합니다.
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Protocol
1. 제한 효소 처리
- 총 인간 DNA 제한 효소 BamHI 위치 14258 인간의 미토 콘 드리 아 DNA에 상처를 치료 하 여 mtDNA를 선형화.
참고: 마우스 DNA 위해 아래와 같이 동일한 조건에서 제한 효소 BglII를 사용 합니다. - 각 샘플 mtDNA 메 틸 화 평가 한 0.2 mL 반응 관을 준비 하 고 (fluorometry에 의해 계량), 다음 믹스: 3 μ g 게놈 DNA를 추가 하는 15 μ 버퍼 3, 3 μ BamHI와 150 μ의 최대 물
- 4 h 37 ° c.에 대 한 열 cycler에 있는 장소 관
2. 황산 변환
- BamHI 치료 DNA 나트륨 황산29설명 되어 있는 대로 사용 하 여 변환 합니다.
- 200-500 ng BamHI 치료 DNA를 사용 하 여 각 변환 반응 20 μ의 전체 볼륨에 대 한. DNA 복구 50-70%입니다.
- 황산 변환 DNA 10 μ 차입 버퍼에 elute
- Fluorometry에 의해 단일 가닥 DNA를 계량.
- 선택 사항: 프로토콜의 나머지를 진행 하기 전에-20 ° C에서의 황산 변환 DNA를 저장 합니다. 장기 저장을 위한 저장-80 ° C에서의 황산 변환 DNA
3입니다. 뇌관을 시퀀싱 하는 황산의 디자인
- 황산 시퀀싱 온라인 도구 Methprimer30 BiSearch31,32를 사용 하 여 뇌관 디자인.
참고: Methprimer 및 BiSearch 수 뇌관 바인딩 시퀀스 게놈 시퀀스에 대 한 검색 cytosines thymines 후 황산 처리와 유사 하 게 변환 됩니다. - 최적의 고 공평한 확대를 위한 뇌관에서 CpG 디를 방지 하 고 100-300 bp 사이 amplicon 크기를 디자인 합니다.
- 설계 된 뇌관 뇌관 검색BiSearch의 함수를 사용 하 여 미토 콘 드리 아 DNA에 특정 인지 확인 합니다. 이미 설계 된 황산 변환 뇌관 삽입, 황산 상자 똑 딱 거리 고 PCR 매개 변수 및 참조 게놈을 포함.
참고: 가능한 PCR 제품의 목록이 표시 됩니다. - 복사 가기 1-5 뇌관 시퀀스 하 그들 oligonucleotide 종합에 대 한 주문 양식으로.
참고: 목록 인간 실험실에서 검증 된 마우스 mtDNA 뇌관 순서는 표 1에 표시 됩니다. - 황산을 사용 하 여 테스트 뇌관 PCR agarose 젤 전기 이동 법 4 단계에 설명 된 대로 다음 변환. 테스트와 별도로 모든 뇌관 쌍을 최적화 하 고 정확한 amplicon 크기 agarose 젤에 표시.
참고: 멀티플렉싱 뇌관, 필요한 경우 추가 하나에 여러 개의 뇌관 PCR 반응 단일 agarose 젤 전기 이동 법 또는, polyacrylamide 젤 전기 이동 법, 비슷한 제품을 구별 하는 것 같은 더 resolutive 방법에 PCR 제품을 시각화 크기입니다.
4. 황산 PCR 및 젤 추출 변환
- 관심 영역을 증폭, 뜨거운 시작 Taq 중 합 효소를 사용 하 여 PCR을 수행 합니다. 믹스 100 ng DNA, 500 µ M와 반대로 감각 뇌관, 1 µ L dNTP 믹스 (각 dNTP의 10 µ M), 그리고 50 µ L. 총 볼륨에 7.5 U/반응에서 중 합 효소를 변환 하는 간단히, 다음과 같은 조건 가진 PCR 실행: 95 ° C에서 5 분 (60 s 94 ° C; 60 s 55 ° C *; 60 s 72 ° C)
35 주기; 10 분 72 ° c. 별도로 프라이 머를 사용 하거나 다중화. - 선택 사항: 뇌관, 멀티플렉싱 사용 200 ng 변환 DNA와 자전거 다음과: 5 분 95 ° C (60 s 94 ° C, 90 s 55 ° C *; 90 s 72 ° C) 35 주기; 10 분 72 ° c.
