Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll, um genaue Quantifizierung der mitochondrialen DNA (MtDNA) Methylierung. In diesem Protokoll beschreiben wir eine enzymatische Verdauung von DNA mit BamHI gepaart mit einem bioinformatische Analyse Pipeline die Überschätzung der MtDNA Methylierung Ebenen verursacht durch die Sekundärstruktur des MtDNA zu vermeiden verwendet werden können.
Abstract
Quantifizierung der DNA-Methylierung kann erreicht werden mit Bisulfit-Sequenzierung, die Vorteile des Eigentums von Natrium Bisulfit unmethylated Cytosin in Uracil in einem einzelsträngigen DNA-Kontext zu konvertieren. Bisulfit-Sequenzierung können gezielt (mittels PCR) oder auf das gesamte Genom durchgeführt und bietet absolute Quantifizierung von Cytosin Methylierung in der einzigen Basis-Auflösung. Angesichts der deutlichen der nuklearen und mitochondriale DNA, vor allem in der Sekundärstruktur, sollten Anpassungen von Bisulfit Sequenzierung Methoden für die Untersuchung von Cytosin Methylierung in MtDNA erfolgen. Sekundäre und tertiäre Struktur der MtDNA führt in der Tat zu Bisulfit Artefakte zu Fehlalarme aufgrund von unvollständigen Denaturierung schlechte Anbindung von Bisulfit einzelsträngigen DNA-Sequenzierung. Hier beschreiben wir ein Protokoll mit einer enzymatischen Verdauung der DNA mit BamHI gepaart mit bioinformatische Analyse Pipeline ermöglichen genaue Quantifizierung von Cytosin Methylierung Ebenen in MtDNA. Darüber hinaus bieten wir Richtlinien für die Gestaltung von Bisulfit Sequenzierung Primer spezifisch für MtDNA, zur Vermeidung von unerwünschten nuklearen mitochondriale Segmente gezielt (NUMTs) in das Kerngenom eingesetzt.
Introduction
Das mitochondriale Genom ist eine kreisförmige, doppelsträngige Struktur von rund 16,5 Kilo Base (kb) lang, bilden eine schwere und eine leichte Faser. Das mitochondriale Genom ist in mehrere Kopien in jeder Zelle, mütterlich vererbt, und wesentliche Bestandteile der Atmungskette komplexe1kodiert. Ähnlich wie bei bakteriellen Genome und anders als das Kerngenom, des mitochondrialen Genoms in zahlreichen sekundären und tertiären Strukturen, wie z. B. gewickelten und supercoiled Strukturen2, gliedert sich in die Zugang schwierig, während der Sequenzierung machen können Experimente-3.
Im Zellkern ist Methylierung der DNA ein ausgiebig studierte epigenetische Markierung, die in zahlreiche Prozesse, vor allem in der Regulation der Genexpression eine Rolle spielt. In Säugetier-Genome tritt DNA-Methylierung in erster Linie auf der 5-Position der Pyrimidine Ring der Deoxycytidines, meistens auf CG dinucleotid (oder CpG). Cytosin Methylierung findet sich bei 70 % von allen CpG im Erbgut von Körperzellen und Konten für ~ 1 % der gesamten DNA4Basen. DNA-Methylations ist auch in nicht-CpG zusammenhängen, wie CpA, CpT und CpC beschrieben worden und existieren in verschiedenen Mengen in Kern-DNA, mit Werten bis zu 25 % von allen methylierte Cytosines in embryonale Stammzellen5,6,7.
Während Cytosin Methylierung von das Kerngenom weithin anerkannt ist, ist die Existenz der mitochondrialen DNA (MtDNA) Methylierung noch umstritten. Die erste Studie untersucht MtDNA Methylierung erfolgte in kultivierten Zellen wo MtDNA Methylierung bereitwillig erkannt wurde, obwohl auf einem niedrigeren Niveau im Vergleich zu nuklearen DNA-8. In menschlichen und murinen Zellen wurde MtDNA Methylierung auch auf einem niedrigen Niveau (2-5 %) festgestellt. Mit Berufung auf 5 Methylcytosine erfassen wie METHYLIERTE DNA Immunopräzipitation (MeDIP) gefolgt von quantitativen PCR Assays, MtDNA Methylierung wurde auch in verschiedenen Maus und Mensch erkannt und Zellen Linien9,10, 11,12. Mit Antikörpern gegen 5 Methylcytosine in einem ELISA-Test oder Massenspektrometrie, waren wesentliche Ebenen der DNA-Methylierung von gereinigten mitochondriale Fraktionen13,14,15, erkannt. 16. jedoch der Großteil der Assays in den genannten Studien verwendet Techniken, die nicht entworfen waren, um absolute Quantifizierung der DNA-Methylierung in der einzigen Basis-Auflösung bieten.
