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Genetics

Mitochondrial डीएनए मिथाइल का सटीक पता लगाने के लिए क्रियाविधि

Published: May 20, 2018 doi: 10.3791/57772
Automatic Translation
1, 1, 1
1The Novo Nordisk Foundation for Basic Metabolic Research, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen

Summary

यहां, हम mitochondrial डीएनए (mtDNA) मिथाइल के सटीक ठहराव की अनुमति देने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । इस प्रोटोकॉल में, हम डीएनए के एक एंजाइमी पाचन का वर्णन एक bioinformatic विश्लेषण पाइप लाइन के साथ युग्मित जो mtDNA मिथाइल mtDNA की माध्यमिक संरचना की वजह से स्तर के अधिक से अधिक अनुमान से बचने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के साथ मिलकर BamHI ।

Abstract

डीएनए ठहराव के bisulfite अनुक्रमण का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है, जो सोडियम bisulfite की संपत्ति का लाभ लेता है unmethylated cytosine में uracil में परिवर्तित, एक एकल-कतरा डीएनए संदर्भ में । Bisulfite अनुक्रमण (पीसीआर का उपयोग) लक्षित किया जा सकता है या पूरे जीनोम पर प्रदर्शन किया और एकल आधार-संकल्प पर cytosine मिथाइल के निरपेक्ष ठहराव प्रदान करता है । नाभिकीय और mitochondrial डीएनए की विशिष्ट प्रकृति को देखते हुए, विशेष रूप से द्वितीयक संरचना में, mtDNA में cytosine मिथाइल की जांच के लिए bisulfite अनुक्रमण विधियों के रूपांतरों को बनाया जाना चाहिए । mtDNA के माध्यमिक और तृतीयक संरचना वास्तव में एक-कतरा डीएनए को bisulfite के अधूरे विकार गरीब पहुंच के कारण झूठी सकारात्मक करने के लिए अग्रणी bisulfite अनुक्रमण कलाकृतियों के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । यहां, हम bioinformatic विश्लेषण पाइपलाइन के साथ युग्मित के साथ डीएनए के एक एंजाइमी पाचन का उपयोग कर एक प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए cytosine में mtDNA मिथाइल स्तर के सटीक ठहराव अनुमति देते हैं । इसके अलावा, हम mtDNA के लिए विशिष्ट bisulfite अनुक्रमण प्राइमरों डिजाइनिंग के लिए दिशानिर्देश प्रदान करते हैं, ताकि अवांछनीय परमाणु MiTochondrial खंडों (NUMTs) परमाणु जीनोम में डाला लक्ष्यीकरण से बचने के लिए ।

Introduction

mitochondrial जीनोम एक परिपत्र, लगभग १६.५-किलो बेस (केबी) लंबे समय से, एक भारी और एक प्रकाश किनारा का गठन की संरचना डबल असहाय है । mitochondrial जीनोम प्रत्येक कोशिका के भीतर कई प्रतियां में मौजूद है, मातृ-विरासत में मिला है, और encodings सांस की चेन परिसरों के आवश्यक घटकों1। बैक्टीरियल जीनोम के समान और परमाणु जीनोम के विपरीत, mitochondrial जीनोम कई माध्यमिक और तृतीयक संरचनाओं में आयोजित किया जाता है, जैसे कुंडलित और supercoiled संरचनाओं में2, जो उपयोग मुश्किल प्रदान कर सकते हैं अनुक्रमण के दौरान गडबड३.

नाभिक में, डीएनए के मिथाइल एक बड़े पैमाने पर अध्ययन epigenetic निशान है कि कई प्रक्रियाओं में एक भूमिका निभाता है, विशेष रूप से जीन अभिव्यक्ति के विनियमन में । स्तनधारी जीनोम में, डीएनए मिथाइल deoxycytidines के न्यूक्लियोटाइड अंगूठी की 5-स्थिति पर मुख्य रूप से होता है, ज्यादातर तटरक्षक dinucleotides (या CpG) पर । Cytosine मिथाइल दैहिक कोशिकाओं के जीनोम में सभी CpG के ७०% पर पाया जाता है और कुल डीएनए ठिकानों के ~ 1% के लिए खातों4। डीएनए मिथाइल को भी गैर-CpG संदर्भों में वर्णित किया गया है, इस तरह सीपीए, CpT, और सीपीसी के रूप में और परमाणु डीएनए में विभिंन मात्रा में मौजूद, सभी methylated cytosines के 25% के लिए भ्रूण स्टेम कोशिकाओं में5,6,7के ऊपर मूल्यों के साथ ।

जबकि परमाणु जीनोम के cytosine मिथाइल व्यापक रूप से स्वीकार किए जाते हैं, mitochondrial डीएनए (mtDNA) मिथाइल का अस्तित्व अभी भी विवादास्पद है । mtDNA मिथाइल की जांच करने वाले पहले अध्ययन में उन प्रसंस्कृत कक्षों का प्रदर्शन किया गया जहां mtDNA मिथाइल का आसानी से पता लगाया गया था, हालांकि परमाणु डीएनए8की तुलना में निचले स्तरों पर । दोनों मानव और murine कोशिकाओं में, mtDNA मिथाइल भी कम स्तर पर पाया गया (2-5%) । 5 methylcytosine कैप्चर पर आश्रित परख का उपयोग करना जैसे methylated डीएनए immunoprecipitation (MeDIP) मात्रात्मक पीसीआर के बाद, mtDNA मिथाइल भी विभिंन माउस और मानव और कोशिकाओं लाइनों में पाया गया था9,10, 11,12. एक एलिसा परख या मास स्पेक्ट्रोमेट्री में 5-methylcytosine के खिलाफ एंटीबॉडी का प्रयोग, डीएनए मिथाइल का पर्याप्त स्तर शुद्ध mitochondrial अंशों13,14,15से पता लगाया गया, 16. हालांकि, aforementioned अध्ययन में परख के सबसे तकनीक है कि एक आधार-संकल्प पर डीएनए मिथाइल के निरपेक्ष ठहराव प्रदान डिजाइन नहीं थे इस्तेमाल किया ।

मात्रात्मक और resolutive डीएनए मिथाइल विश्लेषण "bisulfite अनुक्रमण" नाम की एक तकनीक द्वारा प्राप्त किया जा सकता है, जो सोडियम bisulfite की संपत्ति का लाभ लेता है unmethylated cytosine में uracil में परिवर्तित करने के लिए एकल-कतरा डीएनए संदर्भ में17 . bisulfite अनुक्रमण का उपयोग कर, अध्ययन के एक नक्षत्र विभिन्न स्तरों पर cytosine मिथाइल की उपस्थिति का पता चला है. डी-लूप क्षेत्र में मिथाइल mtDNA, 12S या 16S क्षेत्र में मानव के18,19,20,21,22,23 और माउस24 में आसानी से पाया गया ऊतकों और कोशिकाओं, तथापि, एक पेचीदा परिवर्तनशीलता के साथ, कुल cytosines के 1-20% की पढ़ाई के पार ।