참고: 온도 뇌관의 녹는 온도 따라 달라질 수 있습니다. - 2 %agarose 100 볼트에 전기 이동 법 젤에 PCR 제품 주제.
- 부드러운 자외선에서 메스와 PCR 제품을 추출 하 고 microtubes에 추가 합니다. DNA의 손상을 방지 하려면 과도 한 자외선에 PCR 제품을 노출 하지 마십시오. 노출 시간을 30 이상 하지 s.
- 앞에서 설명한3젤 정화를 사용 하 여 PCR 제품을 정화.
- 4.5 단계에서 순화 된 DNA를 계량 fluorometry를 사용 하 여. 5 단계 또는-20 ° c.에 게 샘플 진행
35 주기; 10 분 72 ° c. 별도로 프라이 머를 사용 하거나 다중화.5입니다. 황산 시퀀싱 라이브러리 준비
- 황산 변환 PCR 제품의 라이브러리 준비를 수행 합니다.
옵션:이 단계에서 PCR 제품 멀티플렉스할. - 최대 100을 사용 하 여 최종 복구 수행 PCR 제품의 ng. 0.2 mL 튜브에 55.5 µ L PCR 제품을 3 µ L 최종 준비 효소와 6.5 µ L 최종 수리 반응 버퍼 (10 배)를 추가 합니다. 장소 및 20 ° c에서 65 ° c.에 30 분 뒤 30 분에 대 한 열 cycler에 튜브를 품 어
- 15 µ L 블런트/TA 리가 믹스, 2.5 µ L 최종 수리 DNA를 혼합 하 여 시퀀싱 어댑터 선 어댑터와 1 µ L 결 찰 증강. 사용 하는 경우 < 100 ng PCR 제품 입력으로 희석 어댑터 10 번.
- 열 cycler에 믹스 (5.3 단계) 하 고 20 ° c.에서 15 분을 품 어 열 cycler 일시 중지 하 고 3 µ l 사용자 추가 튜브에 효소. 혼합 열 cycler에 다시 튜브를 배치 하 고 37 ° c.에서 15 분을 품 어
- 크기는 DNA PCR 제품 크기에 따라 구슬의 다양 한 비율 단단한 단계 가역 동원 정지 (SPRI) 비즈를 사용 하 여 어댑터 출혈 DNA를 선택 합니다.
- 5.4 고 55 resuspended µ L SPRI 구슬에서 어댑터 출혈 DNA를 13.5 µ L H2O를 추가 합니다. 마그네틱 스탠드에 5 분 및 장소 튜브에 대 한 실 온에서 품 어. 솔루션은 분명, 새로운 튜브에는 상쾌한을 전송 하 고 구슬이 들어 있는 튜브를 삭제.
참고:는 상쾌한 어댑터 출혈 DNA를 포함 하 고 큰 원치 않는 조각을 폐기 구슬에 바인딩됩니다. - 단계의 5.6는 상쾌한에 25 µ L resuspended SPRI 구슬을 추가 하 고 섞어 실 온에서 5 분 동안 품 어. 마그네틱 스탠드에 튜브를 놓고 때 솔루션은 분명 하다는 상쾌한을 삭제 합니다.
참고: 폐기 상쾌한 어댑터 출혈 DNA 구슬에 바인딩되어 반면 원치 않는 DNA를 포함 합니다. - 마그네틱 스탠드에 튜브를 실행 하는 동안 씻어 구슬 200 µ L 80% 에탄올 (갓 준비)를 추가 합니다. 품 어 30 s 및 제거와 삭제는 상쾌한. 2 세척의 총에 대 한이 단계를 반복 합니다.
- 공기 건조 구슬 5 분에 대 한 튜브 오픈 뚜껑 마그네틱 스탠드에 있는 동안.
- 자석에서 튜브를 제거 하 고 23 µ L 차입 버퍼에 DNA elute 혼합. 2 분 동안 실 온에서 품 어.