Quantitative und auflösenden DNA-Methylierung Analyse durch eine Technik namens "Bisulfit Sequenzierung", lässt sich die Vorteile des Eigentums von Natrium Bisulfit unmethylated Cytosin in Uracil in einzelsträngiger DNA Kontext17 konvertieren . Eine Konstellation von Studien erkannt mit Bisulfit-Sequenzierung, die Anwesenheit von Cytosin Methylierung auf verschiedenen Ebenen. Im menschlichen18,19,20,21,22,23 und Maus24 wurde bereitwillig Methylierung MtDNA in der D-Loop-Region, der 12 s oder 16 s Region erkannt. Geweben und Zellen, jedoch mit einer faszinierenden Variabilität, von 1-20 % des gesamten Cytosines in Studien.
Im Vergleich zu diesen zahlreichen Studien haben nur wenige Studien, unter anderem von unserer Fraktion bestritten die Anwesenheit von MtDNA Methylierung3,25,26,27 oder in Frage gestellt die biologische Relevanz der sehr niedrige Niveaus von MtDNA (unter 2 %)28. Vor kurzem berichteten wir die Beobachtung eines potenziellen Bisulfit-Sequenzierung Artefakts in ganzen mitochondriale Bisulfit Sequenzierung3. Wir haben nachgewiesen, die die Sekundärstruktur der mitochondrialen DNA zu Fehlalarmen in Bisulfit-Sequenzierung, könnte damit überschätzen Methylierung Ebenen. Wir bieten hier ein Protokoll um ein Artefakt der Bisulfit-Umwandlung von MtDNA zu verhindern. Dieses Protokoll verwendet eine einfache enzymatische Verdauung von DNA zu stören MtDNA Sekundärstrukturen und vollen Zugriff auf Bisulfit nach einem Bisulfit-Sequenzierung-Protokolls zu ermöglichen. Darüber hinaus bieten wir eine begleitende Bioinformatik-Pipeline für die Analyse von Bisulfit-Sequenzierung.
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Protocol
1. Einschränkung Enzymbehandlung
- Linearisieren Sie MtDNA durch die Behandlung der gesamten menschlichen DNS mit dem Restriktionsenzym BamHI, das an Position 14258 in der menschlichen mitochondrialen DNA schneidet.
Hinweis: Für Maus-DNA, verwenden Sie das Restriktionsenzym BglII unter identischen Bedingungen wie folgt. - Für jede Probe wo MtDNA Methylierung soll beurteilt werden, bereiten ein 0,2 mL Reaktionsgefäß und fügen Sie die folgende Mischung: 3 μg genomischer DNA (gemessen durch Fluorometry), 15 μl Puffer 3, 3 μL BamHI und Wasser bis zu 150 μL
- Platz Rohre in einem Thermocycler für 4 h bei 37 ° C.
(2) Bisulfit-Konvertierung
- BamHI-behandelte DNA mit Natrium Bisulfit an anderer Stelle beschriebenen29zu konvertieren.
- Verwenden Sie 200-500 ng BamHI-behandelte DNA für jede Konvertierung Reaktion in einem Gesamtvolumen von 20 μl. Die DNA-Erholung ist 50-70 %.
- Eluieren Sie Bisulfit umgewandelt DNA in 10 μL Elution Puffer.
- Die einsträngige DNA durch Fluorometry zu quantifizieren.