इन कई अध्ययनों की तुलना में, केवल कुछ अध्ययनों, हमारे समूह सहित, mtDNA मिथाइल3,25,26,27 की उपस्थिति पर विवादित है या की जैविक प्रासंगिकता पर सवाल उठाए mtDNA स्तरों के बहुत निम्न स्तर (2%)28से नीचे । हाल ही में, हम पूरे mitochondrial bisulfite अनुक्रमण3में एक संभावित bisulfite अनुक्रमण विरूपण साक्ष्य के अवलोकन की सूचना दी । हम mitochondrial डीएनए की माध्यमिक संरचना bisulfite अनुक्रमण में झूठी सकारात्मक करने के लिए नेतृत्व कर सकता है कि सबूत प्रदान की है, जिससे मिथाइल स्तर का आंकलन । हम यहां एक bisulfite के एक विरूपण साक्ष्य-mtDNA के रूपांतरण को रोकने के लिए प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं । इस प्रोटोकॉल mtDNA माध्यमिक संरचनाओं को बाधित और एक bisulfite अनुक्रमण प्रोटोकॉल के बाद bisulfite के लिए पूर्ण पहुँच की अनुमति देने के लिए डीएनए के एक सरल एंजाइमी पाचन का उपयोग करता है. इसके अलावा, हम bisulfite अनुक्रमण के विश्लेषण के लिए एक साथ bioinformatic पाइपलाइन प्रदान करते हैं ।

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Protocol

1. प्रतिबंध एंजाइम उपचार

  1. Linearize प्रतिबंध एंजाइम BamHI के साथ कुल मानव डीएनए के इलाज से mtDNA, कि मानव mitochondrial डीएनए में १४२५८ की स्थिति में कटौती ।
    नोट: माउस डीएनए के लिए, नीचे के रूप में समान शर्तों के तहत प्रतिबंध एंजाइम BglII का उपयोग करें ।
  2. प्रत्येक नमूने के लिए जहां mtDNA मिथाइल का मूल्यांकन किया जाना है, एक ०.२ मिलीलीटर रिएक्शन ट्यूब तैयार करें और निम्न मिश्रण जोड़ें: 3 μg जीनोमिक डीएनए (quantified by fluorometry), 15 μL बफर 3, 3 μL BamHI और पानी up to १५० μL
  3. ३७ डिग्री सेल्सियस पर 4 एच के लिए एक थर्मल साइकिल चालक में जगह ट्यूबों ।

2. Bisulfite रूपांतरण

  1. 29कहीं वर्णित के रूप में सोडियम bisulfite का उपयोग कर BamHI-इलाज डीएनए कन्वर्ट ।
  2. 200-500 एनजी BamHI-इलाज डीएनए प्रत्येक रूपांतरण प्रतिक्रिया के लिए 20 μL की कुल मात्रा में उपयोग करें । डीएनए वसूली 50-70% है ।
  3. Elute ने Bisulfite में परिवर्तित डीएनए को 10 μL रेफरेंस बफर में तब्दील कर दिया ।
  4. fluorometry द्वारा एकल-असहाय डीएनए को बढ़ाता है ।
  5. वैकल्पिक: प्रोटोकॉल के शेष आगे बढ़ने से पहले-20 डिग्री सेल्सियस पर bisulfite-परिवर्तित डीएनए स्टोर । लंबी अवधि के भंडारण के लिए, स्टोर bisulfite-८० डिग्री सेल्सियस पर डीएनए परिवर्तित

3. Bisulfite अनुक्रमण प्राइमरों की डिजाइन

  1. bisulfite अनुक्रमण के लिए डिजाइन प्राइमरों Methprimer30 और BiSearch31,३२के ऑनलाइन उपकरण का उपयोग कर ।
    नोट: Methprimer और BiSearch जीनोमिक अनुक्रम जहां cytosines thymines में परिवर्तित कर रहे हैं पर प्राइमर बाइंडिंग दृश्यों के लिए खोज करने के लिए अनुमति देते हैं, इसी तरह पोस्ट-bisulfite उपचार के लिए ।
  2. इष्टतम और निष्पक्ष प्रवर्धन के लिए, प्राइमरों में CpG dinucleotides से बचने और 100-300 बीपी के बीच amplicon आकार डिजाइन ।
  3. यह सुनिश्चित करें कि डिजाइन प्राइमरों mitochondrial डीएनए के लिए विशिष्ट है BiSearch समारोह प्राइमर खोजका उपयोग कर रहे हैं । पहले से ही डिजाइन bisulfite परिवर्तित प्राइमरों डालें, bisulfite बॉक्स टिक और एक संदर्भ जीनोम और पीसीआर मापदंडों में शामिल हैं ।
    नोट: संभव पीसीआर उत्पादों की एक सूची प्रदर्शित किया जाएगा ।
  4. शीर्ष 1-5 प्राइमर दृश्यों की प्रतिलिपि बनाएँ और उन्हें oligonucleotide संश्लेषण के लिए एक आदेश के रूप में पेस्ट करें ।
    नोट: लैब में मान्य किया गया मानव और माउस mtDNA प्राइमरी दृश्यों की एक सूची तालिका 1में प्रदर्शित की जाती है ।
  5. परीक्षण प्राइमर का उपयोग bisulfite परिवर्तित पीसीआर निंनलिखित agarose जेल ट्रो चरण 4 में वर्णित के रूप में । परीक्षण और अलग से सभी प्राइमरी जोड़े का अनुकूलन और सही amplicon आकार agarose जेल पर प्रकट होता है सुनिश्चित करते हैं ।
    नोट: यदि मल्टीप्लेक्सिंग प्राइमरों की जरूरत है, एक एकल पीसीआर प्रतिक्रिया करने के लिए एकाधिक प्राइमरों जोड़ सकते है और agarose जेल ट्रो पर पीसीआर उत्पादों की कल्पना या, एक और अधिक resolutive विधि जैसे polyacrylamide जेल ट्रो, समान के उत्पादों को भेद करने के लिए आकार.