- 마그네틱 스탠드에 튜브를 놓고 때 솔루션은 분명, 이전 PCR 증폭 (단계 5.14)에 대 한 96-잘 PCR 접시에 2 µ L를 전송 합니다.
- PCR 증폭 (단계 5.17)에 대 한 새로운 0.2 mL 튜브에 나머지 약 21 µ L를 전송.
참고: 해야 하지 어떤 구슬 구슬의 다음 단계 효소 반응 억제 수 있습니다 전송 합니다. - 단계 5.14 또는-20 ° c.에 게 샘플 진행
- RT-정량 어댑터 출혈 DNA 증폭에 필요한 사이클 수를 예측 하 여 사전-PCR 증폭을 수행 합니다. 반응, 당 96 잘 PCR에서 다음 접시 포함 2 µ L DNA (단계 5.11) 추가: 0.4 µ L 인덱스 뇌관, 0.4 µ L 범용 PCR 뇌관, 7.2 µ L H2O, 10 µ L 실시간 정량 마스터 믹스.
- 실시간 PCR 기계에 접시를 놓고 다음과 같은 조건에 접시를 주제: 30 s 98 ° C에 (10 s 98 ° C, 75 s 65 ° C) 20 주기; 5 분 65 ° c.
- 사전 증폭 RT-정량 PCR 반응의 선형 단계의 끝에 해당 Ct 값에 한 Ct 값을 빼서 각 샘플에 필요한 증폭 사이클의 수를 견적 한다.
- 혼합 하 여 단계의 5.12 어댑터 출혈 DNA 증폭: 21 µ L DNA, 25 µ L PCR 마스터 혼합, 1 µ L 인덱스 뇌관, 1 µ L 범용 PCR 뇌관 및 2 µ L H2o. 열 cycler에서 다음과 같은 조건에 각 샘플 제목: 30 s 98 ° C에 (10 s 98 ° C, 75 s 65 ° C) [5.16 단계에서 계산 된 Ct] 주기; 5 분 65 ° c.
참고:만 샘플 당 하나의 인덱스 뇌관을 사용 하 여 멀티플렉싱 있도록 기억 해요. 인덱스는 PCR 동안 삽입 됩니다. - 증폭된 DNA SPRI 구슬을 정화 하 고 22 µ L 차입 버퍼에 elute.
- 젤 전기 이동 법 또는 대체 방법으로 라이브러리 품질을 제어 합니다. 올바른 라이브러리 피크 크기 (PCR 제품 크기 플러스 어댑터)를 찾습니다.
- 얼룩 분석 라이브러리 제품의 평균 기본적인 쌍 크기 예측: 고급 전역 설정을 두 번 클릭 "테이블"에 얼룩 분석에서. 100-1000 bp에서 영역을 정의 하 고 확인을 클릭 합니다. 지역 테이블에서 정의 된 지역 나타나고 라이브러리 평균 크기 (bp) 계산 됩니다.
- Fluorometry에 의해 라이브러리를 계량. 6 단계 또는-20 ° c.에 게 라이브러리를 진행
6. 다음 세대 시퀀싱
- 수식을 사용 하 여 라이브러리의 nM 농도 계산:
- 라이브러리 같은 nM 농도 2 예 nM 희석 (선택 4 nM, 2 nM, 1 nM, 또는 0.5 nM 라이브러리 농도 따라). 2 nM 라이브러리의 수영장을 달성 하기 위해 모든 라이브러리를 풀.
- 변성 고 시퀀싱 악기 가이드 다음과 같은 라이브러리를 희석. 한마디로: 0.2 N NaOH 추가 하 여 2 nM 풀 변성 및 5 분 Dilute 오후 10의 최종 희석 변성된 풀에 대 한 실 온에서 품 어. 변성 고 오후 12 시 5의 최종 희석에 상용 컨트롤 라이브러리를 희석. 새로운 튜브 10 오후 수영장 20% 오후 12 시 5 컨트롤 라이브러리와 함께 혼합 한다.
참고: 황산 변환 매우 낮은 복잡성을 소개합니다. 20% 컨트롤 라이브러리 스파이크-에서 더 나은 품질의 시퀀싱 발생 합니다. - 깊은 시퀀싱 악기를 사용 하 여 150 bp 쌍-엔드 시퀀싱을 실행 합니다.