- Optional: Speichern Sie bevor Sie fortfahren, die restlichen des Protokolls Bisulfit umgewandelt DNA bei-20 ° C. Für die langfristige Lagerung speichern Sie konvertiert Bisulfit DNA bei-80 ° C
3. Gestaltung von Bisulfit Sequenzierung Primer
- Primer für Bisulfit-Sequenzierung mit dem online-Tools Methprimer30 und BiSearch31,32zu entwerfen.
Hinweis: Methprimer und BiSearch lassen sich Grundierung Bindung Sequenzen auf Genomsequenzen suchen wo Cytosines in Thymines, ähnlich wie bei Post-Bisulfit Behandlung umgewandelt. - Für optimale und unvoreingenommene Verstärkung vermeiden CpG dinucleotid in die Primer und design der Amplifikate Größe zwischen 100-300 bp.
- Sicherstellen Sie, dass gestaltete Primer für die mitochondriale DNA, die mit BiSearchs Funktion Primer Suchespezifisch sind. Legen Sie die bereits gestalteten Bisulfit konvertiert Primer, aktivieren Sie das Kontrollkästchen Bisulfit und gehören ein Referenz-Genom und PCR-Parameter.
Hinweis: Es wird eine Liste der möglichen PCR-Produkte angezeigt. - Kopieren Sie oben 1-5 Grundierung Sequenzen zu und fügen Sie sie in ein Bestellformular für Oligonukleotid-Synthese.
Hinweis: Eine Liste von Mensch und Maus MtDNA-Primer-Sequenzen, die im Labor validiert wurde ist in Tabelle 1dargestellt. - Test-Primer mit Bisulfit konvertiert PCR nach Agarose-Gelelektrophorese, wie in Schritt 4 beschrieben. Testen Sie und optimieren Sie alle Primer Paare getrennt und sicherzustellen Sie, dass die richtige Amplikons Größe auf dem Agarosegel angezeigt wird.
Hinweis: Wenn multiplexing Primer benötigt werden, fügen Sie hinzu, mehrere Primer zu einem einzelnen PCR-Reaktion und visualisieren die PCR-Produkte auf Agarose-Gelelektrophorese oder eine mehr auflösenden Methode wie Polyacrylamid Gelelektrophorese, um ähnliche Produkte zu unterscheiden Größe.
4. Bisulfit umgewandelt, PCR und Gel Extraction
- Um die Regionen von Interesse zu verstärken, führen Sie durch PCR mit einem Heißstart Taq Polymerase. Kurz, Mix 100 ng umgewandelt DNA, 500 µM und Anti-Sinn Primer 1 µL dNTP-Mix (10 µM jedes dNTP) und Polymerase über 7,5 U/Reaktion in einem Gesamtvolumen von 50 µL. laufen PCR mit den folgenden Bedingungen: 5 min bei 95 ° C (60 s 94 ° C; 60 s 55 ° C *; 60 s 72 ° C)
35 Zyklen; 10 min 72 ° C. Primer verwenden, entweder separat oder Multiplex. - Optional: Wenn Primer multiplexing, Einsatz 200 ng konvertiert, DNA und die folgenden Bedingungen, Radfahren: 5 min 95 ° C (60 s 94 ° C; 90 s 55 ° C *; 90 s 72 ° C) 35 Zyklen; 10 min 72 ° C.
Hinweis: Die Temperatur variieren je nach der Schmelztemperatur der Primer. - Thema PCR-Produkte, gel-Elektrophorese auf 2 % Agarose bei 100 Volt.
- Unter sanften UV-Licht PCR-Produkte mit einem Skalpell zu extrahieren und mikroröhrchen hinzufügen. Setzen Sie nicht PCR-Produkte, übermäßige UV-Licht, DNA-Schäden zu vermeiden. Vermeiden Sie Belichtungszeit über 30 s.
- Reinigen Sie die PCR-Produkte mit Gel Reinigung wie oben beschrieben3.
- Quantifizieren Sie die gereinigte DNA aus Schritt 4.5 mit Fluorometry. Fahren Sie mit Schritt 5 oder Shop-Proben bei-20 ° C.
35 Zyklen; 10 min 72 ° C. Primer verwenden, entweder separat oder Multiplex.5. Bisulfit Sequenzierung Bibliothek Vorbereitung
- Durchführen Sie Bibliothek-Vorbereitung von Bisulfit-konvertiert PCR-Produkte.