4. Bisulfite परिवर्तित पीसीआर और जेल निष्कर्षण

  1. रुचि के क्षेत्रों बढ़ाना, एक गर्म शुरू Taq पोलीमरेज़ का उपयोग कर पीसीआर प्रदर्शन । संक्षेप में, मिश्रण १०० एनजी परिवर्तित डीएनए, ५०० µ एम भावना और विरोधी भावना प्राइमरों, 1 µ l dNTP मिश्रण (प्रत्येक dNTP के 10 µ मी), और पोलीमरेज़ पर ७.५ U/प्रतिक्रिया कुल मात्रा में ५० µ l. निम्नलिखित शर्तों के साथ पीसीआर चलाने: ९५ ° c (६० s ९४ ° c; ६० एस ५५ ° c *; ६० एस पर 5 मिनट ७२ ° c) ३५ चक्र; arrow 10 मिनट ७२ ° c । प्राइमरों का उपयोग या तो अलग से या मल्टीप्लेक्स ।
  2. वैकल्पिक: जब division प्राइमरों, उपयोग २०० एनजी परिवर्तित डीएनए और निंनलिखित साइकिल चालन की स्थिति: 5 मिनट ९५ ° c (६० एस ९४ ° c; ९० एस ५५ ° c *; ९० एस ७२ ° c) ३५ चक्र; arrow 10 मिनट ७२ ° c ।
    नोट: तापमान प्राइमरों के पिघलने के तापमान के आधार पर भिन्न हो सकते हैं ।
  3. विषय पीसीआर उत्पादों पर 2% agarose पर जेल ट्रो करने के लिए १०० वोल्ट.
  4. कोमल यूवी प्रकाश के तहत, एक स्केलपेल के साथ पीसीआर उत्पादों को निकालने और microtubes में जोड़ें । डीएनए क्षति से बचने के लिए अत्यधिक यूवी प्रकाश के लिए पीसीआर उत्पादों का पर्दाफाश नहीं है । 30 एस से अधिक जोखिम समय से बचें ।
  5. पहले3वर्णित के रूप में जेल शुद्धिकरण का उपयोग कर पीसीआर उत्पादों को शुद्ध ।
  6. ४.५ कदम से शुद्ध डीएनए मात्रा fluorometry का उपयोग कर । -20 ° c पर चरण 5 या संग्रह नमूने के लिए आगे बढ़ें ।

5. Bisulfite अनुक्रमण पुस्तकालय की तैयारी

  1. bisulfite-परिवर्तित पीसीआर उत्पादों की लाइब्रेरी तैयारी निष्पादित करें ।
    वैकल्पिक: मल्टीप्लेक्स पीसीआर उत्पादों इस स्तर पर ।
  2. पीसीआर उत्पाद के १०० एनजी तक का उपयोग कर अंत-मरंमत प्रदर्शन । 3 µ एल अंत तैयारी एंजाइम और ६.५ µ l अंत मरंमत प्रतिक्रिया बफर (10x) एक ०.२ मिलीलीटर ट्यूब में ५५.५ µ l पीसीआर उत्पाद जोड़ें । प्लेस और एक थर्मल साइकिल चालक में 30 मिनट के लिए 20 डिग्री सेल्सियस ६५ डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के बाद में ट्यूब मशीन ।
  3. Ligate अनुक्रमण एडेप्टर 15 µ एल कुंद/टा ligase मिश्रण, २.५ µ एल अनुकूलक और 1 µ एल बंधाव बढ़ाने के साथ अंत मरंमत डीएनए को मिलाकर । यदि इनपुट के रूप में < 100 एनजी पीसीआर उत्पाद का उपयोग कर रहा है, अनुकूलक पतला 10 बार ।
  4. एक थर्मल साइकिल चालक में मिश्रण (चरण ५.३) प्लेस और 20 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट की मशीन । थर्मल साइकिल चालक को थामने और ट्यूब करने के लिए 3 µ एल उपयोगकर्ता एंजाइम जोड़ें । मिश्रण और थर्मल साइकिल चालक में ट्यूब वापस जगह और ३७ डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट की मशीन ।
  5. आकार ठोस चरण प्रतिवर्ती स्थिरीकरण (SPRI) मोतियों की माला के साथ डीएनए को पीसीआर उत्पाद के आकार पर निर्भर करता है के अनुपात के साथ का उपयोग करके एडेप्टर ligated डीएनए का चयन करें ।
  6. Add १३.५ µ l H2O को अनुकूलक-ligated डीएनए से कदम ५.४ और ५५ µ l reसस्पैंड SPRI मोतियों से । एक चुंबकीय स्टैंड पर 5 मिनट और जगह ट्यूब के लिए कमरे के तापमान पर मशीन । जब समाधान स्पष्ट है, एक नई ट्यूब के लिए supernatant हस्तांतरण और मोती युक्त ट्यूब त्यागें ।
    नोट: supernatant एडेप्टर-ligated डीएनए और बड़े अवांछित टुकड़े त्याग मोतियों के लिए बाध्य कर रहे हैं शामिल हैं ।
  7. जोड़ें 25 µ एल ५.६ कदम से supernatant को reसस्पैंड SPRI मोती, मिश्रण और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए मशीन । ट्यूब को चुंबकीय स्टैंड पर रखें और समाधान स्पष्ट होने पर supernatant को त्याग दें ।
    नोट: खारिज supernatant में अवांछित डीएनए होता है, जबकि अनुकूलक-ligated डीएनए मोतियों से बंधा होता है ।
  8. जबकि ट्यूब चुंबकीय स्टैंड पर है, मोतियों को धोने के लिए २०० µ एल ८०% इथेनॉल (हौसले से तैयार) जोड़ें । मशीन 30 एस और निकालें और supernatant को त्यागें । इस चरण को कुल 2 धुल के लिए दोहराएं ।
  9. 5 मिनट के लिए एयर ड्राई मोती जबकि ट्यूब एक खुले ढक्कन के साथ चुंबकीय स्टैंड पर है ।
  10. चुंबक से ट्यूब निकालें, डीएनए को 23 µ l रेफरेंस बफर और मिक्स में elute । 2 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मशीन ।
  11. ट्यूब को एक चुंबकीय स्टैंड पर रखें और जब समाधान स्पष्ट हो जाए, तो 2 µ l को एक ९६-खैर पीसीआर प्लेट को प्री-पीसीआर प्रवर्धन (स्टेप ५.१४) के लिए ट्रांसफर कर दीजिये ।
  12. पीसीआर प्रवर्धन (चरण ५.१७) के लिए एक नया ०.२ एमएल ट्यूब करने के लिए बाकी लगभग 21 µ एल स्थानांतरण ।
    नोट: मोतियों के रूप में किसी भी मोती हस्तांतरण नहीं यकीन है कि अगले कदम के एंजाइमी प्रतिक्रियाओं को बाधित कर सकते हैं ।
  13. चरण ५.१४ या स्टोर नमूनों पर-20 डिग्री सेल्सियस के लिए आगे बढ़ें ।
  14. qPCR द्वारा पूर्व पीसीआर प्रवर्धन प्रदर्शन करने के लिए अनुकूलक-ligated डीएनए बढ़ाना आवश्यक चक्र की संख्या का अनुमान है । प्रति प्रतिक्रिया, ९६-well में निंनलिखित जोड़ें पीसीआर प्लेट 2 µ l डीएनए युक्त (चरण ५.११): ०.४ µ एल इंडेक्स प्राइमरी, ०.४ µ एल यूनिवर्सल पीसीआर प्राइमरी, ७.२ µ एल एच2ओ, 10 µ एल आरटी-qPCR मास्टर मिक्स ।
  15. एक वास्तविक समय पीसीआर मशीन में थाली प्लेस और निम्नलिखित शर्तों के लिए थाली विषय: 30 एस ९८ ° c (10 एस ९८ ° c; ७५ एस ६५ ° c) 20 चक्र; arrow 5 min ६५ ° c.
  16. एक सीटी-मान पूर्व-प्रवर्धन RT-qPCR की पीसीआर प्रतिक्रिया के रैखिक चरण के अंत करने के लिए इसी के मूल्य को घटा कर प्रत्येक नमूने के लिए आवश्यक प्रवर्धन चक्र की संख्या का अनुमान लगाएं.
  17. अनुकूलक बढ़ाना-चरण ५.१२ से ligated डीएनए मिक्स करके: 21 µ एल डीएनए, 25 µ एल पीसीआर मास्टर मिक्स, 1 µ एल इंडेक्स प्राइमरी, 1 µ एल यूनिवर्सल पीसीआर प्राइमरी और 2 µ एल एच2ओ । एक थर्मल साइकिल चालक में, निंनलिखित शर्तों के प्रत्येक नमूने के अधीन: 30 एस ९८ ° c (10 एस ९८ ° c; ७५ एस ६५ ° c) [चरण ५.१६ से गणना सीटी] चक्र; arrow 5 min ६५ ° c.
    नोट: केवल मल्टीप्लेक्स के लिए अनुमति देने के लिए प्रति नमूना एक इंडेक्स प्राइमर का उपयोग करने के लिए याद रखें । इस दौरान पीसीआर को इंडेक्स डाला जाता है ।
  18. प्रवर्धित डीएनए SPRI मोतियों और elute को 22 µ एल रेफरेंस बफर में शुद्ध करें ।
  19. जेल ट्रो या वैकल्पिक विधि द्वारा नियंत्रण पुस्तकालय की गुणवत्ता । सही पुस्तकालय पीक आकार (पीसीआर उत्पाद (एस) आकार प्लस अनुकूलक) के लिए देखो ।
  20. विश्लेषण के आधार पर लाइब्रेरी उत्पाद (मों) के औसत बेस-युग्म आकार का अनुमान लगाएं: उंनत वैश्विक सेटिंग में, धब्बा विश्लेषण के अंतर्गत "तालिका" पर डबल-क्लिक करें । 100-1000 bp से क्षेत्र को परिभाषित और ठीकक्लिक करें । क्षेत्र तालिकाके अंतर्गत, निर्धारित क्षेत्र प्रकट होता है और लायब्रेरी औसत आकार (bp) परिकलित की जाती है ।
  21. fluorometry द्वारा पुस्तकालयों यों । चरण 6 या-20 ° c पर लायब्रेरीज़ संग्रहीत करने के लिए आगे बढ़ें ।