7. 전산 분석-예상 메 틸 화 수준
- .Fastq 파일 (sample1_R1.fastq.gz 및 sample1_R2.fastq.gz에 여기 라고 함)를 생성, 관심의 전체 게놈의 비스마르크 인덱스 생성 (여기에서 bismarkIndex라는 폴더) chrM의 게놈 시퀀스 fasta에 사용할 수 있는지 확인 하 고 형식 (여기서는 chrM라는 폴더에).
- 어댑터 및 뇌관에 의해 소개 하는 바이어스를 제거에 전처리: Trim_galore33도구를 사용 하 여. 정방향 및 역방향 읽기의 5' 끝에서 2 개의 뉴클레오티드를 제거 합니다.
trim_galore-clip_R1 2-clip_R2 2-o. /-쌍이 trim1-sample1_R1.fastq.gz sample1_R2.fastq.gz - 전처리 된 읽기 비스마르크34 를 사용 하 여 전체 게놈에 정렬
비스마르크-사 개-빵-o. /. / bismarkIndex /-1./sample1_R1_val_1.fq.gz-2./sample1_R2_val_2.fq.gz
참고: 다른 동기 기를 사용 하는 경우 고유 정렬 수 없습니다 읽기 삭제 됩니다 있는지 확인 합니다. - 추출 읽고 염색체 M, Samtools35 를 사용 하 여 여기에 매핑
samtools 정렬-l 0-O BAM-o sample1_sorted.bam
sample1_R1_val_1_bismark_bt2_pe.bam
samtools 인덱스 sample1_sorted.bam
samtools 볼-u sample1_sorted.bam chrM | samtools 정렬-n-O BAM-o sample1_chrM.bam - 메 틸 화 정보 추출
bismark_methylation_extractor-p-cx는-cytosine_report-포괄적인-genome_folder. / chrM./sample1_chrM.bam - .bedGraph는.cov 또는 CX_report.txt 파일을 사용 하 여 추가 분석을 위해. 시각화 및 테스트에 대 한 sample1_chrM.CX_report.txt 파일을 사용 합니다.
- 수행 추가 전처리 단계에서 클리핑 영역이 여러 개를 심문 하 고 뇌관 바이어스 매핑 중 생성 M 바이어스 플롯에서 볼 수 있습니다. 자세한 내용은 대 한 비스마르크 설명서를 참조 하십시오.
8. 전산 분석-차이의 테스트
- CX_report.txt 파일 들어 염색체 M에 모든 c 7 열, 염색체 (여기 chrM), 위치, 스트랜드, 갠 읽기 수, unmethylated 읽기, C 컨텍스트 및 주변 시퀀스의 수를 확인 합니다.
- CX_report chrM 전체에서 커버, 증폭 되는 지구를 하위 집합을 확인 합니다.
- 비 파라 메 트릭 테스트를 사용 하 여 개별 c의 어 부의 정확한 테스트 등 전체 영역에 대 한 로그인 테스트 샘플 간의 차이 대 한.
참고: 정량화 될 것입니다 종종 0% 메 틸 화, 가까운 왜 정상 가정 적절 하지 않은 이유입니다. - 마찬가지로, 시각화, 시각화 quantiles 하거나 이항 비율 신뢰 간격을 계산 합니다.
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Representative Results
이 프로토콜에 두 단계는 mtDNA 메 틸 화를 조사할 때 중요 합니다. 1) 이차 구조 및 미토 콘 드리 아 DNA 특정 뇌관의 2) 디자인의 오프닝.
제한 효소 BamHI (그림 1) 인간의 게놈 DNA를 소화 하 여 미토 콘 드리 아 DNA 구조는 뉴클레오티드 위치 14,258에 삭감 될 것 이다 그리고 이차 구조를 열 것 이다.