Optional: multiplex-PCR-Produkte in diesem Stadium. - Führen Sie Ende-Reparatur mit bis zu 100 ng PCR-Produktes. 55.5 µL PCR-Produkt in einer 0,2 mL Tube 3 µL Ende Prep Enzym und 6,5 µL Ende Reparatur Reaktion Puffer (10 X) hinzufügen. Platzieren und Rohr in einem Thermocycler für 30 min bei 20 ° C, gefolgt von 30 min bei 65 ° c inkubieren
- Sequenzierung Adapter verbinden, durch das Mischen der Ende repariert DNS mit 15 µL Blunt/TA-Ligase Mix, 2,5 µL Adapter und 1 µL Ligation Enhancer. Wenn mit < 100 ng PCR-Produkt als Eingabe, verdünnen Adapter 10-mal.
- Legen Sie die Mischung (Schritt 5.3) in einem Thermocycler und inkubieren Sie 15 min bei 20 ° C. Anhalten der Thermocycler und 3 µl Benutzer hinzufügen Enzym am Rohr. Mischen Sie und legen Sie das Rohr zurück in den Thermocycler und inkubieren 15 min bei 37 ° c
- Größe wählen Sie die Adapter ligiert DNA mittels Solid Phase Reversible Immobilisierung (SPRI) Perlen mit unterschiedlichen Verhältnissen von Perlen an DNA PCR Produkt abhängig.
- 13.5 µL H2O Adapter ligiert DNA aus Schritt 5.4 und 55 µL Nukleinsäuretablette SPRI Perlen hinzufügen. Inkubation bei Raumtemperatur für 5 min und Platz auf einem Magnetstativ. Wenn die Lösung klar ist, übertragen Sie den überstand zu, zu einem neuen Schlauch und verwerfen Sie Röhrchen mit den Perlen zu.
Hinweis: Der Überstand enthält die Adapter ligiert DNA und große unerwünschte Fragmente sind verpflichtet, die ausrangierten Perlen. - Der Überstand von Schritt 5.6 25 µL Nukleinsäuretablette SPRI Perlen hinzufügen, mischen und 5 min bei Raumtemperatur inkubieren. Legen Sie das Rohr auf die Magnetstativ und verwerfen Sie den überstand zu, wenn die Lösung klar ist.
Hinweis: Der ausrangierte überstand enthält unerwünschte DNA, während die Adapter ligiert DNA an Perlen gebunden ist. - Während das Rohr auf die Magnetstativ ist, fügen Sie 200 µL 80 % Ethanol (frisch zubereitet) um die Perlen zu waschen. Inkubieren Sie 30 s und entfernen und entsorgen der Überstand. Wiederholen Sie diesen Schritt für eine Gesamtmenge von 2 Wäschen.
- Luft trockenere Perlen für 5 min, während das Rohr auf Magnetstativ mit offenen Deckel.
- Entfernen Sie den Schlauch aus der Magnet, eluieren Sie DNA in 23 µL Elution Buffer und mischen. In 2 min bei Raumtemperatur inkubieren.
- Legen Sie das Rohr auf einem Magnetstativ und wenn die Lösung klar ist, übertragen Sie 2 µL auf einer 96-Well-PCR-Platte für die Pre-PCR-Amplifikation (Schritt 5.14).
- Der Rest ungefähr 21 µL auf eine neue 0,2 mL Tube für PCR-Amplifikation (Schritt 5.17) übertragen.
Hinweis: Achten Sie nicht darauf, Perlen zu übertragen, wie Perlen enzymatische Reaktionen über die nächsten Schritte hemmen können. - Fahren Sie mit Schritt 5.14 oder Shop-Proben bei-20 ° C.
- Führen Sie Pre-PCR Verstärkung durch RT-qPCR Schätzung die Anzahl der Zyklen erforderlich, um die Adapter ligiert DNA zu verstärken. Pro Reaktion, fügen Sie Folgendes in der 96-Well-PCR Platte mit 2 µL DNA (Schritt 5.11): 0.4 µL Index Grundierung, 0.4 µL universal PCR Primer, 7,2 µL H2O, 10 µL RT-qPCR-master-Mix.