6. अगली पीढ़ी sequencing

  1. सूत्र का उपयोग कर पुस्तकालयों के एनएम एकाग्रता की गणना:
    Equation
  2. एक ही एनएम एकाग्रता जैसे पुस्तकालयों पतला 2 एनएम (4 एनएम चुनें, 2 एनएम, 1 एनएम, या ०.५ समुद्री मील दूर पुस्तकालय सांद्रता के आधार पर) । पूल सभी पुस्तकालयों 2 एनएम पुस्तकालयों के एक पूल को प्राप्त करने के लिए ।
  3. स्वभाव और अनुक्रमण साधन गाइड के बाद पुस्तकालयों को पतला । संक्षेप में: प्रकृति 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ०.२ एन NaOH और गर्मी जोड़कर 2 एनएम पूल के लिए 10 बजे के एक अंतिम कमजोर पड़ने के लिए विकृत पूल पतला । स्वभाव और १२.५ pM के एक अंतिम कमजोर पड़ने के लिए एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नियंत्रण पुस्तकालय पतला । एक नई ट्यूब के लिए, 20% १२.५ प्रधानमंत्री नियंत्रण पुस्तकालय के साथ 10 बजे पूल मिश्रण ।
    नोट: Bisulfite रूपांतरण बहुत कम जटिलता का परिचय देता है । 20% नियंत्रण पुस्तकालय कील में बेहतर अनुक्रमण गुणवत्ता में परिणाम होगा ।
  4. एक गहरी अनुक्रमण साधन का उपयोग कर एक १५० bp युग्मित-अंत sequencing चलाएँ ।