그대로 mtDNA 이차 구조와 황산의 가능한 장애 mtDNA unconversion 속도과 대 평가 매우 높습니다. 중 아 황산 염 연속, mtDNA unconversion 속도 조사에 소화, 미토 콘 드리 아 게놈의 5 가지 영역에서 인간 골격 근육 세포에서 전체 DNA를 소화: 변위 루프 (D-루프), tRNA 페닐알라닌 및 12S 리보솜 (tRNA-F + 12S) 16S 리보솜 (16S) NADH 효소 5 (ND5) 및 시 토 크롬 b (CYTB) 인코딩 mRNA 유전자 (그림 2). Unconversion 속도 0-원거리 소화 되지 않은 mtDNA에 대 한 모든 조사 지역에 걸쳐 15.1%. 그러나, DNA는 황산 변환 전에 소화 했다 때 unconversion 속도 감소 1%의 최대 모든 지역 (그림 3)에 걸쳐. 따라서, mtDNA 메 틸 화 수준의 과대평가 피하기 위해 황산 변환 전에 BamHI 소화의 중요성을 보여주는.
미토 콘 드리 아 게놈을 분리 하는 때 핵 DNA의 오염이 불가피 하다 고 이후 거의 전체 미토 콘 드리 아 게놈 핵 게놈으로 복제 했다, 그것을 초래 했다 핵 되 나 미토 콘 드리 아 게놈의 핵 삽입 미토 콘 드 리아 세그먼트 (NUMTs)36. 분석 된 DNA 메 틸 화 수준의 미토 콘 드리 아 DNA와 하지 NUMTs에 해당 되도록 그것은 미토 콘 드리 아 게놈 관련 된 뇌관 디자인 바깥쪽 중요. 그림 4 에 뇌관 특이성 및 인간의 표 1 디스플레이 마우스 mtDNA 뇌관 시퀀스를 확인 하는 방법을 보여 줍니다.
| 이름 | 시퀀스 | 위치 | Amplicon 크기 | 어 닐 링 온도 | 스트랜드 | ||
| 인간의 | |||||||
| D-루프 | F: AAATCTATCACCCTATTAAC | ||||||
| R: GTGGAAATTTTTTGTTATGATGT | 6-298 | 292 | 55 ° C | Antisense | |||
| D-루프 | F: CATAACAAAAAATTTCCACCAAAC | ||||||
| R: GGGAAAATAATGTGTTAGTT | 279-458 | 179 | 55 ° C | Antisense | |||
| 12S + TF | F: TTTATATAACTTACCTCCTC | ||||||
| R: GTGTTTGATGTTTGTTTTTTTTG | 577-765 | 188 | 55 ° C | Antisense | |||
| 260 | F: AATAAATTTATAGGTTTTTAAATTATTAAAT | ||||||
| R: TAACTAATAAAATCTTAACATATACTACTC | 2763-2873 | 110 | 53 ° C | 감각 | |||
| CYTB | F: GGTATTATTTTTTTGTTTGTAATTATAGTA | ||||||
| R: CCTCAAATTCATTAAACTAAATCTATCC | 15091 15243 | 152 | 55 ° C | 감각 | |||
| 마우스 | |||||||
| 12S | F: ACACATACAAACCTCCATAAAC | ||||||
| R: GAGGTATAATTTAGTTAAAT | 111-287 | 176 | 53 ° C | Antisense | |||
| 260 | F: AAATTCCAATTCTCCAAACATAC | ||||||
| R: TTTGGATTTTTTTTTTAGGT | 1749-1896 | 147 | 53 ° C | Antisense | |||
| CYTB | F: CTACAAAAACACCTAATAACAAAC | ||||||
| R: AGTGTATGGTTAAGAAAAGA | 14129 14307 | 178 | 55 ° C | Antisense | |||
| 260 | F: AGAGAAATAGAGTTATTTTATAAATAAG | ||||||
| R: CTAAAAACAAAATTTTAAATCTTAC | 2576-2727 | 151 | 55 ° C | 감각 | |||
| ND5 | F: TTAAGTTAATTAGGTTTGATAATAGTGA | ||||||
| R: TAAAACCCTATTAAAAATAATATTCCTATA | 12659 12910 | 251 | 55 ° C | 감각 | |||
| CYTB | F: TGGGTTTTTTTTAGGAGTTTGTTTA | ||||||
| R: CAATAAAAATACTCCAATATTTCAAATTTC | 14242 14504 | 262 | 55 ° C | 감각 | |||
표 1: 인간을 위한 뇌관 순서 및 마우스 mtDNA. Note는 어 닐 링 PCR의 온도 뇌관 다 뇌관의 녹는 온도에 차이.