- Die Platte in einer Echtzeit-PCR-Maschine und die Platte mit den folgenden Bedingungen zu unterwerfen: 30 s bei 98 ° C (10 s 98 ° C; 75 s 65 ° C) 20 Zyklen; 5 min 65 ° C.
- Schätzen Sie die Anzahl der Verstärkung Zyklen benötigt für jede Probe durch Subtraktion eines Ct-Wert der Ct-Wert von der Vorverstärkung RT-qPCR entsprechend an das Ende der linearen Phase der PCR-Reaktion.
- Verstärken Sie die Adapter ligiert DNA aus Schritt 5.12 durch Mischen: 21 µL DNA, 25 µL PCR-master-Mix, 1 µL Index Grundierung, 1 µL Universal PCR Primer und 2 µL H2O. In einem Thermocycler unterziehen jede Probe mit den nachfolgenden Bedingungen: 30 s bei 98 ° C (10 s 98 ° C; 75 s 65 ° C) [berechnete Ct aus Schritt 5.16] Zyklen; 5 min 65 ° C.
Hinweis: Denken Sie daran, nur eine Index-Grundierung pro Probe zu Multiplexen. Der Index ist während der PCR eingesetzt. - Reinigen Sie die amplifizierten DNA SPRI-Perlen und eluieren in 22 µL Elution Puffer.
- Bibliothek-Qualitätskontrolle durch Gel-Elektrophorese oder Alternative Methode. Achten Sie auf richtige Bibliothek Peak Größen (PCR-Produkt (e) Größe plus Adapter).
- Schätzen Sie die durchschnittliche Basenpaar Größe der Bibliothek-Produkte durch Abstrich Analyse: im erweiterten globalen Einstellungen, doppelklicken Sie auf "Tabelle" unter Abstrich Analyse. Definieren der Region von 100-1000 bp und klicken Sie auf "OK". Unter Region-Tabelledie definierte Region erscheint und Bibliothek Durchschnittsgröße (bp) wird berechnet.
- Bibliotheken von Fluorometry zu quantifizieren. Fahren Sie mit Schritt 6 oder Shop-Bibliotheken bei-20 ° C.
(6) next Generation Sequencing
- Berechnen Sie die nM-Konzentration der Bibliotheken mit der Formel:
- Verdünnen Sie Bibliotheken, die die gleichen nM Konzentration z.B. 2 nM (Wählen Sie 4 nM, 2 nM, 1 nM oder 0,5 nM je nach Bibliothek Konzentrationen). Bündeln Sie alle Bibliotheken um einen Pool von 2 nM Bibliotheken zu erreichen.
- Denaturieren und Bibliotheken nach der Sequenzierung Instrument Guide zu verdünnen. Kurz gesagt: 2 nM Pool durch Zugabe von 0,2 N NaOH denaturieren und Inkubation bei Raumtemperatur für 5 min. verdünnt denaturierte Pool zu einer Endverdünnung von 22:00. Denaturieren Sie und verdünnen Sie eine handelsübliche Steuerelementbibliothek zu einer endgültigen Verdünnung der 12:05. Mischen Sie zu einem neuen Schlauch 22:00 Pool mit 20 % 12:05-Steuerelementbibliothek.
Hinweis: Bisulfit Konvertierung führt sehr geringen Komplexität. Bessere Qualität der Sequenzierung führen Bibliothek Spike-in 20 % Kontrolle. - Führen Sie ein 150 bp gepaart-End Sequenzierung mit einem tiefen Sequenzierung Instrument.
(7) computergestützte Analyse - Schätzung Methylierung Ebenen
- .Fastq Dateien (hier als sample1_R1.fastq.gz und sample1_R2.fastq.gz) zu erzeugen, erzeugen einen Bismark-Index des gesamten Genoms von Interesse (hier in einem Ordner namens BismarkIndex) und stellen Sie sicher, dass die genomische Sequenz ChrM in Fasta verfügbar ist Format (hier in einem Ordner namens ChrM).