7. गणनात्मक विश्लेषण-मिथाइल स्तर का अनुमान

  1. . fastq फ़ाइलें (यहां sample1_R1. fastq. gz और sample1_R2. fastq. gz) कहा जाता है, ब्याज के पूरे जीनोम के एक bismark सूचकांक उत्पंन (यहां एक फ़ोल्डर में bismarkIndexकहा जाता है) और सुनिश्चित करें कि जीनोमिक के chrM अनुक्रम फसता में उपलब्ध है स्वरूप (यहां chrMनामक फ़ोल्डर में) ।
  2. पूर्व प्रक्रिया के लिए एडाप्टर और प्राइमरों द्वारा शुरू पूर्वाग्रह को दूर पढ़ता: उपकरण Trim_galore३३का उपयोग करें । आगे और रिवर्स दोनों के 5 ' अंत से दो न्यूक्लियोटाइड निकालें पढ़ता है ।
    trim_galore--clip_R1 2--clip_R2 2-o./--trim1--मीन्स sample1_R1. fastq. gz sample1_R2. fastq. gz
  3. Bismark३४ का उपयोग करके संपूर्ण जीनोम में पूर्व-संसाधित पढ़ता संरेखित करें
    bismark--सामंजस्य स्थापित--bam-o././bismarkIndex/-1./sample1_R1_val_1.fq.gz-2./sample1_R2_val_2.fq.gz
    नोट: यदि किसी अन्य संरेखण का उपयोग किया जाता है, तो सुनिश्चित करें कि जो अनन्य रूप से संरेखित नहीं किया जा सकता जो पढ़ता है छोड़ दिया है ।
  4. निकालें पढ़ता गुणसूत्र एम को मानचित्रण, यहां का उपयोग कर Samtools३५
    samtools सॉर्ट-l 0-ओ bam-o sample1_sorted. bam
    sample1_R1_val_1_bismark_bt2_pe. bam
    samtools index sample1_sorted. bam
    samtools दृ-यू sample1_sorted. bam chrM | samtools मीडियाकर्मी-n-ओ bam-o sample1_chrM. bam
  5. मिथाइल जानकारी निकालें
    bismark_methylation_extractor-पृ--CX--cytosine_report--कारगार--genome_folder./chrM./sample1_chrM.bam
  6. आगे के विश्लेषण के लिए. bedGraph,. cov या CX_report. txt फ़ाइलों का उपयोग करें । विज़ुअलाइज़ेशन और परीक्षण के लिए sample1_chrM. CX_report. txt फ़ाइल का उपयोग करें ।
  7. आगे की प्रक्रिया में कतरन प्रदर्शन, यदि कई क्षेत्रों में पूछताछ कर रहे है और एक प्राइमर पूर्वाग्रह एम पूर्वाग्रह मानचित्रण के दौरान उत्पंन भूखंडों में दिखाई जा सकती है । अधिक जानकारी के लिए Bismark दस्तावेज़ीकरण देखें ।

8. गणनात्मक विश्लेषण-मतभेदों का परीक्षण

  1. सुनिश्चित करें कि CX_report. txt फ़ाइल 7 कॉलम, गुणसूत्र (यहां chrM), स्थिति, किनारा, methylated की संख्या पढ़ता है, unmethylated की संख्या पढ़ता है, सी संदर्भ और आसपास के अनुक्रम, गुणसूत्र एम पर हर सी के लिए ।
  2. के रूप में CX_report अपनी संपूर्णता में chrM कवर, क्षेत्र (ओं) को परिलक्षित है जो सबसेट की जांच करें ।
  3. नमूनों के बीच अंतर के लिए गैर-पैरामीट्रिक परीक्षणों का उपयोग करें, जैसे कि एक पूरे क्षेत्र के लिए अलग सी या एक साइन-परीक्षण के लिए एक मछली के सटीक परीक्षण ।
    नोट: ठहराव अक्सर 0% मिथाइल के करीब हो जाएगा, जो कारण है कि सामांय रूप से संभालने उचित नहीं है ।
  4. इसी तरह, दृश्य के लिए, या तो quantiles कल्पना या द्विपद अनुपात विश्वास अंतराल की गणना ।

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल में दो कदम महत्वपूर्ण जब mtDNA मिथाइल की जांच कर रहे हैं । 1) माध्यमिक संरचना के उद्घाटन और 2) mitochondrial डीएनए के डिजाइन विशिष्ट प्राइमरों ।

प्रतिबंध एंजाइम BamHI (चित्रा 1) के साथ मानव जीनोमिक डीएनए को पचाने के द्वारा, mitochondrial डीएनए संरचना न्यूक्लियोटाइड स्थिति १४,२५८ पर काटा जाएगा और द्वितीयक संरचना खोला जाएगा ।

एक बरकरार mtDNA माध्यमिक संरचना के साथ bisulfite रूपांतरण की संभावित हानि बहुत mtDNA अनरूपांतरण दर का अनुमान लगाने की संभावना है । bisulfite अनुक्रमण द्वारा, mtDNA unकनवर्ज़न दर की जांच की गई, मानव कंकाल मांसपेशी कोशिकाओं से अपच और पचा कुल डीएनए में, mitochondrial जीनोम के 5 विभिंन क्षेत्रों में: विस्थापन पाश (डी पाश), tRNA फेनिलएलनिन और 12S ribosome (tRNA-च + 12S), 16S ribosome (16S), नध डिहाइड्रोजनेज ५ (ND5) और cytochrome बी (CYTB) mRNA-एन्कोडिंग जीन (चित्रा २). अनरूपांतरण दर के सभी जांच क्षेत्रों में 0-१५.१% से लेकर अपच mtDNA के लिए । हालांकि, जब bisulfite रूपांतरण से पहले डीएनए को पचा लिया गया था, तो रूपांतरण दर सभी क्षेत्रों में अधिकतम 1% तक गिरा दी गई (चित्र 3) । इस प्रकार, bisulfite रूपांतरण से पहले BamHI पाचन के महत्व को illustrating mtDNA मिथाइल स्तर के अधिक से अधिक आकलन से बचने के लिए ।

परमाणु डीएनए के संदूषण अपरिहार्य है जब mitochondrial जीनोम अलग और के बाद से लगभग पूरे mitochondrial जीनोम परमाणु जीनोम में दोहराया गया है, यह mitochondrial जीनोम के परमाणु निवेशन को जंम दिया है परमाणु शब्द MiTochondrial खण् ड (NUMTs)३६। यह सुनिश्चित करने के लिए कि डीएनए मिथाइल का विश्लेषण स्तर डीएनए mitochondrial और नहीं NUMTs के अनुरूप है, यह सबसे बाहरी महत्व का है कि mitochondrial जीनोम के लिए विशिष्ट है डिजाइन प्राइमरों । चित्रा 4 दिखाता है कैसे प्राइमर विशिष्टता और तालिका 1 दिखाता है मानव और माउस mtDNA प्राइमरी दृश्यों की जांच करने के लिए ।