그림 1 : 젤 전기 이동 법 BamHI 소화 또는 소화 되지 않은 DNA의. 인간 골격 근육에서 게놈 DNA 치료 또는 37 ° C에서 4 h BamHI로 치료 하 고 젤 전기 이동 법 1.5 %agarose 젤에 실행 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 인간 미토 콘 드리 아 게놈의 지도. 미토 콘 드리 아 게놈 조사에 의해 황산 시퀀싱 그리고 BamHI 제한 효소 사이트의 영역 표시 됩니다. 미토 콘 드리 아 DNA는 13 mRNAs, 2 리보솜 RNAs, 및 22 전송 RNAs를 포함합니다. 약어: Ph 1: 무거운 물가 발기인 1; Ph 2: 무거운 물가 홍보 2; PL: 빛-스트랜드 발기인; 무거운-스트랜드;에서 복제의 오: 기원 OL: 빛 가닥에서 복제의 근원. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 황산 변환 전에 BamHI 소화 인간 골격 근육 세포의 mtDNA unconversion 속도 감소. 중 아 황산 염 연속, 소화 및 소화 미토 콘 드리 아 DNA unconversion 비율 인간 골격 근육 세포에 있는 미토 콘 드리 아 게놈의 5 개의 다른 지역에서 심문을 했다 (N= 3). 전체 광장 CpG 사이트 나타내고 오픈 스퀘어 비 CpG 사이트를 나타냅니다. 결과 최소-최대 간격 표시 됩니다 그리고 서명 테스트 중요 한 unconversion 차이 대 한 테스트에 사용 되었다. D-루프 (6-298) P= 1.83E-42; D-루프 (279-458): P= 4.55E-13; tRNA-F + 12S: P= 8.38E-16; 16 기: P= 5.91E-06; ND5: P= 1.70E-05; CYTB: P= 2.69E-10. D-루프 (6-298) 포함 한다 복제의 근원 그리고 tRNA-F + 12S 무거운 가닥 발기인 2 포함. 이러한 데이터 되었습니다 3다른 곳에서 출판. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : 미토 콘 드리 아 게놈으로 뇌관 특이성을 확인 하기 위해 Bisearch 사용 하 여. A) 황산 변환 뇌관 시퀀스 BiSearch 함수 뇌관 검색 (http://bisearch.enzim.hu/?m=genompsearch)에 추가 됩니다. 황산 상자가 났 고 참조 게놈 선택 됩니다. B) 와 antisense 체인에 생성 되는 잠재적인 PCR 제품의 예. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
여기, 우리는 mtDNA 메 틸 화를 심문 하도록 특별히 설계 된 황산 시퀀싱 프로토콜을 제공 합니다. Genomic DNA에 사용 되는 황산-시퀀싱 프로토콜 차이 NUMT 시퀀스에서 거짓 긍정적인 발생 밖으로 지배 이전 금지 효소 소화 단계 및 bioinformatic 분석의 활용에 있다.
우리는 mtDNA 메 틸 화를 조사할 때 황산 시퀀싱 아티팩트를 피하기 위해 프로토콜을 제공 합니다. 가양성을 선도 하는 황산 시퀀싱 유물 이전 보고37했다. K 되었습니다 가수분해에 의해 DNA 액세서리 단백질의 부족 제거37을 설명 합니다. 불완전 한 변성 또는 부분 reannealing 이어질 수 있습니다 불완전 한 변환의 뻗어 아마도 단일 가닥 DNA37황산의 액세스를 낮춰서. 나중 유물 mtDNA에 놀이에 이차 구조 cytosines에 대 한 액세스를 손상 것입니다 수 있습니다. 우리의 지식 최선을 mtDNA 메 틸 화를 추정의 맥락에서 황산 변환 이전에 금지 효소 소화 단계의 추가 먼저 20163,28에 보고 되었습니다. 우리 손에, 단일 커터 제한 효소로 사전 소화 극적으로 낮춘 비전향된 cytosines3,28의 탐지.
여기, 우리 bioinformatic 파이프라인 황산 시퀀싱 결과 분석 하 고 전체 미토 콘 드리 아 게놈 황산 시퀀싱의 맥락에서 황산 시퀀싱 아티팩트를 감지를 제공 합니다. 이 메서드는 mtDNA 우리의 관찰에서 유래 비 전환율 깊이3,28시퀀싱 서로 반비례 했다. 이 관측 mtDNA의 보조 및 심지어 3 차 구조 시퀀싱 라이브러리의 건설 기간 동안 특정 지역에서 mtDNA의 조각화를 손상 또한 mtDNA에 나트륨 황산의 전체 액세스를 손상 할 수 제안. 이후 한 커터 효소와 소화 2 차 및 3 차 구조를 출시, 우리의 결과 mtDNA 구조 황산 유물의 소스 이며, 시 토 신 메 틸 화에 mtDNA의 정량화에 대 한 여기에 설명 된 방법의 유효성을 검사를 나타냅니다.
미토 콘 드 리아 준비에서 핵 DNA의 피할 수 없는 오염 도전을 구성합니다. 대상으로 수행 하는 경우에 추정에 mtDNA, 시 토 신 메 틸 화의 편견 수 있습니다 시퀀싱 읽기에서 NUMT 시퀀스에 오염 및 하지 모든 미토 콘 드 리아 게놈 황산 시퀀싱을이 끈다. 이러한 바이어스를 방지 하려면 고유한 황산 시퀀싱 뇌관의 디자인 제외 NUMTs에서 메 틸 화와 오염 수 있습니다. NUMTs 범위 특정 인간의 영역 및 100 %id, 마우스 미토 콘 드리 아 게놈 그리고 그것 불가능, 따라서, 특정 mtDNA 영역에서 독특한 뇌관 디자인. 전체 미토 콘 드리 아 게놈 황산 시퀀싱, 긴 시퀀싱을 수행할 때 읽기 mtDNA와 NUMTs 사이 차별을 완화 수 있습니다. 미토 콘 드리 아 게놈에 고유 하 게 매핑된 읽기 더 수 전체 게놈 및 사용 정렬 읽기 mtDNA 메 틸 화의 검출을 확인 합니다.
마지막으로,이 프로토콜 사용할 수 있습니다 미토 콘 드 리아 게놈 넘어 예를 들어 DNA의 이차 구조의 유물을 대표 하는 황산 시퀀싱의 다른 경우에. 메 틸 화 수준 및 시퀀싱 깊이 사이 협회 복잡 한 DNA 시퀀스의 황산 시퀀싱 전에 제한 효소로 소화에 대 한 필요성을 평가 하기 위해 조사 될 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 선언할 수 없습니다 경쟁 금융 관심 있다.
Acknowledgments
노 보 Nordisk 기초 센터 기본 대사 연구를 위한 Novo Nordisk 기초에서 제한 없는 기부금에 의해 부분적으로 투자 코펜하겐 대학에서 독립적인 연구 센터입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BamHI | New England BioLabs | # R0136 | |
| EZ DNA methylation-lightning kit | Zymo Research | # D5030 | |
| Qubit ssDNA assay | Thermo Fisher Scientific | # Q10212 | |
| Qubit assay tubes | Thermo Fisher Scientific | # Q32856 | |
| HotStarTaq plus DNA polymerase kit | Qiagen | # 203603 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | # 28704 | |
| NEBNext Ultra DNA Library Kit for Illumina | New England BioLabs | # E7370S | |
| NEBNext Multiplex Oligoes for Illumina | New England BioLabs | # E7335S | |
| AMPure XP Beads | Beckman Coulter | # A63881 | |
| High Sensitivity DNA chip | Agilent | # 5067-4626 | |
| Qubit high sensitivity dsDNA assay | Thermo Fisher Scientific | # Q33230 | |
| MiSeq reagent kit v2 300 cycles | Illumina | # MS-102-2003 | |
| PhiX control v3 | Illumina | # FC-110-3001 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | # S5881 | |
| Thermal cycler C1000 | Biorad | # 1851148 | |
| CFX96 Real-Time PCR detection system | Biorad | #1855195 | |
| Qubit Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | # Q33226 | |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent | # G2939BA | |
| MiSeq instrument | Illumina | # SY-410-1003 |
References
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