नाम अनुक्रम स्थिति Amplicon आकार एनीलिंग तापमान कतरा
मानव
डी-लूप च: AAATCTATCACCCTATTAAC
R: GTGGAAATTTTTTGTTATGATGT 6-298 २९२ 55 ° c Antisense
डी-लूप च: CATAACAAAAAATTTCCACCAAAC
R: GGGAAAATAATGTGTTAGTT 279-458 १७९ 55 ° c Antisense
12S + TF च: TTTATATAACTTACCTCCTC
R: GTGTTTGATGTTTGTTTTTTTTG 577-765 १८८ 55 ° c Antisense
16S च: AATAAATTTATAGGTTTTTAAATTATTAAAT
R: TAACTAATAAAATCTTAACATATACTACTC 2763-2873 ११० 53 डिग्री सेल्सियस भावना
CYTB च: GGTATTATTTTTTTGTTTGTAATTATAGTA
R: CCTCAAATTCATTAAACTAAATCTATCC 15091-15243 १५२ 55 ° c भावना
माउस
12S च: ACACATACAAACCTCCATAAAC
R: GAGGTATAATTTAGTTAAAT 111-287 १७६ 53 डिग्री सेल्सियस Antisense
16S च: AAATTCCAATTCTCCAAACATAC
R: TTTGGATTTTTTTTTTAGGT 1749-1896 १४७ 53 डिग्री सेल्सियस Antisense
CYTB च: CTACAAAAACACCTAATAACAAAC
R: AGTGTATGGTTAAGAAAAGA 14129-14307 १७८ 55 ° c Antisense
16S च: AGAGAAATAGAGTTATTTTATAAATAAG
R: CTAAAAACAAAATTTTAAATCTTAC 2576-2727 १५१ 55 ° c भावना
ND5 च: TTAAGTTAATTAGGTTTGATAATAGTGA
R: TAAAACCCTATTAAAAATAATATTCCTATA 12659-12910 २५१ 55 ° c भावना
CYTB च: TGGGTTTTTTTTAGGAGTTTGTTTA
R: CAATAAAAATACTCCAATATTTCAAATTTC 14242-14504 २६२ 55 ° c भावना

तालिका 1: मानव और माउस mtDNA के लिए प्राइमर अनुक्रम । ध्यान दें कि पीसीआर प्राइमरों के एनीलिंग तापमान प्राइमरों के पिघलने के तापमान में अंतर के कारण बदलती हैं ।

Figure 1
चित्र 1 : BamHI-पच, या अपच डीएनए की जेल ट्रो । मानव कंकाल की मांसपेशी से जीनोमिक डीएनए अनुपचारित या 37 डिग्री सेल्सियस पर 4h के लिए BamHI के साथ इलाज किया गया था और जेल ट्रो एक १.५% agarose जेल पर चलाया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 : मानव mitochondrial जीनोम का नक्शा. mitochondrial जीनोम के क्षेत्रों bisulfite अनुक्रमण द्वारा जांच की और BamHI प्रतिबंध एंजाइम साइट प्रदर्शित कर रहे हैं । mitochondrial डीएनए में 13 mRNAs, 2 राइबोसोमल RNAs, और 22 ट्रांसफर RNAs हैं । संक्षिप्त: PH1: भारी-कतरा प्रमोटर 1; PH2: भारी-कतरा बढ़ावा 2; पीएल: प्रकाश किनारा प्रमोटर; ओह: भारी-कतरा से प्रतिकृति की उत्पत्ति; ओएल: प्रकाश से प्रतिकृति की उत्पत्ति-कतरा । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3 : bisulfite रूपांतरण से पहले BamHI पाचन मानव कंकाल मांसपेशियों की कोशिकाओं में mtDNA अनरूपांतरण दर को कम कर देता है । bisulfite अनुक्रमण द्वारा, अपच और पचा mitochondrial डीएनए रूपांतरण प्रतिशत मानव कंकाल मांसपेशी कोशिकाओं (N= 3) में mitochondrial जीनोम के पांच विभिंन क्षेत्रों में पूछताछ की गई । पूर्ण वर्ग CpG साइटों का प्रतिनिधित्व करता है, और खुले वर्ग गैर CpG साइटों का प्रतिनिधित्व करता है । परिणाम एक ंयूनतम-अधिकतम अंतराल के साथ प्रस्तुत कर रहे है और एक हस्ताक्षर परीक्षण के लिए महत्वपूर्ण unकनवर्ज़न मतभेद के लिए परीक्षण किया गया था । D-पाश (6-298) P= 1.83 e-४२; D-पाश (279-458): प= 4.55 e-13; tRNA-च + 12S: प= 8.38 e-16; 16S: P= 5.91 e-06; ND5: P= 1.70 ई-05; CYTB: प=)-10. D-पाश (6-298) प्रतिकृति और tRNA के मूल शामिल-F + 12S भारी किनारा प्रमोटर 2 शामिल हैं । इन आंकड़ों को 3कहीं प्रकाशित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : Bisearch का उपयोग करने के लिए mitochondrial जीनोम के प्रति प्राइमर विशिष्टता सत्यापित करने के लिए । क) Bisulfite-रूपांतरित प्राइमरी दृश्यों को BiSearch फंक्शन प्राइमरी सर्च (http://bisearch.enzim.hu/?m=genompsearch) में जोड़ दिया जाता है. bisulfite बॉक्स टिक गया है, और एक संदर्भ जीनोम चयनित है । ख) नब्ज और antisense चेन पर उत्पंन संभावित पीसीआर उत्पादों का उदाहरण । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

यहाँ, हम विशेष रूप से mtDNA मिथाइल पूछताछ करने के लिए बनाया गया है जो एक bisulfite अनुक्रमण प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं. जीनोमिक डीएनए के लिए इस्तेमाल bisulfite-अनुक्रमण प्रोटोकॉल के साथ मतभेद एक पूर्व प्रतिबंध एंजाइम पाचन कदम के उपयोग में निहित है और एक bioinformatic विश्लेषण NUMT दृश्यों से उत्पन्न झूठी सकारात्मक बाहर सत्तारूढ़.

हम mtDNA मिथाइल की जांच करते समय bisulfite-अनुक्रमण कलाकृतियों से बचने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं । Bisulfite अनुक्रमण झूठी सकारात्मक के लिए अग्रणी कलाकृतियों पहले३७की सूचना दी गई । proteinase K द्वारा डीएनए गौण प्रोटीन की अपर्याप्त हटाने का वर्णन किया गया है३७। अपूर्ण विकार या आंशिक reannealing का नेतृत्व कर सकते है अपूर्ण रूपांतरण के हिस्सों, संभवतः के लिए bisulfite का उपयोग कम से एकल-असहाय डीएनए३७। बाद में विरूपण साक्ष्य mtDNA में खेलने में हो सकता है, जहां एक द्वितीयक संरचना cytosines का उपयोग ख़राब होगा । हमारे ज्ञान का सबसे अच्छा करने के लिए, एक प्रतिबंध एंजाइम पाचन mtDNA मिथाइल का आकलन करने के संदर्भ में bisulfite रूपांतरण से पहले कदम के अलावा पहले २०१६3,28में बताया गया है । हमारे हाथ में भी, एक एकल कटर प्रतिबंध एंजाइम के साथ पहले पाचन नाटकीय रूप से unकन्वर्ट cytosines3,28का पता लगाने कम ।

यहाँ, हम bisulfite अनुक्रमण परिणामों का विश्लेषण करने के लिए और पूरे mitochondrial जीनोम bisulfite अनुक्रमण के संदर्भ में bisulfite अनुक्रमण कलाकृतियों का पता लगाने के लिए एक bioinformatic पाइपलाइन प्रदान करते हैं । इस विधि mtDNA गैर-कनवर्ज़न दर व्युत्क्रम sequencing गहराई3,28के साथ संबद्ध किया गया था कि हमारे अवलोकन से उत्पन्न होती है । इस अवलोकन से पता चलता है कि माध्यमिक और mtDNA के भी तृतीयक संरचना अनुक्रमण पुस्तकालयों के निर्माण के दौरान विशिष्ट क्षेत्रों में mtDNA के विखंडन बिगड़ती है और भी mtDNA करने के लिए सोडियम bisulfite का पूरा उपयोग ख़राब कर सकता है । के बाद से एक एक कटर एंजाइम के साथ पाचन माध्यमिक और तृतीयक संरचनाओं विज्ञप्ति, हमारे परिणाम संकेत मिलता है कि mtDNA संरचना bisulfite विरूपण साक्ष्य का एक स्रोत है और mtDNA में cytosine मिथाइल के ठहराव के लिए यहां वर्णित तरीकों को मांय ।

mitochondrial तैयारी में परमाणु डीएनए के अपरिहार्य संदूषण एक चुनौती का गठन । इस अनुक्रमण में NUMT अनुक्रम में संदूषण की ओर जाता है पढ़ता है, जो mtDNA में cytosine मिथाइल का आकलन पूर्वाग्रह हो सकता है, यहां तक कि जब लक्षित और नहीं पूरे mitochondrial जीनोम bisulfite अनुक्रमण प्रदर्शन । इस तरह के पूर्वाग्रह से बचने के लिए, अद्वितीय bisulfite अनुक्रमण प्राइमरों के डिजाइन NUMTs पर मिथाइल के साथ संदूषण को बाहर करने के लिए अनुमति देता है । NUMTs span १००% पहचान के साथ मानव और माउस mitochondrial जीनोम के कुछ क्षेत्रों, और यह है, इसलिए, असंभव कुछ mtDNA क्षेत्रों में अद्वितीय प्राइमरों डिजाइन करने के लिए । पूरे mitochondrial जीनोम bisulfite अनुक्रमण प्रदर्शन करते समय, sequencing लंबी पढ़ता mtDNA और NUMTs के बीच भेदभाव को कम कर सकते हैं । पूरे जीनोम के लिए पढ़ता है और केवल उपयोग mitochondrial जीनोम के लिए मैप विशिष्ट पुस्तकें आगे mtDNA मिथाइल का पता लगाने सुनिश्चित कर सकते हैं ।

अंत में, इस प्रोटोकॉल mitochondrial जीनोम से परे इस्तेमाल किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, bisulfite अनुक्रमण के अंय उदाहरणों में जहां डीएनए के माध्यमिक संरचना विरूपण साक्ष्य का एक संभावित स्रोत का प्रतिनिधित्व करता है । मिथाइल स्तर और अनुक्रमण गहराई के बीच एसोसिएशन जटिल डीएनए दृश्यों के bisulfite अनुक्रमण करने से पहले एक प्रतिबंध एंजाइम के साथ एक पाचन के लिए की जरूरत का आकलन करने के लिए जांच की जा सकती है ।

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Disclosures

लेखकों की कोई होड़ वित्तीय हितों की घोषणा नहीं है.

Acknowledgments

नोवो Nordisk फाउंडेशन बुनियादी चयापचय अनुसंधान के लिए केंद्र कोपेनहेगन के विश्वविद्यालय में एक स्वतंत्र अनुसंधान केंद्र आंशिक रूप से नोवो Nordisk फाउंडेशन से एक अप्रतिबंधित दान द्वारा वित्त पोषित है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BamHI New England BioLabs # R0136
EZ DNA methylation-lightning kit Zymo Research # D5030 
Qubit ssDNA assay Thermo Fisher Scientific # Q10212
Qubit assay tubes Thermo Fisher Scientific # Q32856
HotStarTaq plus DNA polymerase kit Qiagen # 203603 
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen # 28704
NEBNext Ultra DNA Library Kit for Illumina New England BioLabs # E7370S
NEBNext Multiplex Oligoes for Illumina New England BioLabs # E7335S
AMPure XP Beads Beckman Coulter # A63881
High Sensitivity DNA chip Agilent # 5067-4626
Qubit high sensitivity dsDNA assay Thermo Fisher Scientific # Q33230
MiSeq reagent kit v2 300 cycles Illumina # MS-102-2003
PhiX control v3 Illumina # FC-110-3001
Sodium hydroxide  Sigma # S5881
Thermal cycler C1000 Biorad # 1851148
CFX96 Real-Time PCR detection system Biorad  #1855195
Qubit Fluorometer Thermo Fisher Scientific # Q33226
Bioanalyzer 2100 Agilent # G2939BA
MiSeq instrument Illumina # SY-410-1003

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References

  1. Falkenberg, M., Larsson, N. -G., Gustafsson, C. M. DNA replication and transcription in mammalian mitochondria. Annu Rev Biochem. 76, 679-699 (2007).
  2. Kolesar, J. E., Wang, C. Y., Taguchi, Y. V., Chou, S. -H., Kaufman, B. A. Two-dimensional intact mitochondrial DNA agarose electrophoresis reveals the structural complexity of the mammalian mitochondrial genome. Nucleic Acids Res. 41 (4), e58 (2013).
  3. Mechta, M., Ingerslev, L. R., Fabre, O., Picard, M., Barres, R. Evidence Suggesting Absence of Mitochondrial DNA Methylation. Front Genet. 8, 166 (2017).
  4. Ehrlich, M., Gama-Sosa, M. A., et al. Amount and distribution of 5-methylcytosine in human DNA from different types of tissues of cells. Nucleic Acids Res. 10 (8), 2709-2721 (1982).
  5. Lister, R., Pelizzola, M., et al. Human DNA methylomes at base resolution show widespread epigenomic differences. Nature. 462 (7271), 315-322 (2009).
  6. Yan, J., Zierath, J. R., Barres, R. Evidence for non-CpG methylation in mammals. Exp Cell Res. 317 (18), 2555-2561 (2011).
  7. Patil, V., Ward, R. L., Hesson, L. B. The evidence for functional non-CpG methylation in mammalian cells. Epigenetics. 9 (6), 823-828 (2014).
  8. Nass, M. K. Differential methylation of mitochondrial and nuclear DNA in cultured mouse, hamser and virus trasnforemd hamser cells in vivo and in vitro methylation. J Mol Biol. 80 (1), 155-175 (1973).
  9. Shock, L. S., Thakkar, P. V., Peterson, E. J., Moran, R. G., Taylor, S. M. DNA methyltransferase 1, cytosine methylation, and cytosine hydroxymethylation in mammalian mitochondria. PNAS. 108 (9), 3630-3635 (2011).
  10. Bellizzi, D., D'Aquila, P., et al. The Control Region of Mitochondrial DNA Shows an Unusual CpG and Non-CpG Methylation Pattern. DNA Res. 20 (6), 537-547 (2013).
  11. Jia, Y., Li, R., et al. Maternal Low-Protein Diet Affects Epigenetic Regulation of Hepatic Mitochondrial DNA Transcription in a Sex-Specific Manner in Newborn Piglets Associated with GR Binding to Its Promoter. PLoS ONE. 8 (5), e63855 (2013).
  12. Jia, Y., Song, H., Gao, G., Cai, D., Yang, X., Zhao, R. Maternal Betaine Supplementation during Gestation Enhances Expression of mtDNA-Encoded Genes through D-Loop DNA Hypomethylation in the Skeletal Muscle of Newborn Piglets. J Agric Food Chem. 63 (46), 10152-10160 (2015).
  13. Infantino, V., Castegna, A., Iacobazzi, F., Spera, I. Impairment of methyl cycle affects mitochondrial methyl availability and glutathione level in Down's syndrome. Mol Genet Metab. 102 (3), 378-382 (2011).
  14. Chen, H., Dzitoyeva, S., Manev, H. Effect of valproic acid on mitochondrial epigenetics. Eur J Pharmacol. 690 (1-3), 51-59 (2012).
  15. Dzitoyeva, S., Chen, H., Manev, H. Effect of aging on 5-hydroxymethylcytosine in brain mitochondria. Neurobiol Aging. 33 (12), 2881-2891 (2012).
  16. Menga, A., Palmieri, E. M., et al. SLC25A26 overexpression impairs cell function via mtDNA hypermethylation and rewiring of methyl metabolism. FEBS J. 284 (6), 967-984 (2017).
  17. Frommer, M., McDonald, L. E., et al. A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands. PNAS. 89 (5), 1827-1831 (1992).
  18. Byun, H. -M., Panni, T., et al. Effects of airborne pollutants on mitochondrial DNA Methylation. Part Fibre Toxicol. 10 (1), 1 (2013).
  19. Janssen, B. G., Byun, H. -M., Gyselaers, W., Lefebvre, W., Baccarelli, A. A., Nawrot, T. S. Placental mitochondrial methylation and exposure to airborne particulate matter in the early life environment: An ENVIRONAGE birth cohort study. Epigenetics. 10 (6), 536-544 (2015).
  20. Zheng, L. D., Linarelli, L. E., et al. Insulin resistance is associated with epigenetic and genetic regulation of mitochondrial DNA in obese humans. Clin Epigenetics. 7 (1), 1739 (2015).
  21. Byun, H. -M., Colicino, E., Trevisi, L., Fan, T., Christiani, D. C., Baccarelli, A. A. Effects of Air Pollution and Blood Mitochondrial DNA Methylation on Markers of Heart Rate Variability. J Am Heart Assoc. 5 (4), (2016).
  22. Bianchessi, V., Vinci, M. C., et al. Mitochondrion. MITOCH. 27 (C), 40-47 (2016).
  23. Wijst, M. G. P., van Tilburg, A. Y., Ruiters, M. H. J., Rots, M. G. Experimental mitochondria-targeted DNA methylation identifies GpC methylation, not CpG methylation, as potential regulator of mitochondrial gene expression. Sci Rep. 7 (1), 177 (2017).
  24. Wong, M., Gertz, B., Chestnut, B. A., Martin, L. J. Mitochondrial DNMT3A and DNA methylation in skeletal muscle and CNS of transgenic mouse models of ALS. Front cellr Neurosci. 7, 279 (2013).
  25. Dawid, I. B. 5-methylcytidylic acid: absence from mitochondrial DNA of frogs and HeLa cells. Science. 184 (4132), 80-81 (1974).
  26. Gama-Sosa, M. A. Levels and distribution of 5-methylcytosine in Chordate DNA. , 1-201 (1985).
  27. Hong, E. E., Okitsu, C. Y., Smith, A. D., Hsieh, C. -L. Regionally specific and genome-wide analyses conclusively demonstrate the absence of CpG methylation in human mitochondrial DNA. Mol Cell Biol. 33 (14), 2683-2690 (2013).
  28. Liu, B., Du, Q., et al. CpG methylation patterns ofhuman mitochondrial DNA. Nature Publishing Group. , 1-10 (2016).
  29. Donkin, I., Versteyhe, S., et al. Obesity and Bariatric Surgery Drive Epigenetic Variation of Spermatozoa in Humans. Cell Metab. 23 (2), 369-378 (2016).
  30. Li, L. C., Dahiya, R. MethPrimer: designing primers for methylation PCRs. Bioinformatics. 18 (11), 1427-1431 (2002).
  31. Tusnády, G. E., Simon, I., Váradi, A., Arányi, T. BiSearch: primer-design and search tool for PCR on bisulfite-treated genomes. Nucleic Acids Res. 33 (1), e9 (2005).
  32. Arányi, T., Váradi, A., Simon, I., Tusnády, G. E. The BiSearch web server. BMC bioinformatics. 7, 431 (2006).
  33. Krueger, F. Trim Galore!. , Available from: http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/ (2018).
  34. Krueger, F., Andrews, S. R. Bismark: a flexible aligner and methylation caller for Bisulfite-Seq applications. Bioinformatics. 27 (11), 1571-1572 (2011).
  35. Li, H., Handsaker, B., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
  36. Ramos, A., Barbena, E., et al. Nuclear insertions of mitochondrial origin: Database updating and usefulness in cancer studies. Mitochondrion. 11 (6), 946-953 (2011).
  37. Warnecke, P. M., Stirzaker, C., Song, J., Grunau, C., Melki, J. R., Clark, S. J. Identification and resolution of artifacts in bisulfite sequencing. Methods (San Diego, Calif). 27 (2), 101-107 (2002).

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Mechta, M., Ingerslev, L. R., Barrès, R. Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation. J. Vis. Exp. (135), e57772, doi:10.3791/57772 (2018).

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