- Vorverarbeitung von liest entfernen Sie Adapter und Bias eingeführt durch die Primer: Verwenden Sie das Tool Trim_galore33. Entfernen Sie zwei Nukleotide aus 5'-Ende der vorwärts und rückwärts liest.
Trim_galore - clip_R1 2 - clip_R2 2 -o. /--trim1--gepaart sample1_R1.fastq.gz sample1_R2.fastq.gz - Richten Sie vorbearbeitet liest, das gesamte Genom mit Bismark34
Bismark - Schwalbenschwanz - Bam -o. /. / BismarkIndex /-1-2./sample1_R1_val_1.fq.gz./sample1_R2_val_2.fq.gz
Hinweis: Wenn eine andere Aligner verwendet wird, stellen Sie sicher, dass Lesevorgänge, die eindeutig ausgerichtet werden können nicht verworfen werden. - Extrakt liest Mapping auf dem Chromosom M, hier mit Samtools35
Samtools sortieren -l 0 - O BAM -o sample1_sorted.bam
sample1_R1_val_1_bismark_bt2_pe.BAM
Samtools Index sample1_sorted.bam
Samtools anzeigen -u sample1_sorted.bam ChrM | Samtools sortieren - n - O BAM -o sample1_chrM.bam - Die Methylierung Informationen extrahieren
Bismark_methylation_extractor -p--CX--Cytosine_report--umfassende--Genome_folder. / ChrM./sample1_chrM.bam - Verwenden Sie die .bedGraph, die .cov oder die CX_report.txt-Dateien für die weitere Analyse. Verwenden Sie die sample1_chrM.CX_report.txt-Datei für die Visualisierung und testen.
- Führen Sie weiter Ausschnitt in der Vorverarbeitung Schritt aus, wenn mehrere Regionen verhört und eine Grundierung Vorspannung möglicherweise sichtbar in den M-Bias Parzellen erzeugt beim Mapping. Finden Sie in der Bismark-Dokumentation für weitere Informationen.
(8) computergestützte Analyse - Test Unterschiede
- Stellen Sie sicher, dass die CX_report.txt-Datei für jedes C auf Chromosom M 7 Spalten, Chromosom (hier ChrM), Position, Ausrichtung, Anzahl der methylierten liest, unmethylated liest, C Kontext und umliegenden Sequenz enthält.
- Da die CX_report ChrM in seiner Gesamtheit erfasst, überprüfen Sie die Teilmenge, die Region(en), verstärkt wird.
- Verwenden Sie nicht-parametrischen Tests für Unterschiede zwischen den Proben, wie ein Fishers exakter Test für einzelne C oder ein Zeichen-Test für eine ganze Region.
Hinweis: Quantifizierung werden oft in der Nähe von 0 % Methylierung, das ist der Grund, warum die Annahme von Normalität nicht angebracht ist. - In ähnlicher Weise für die Visualisierung, Quantile zu visualisieren oder binomische Anteil Konfidenzintervall berechnen.
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Representative Results
Zwei Schritte in diesem Protokoll sind von entscheidender Bedeutung bei der Untersuchung von MtDNA-Methylierung. (1) die Eröffnung der Sekundärstruktur und (2) die Gestaltung der mitochondrialen DNA-spezifischen Primer.
Durch Verdauung menschliche genomische DNA mit dem Restriktionsenzym BamHI (Abbildung 1), die mitochondriale DNA-Struktur wird an Nukleotid Position 14.258 geschnitten werden und die Sekundärstruktur wird geöffnet.
Die mögliche Beeinträchtigung der Bisulfit-Konvertierung mit einem intakten MtDNA Sekundärstruktur ist sehr wahrscheinlich, dass die MtDNA Unconversion Rate zu überschätzen. Von Bisulfit Sequenzierung die MtDNA Unconversion Rate wurde untersucht, in unverdaut und verdaut Gesamt-DNA aus menschlichen skelettartigen Muskelzellen bei 5 verschiedenen Regionen des mitochondrialen Genoms: Verschiebung Schleife (D-Loop), tRNA Phenylalanin und 12 s Ribosom (tRNA - F + 12 s) 16 s Ribosom (16), NADH Dehydrogenase 5 (SD5) und Cytochrom b (CYTB) mRNA Kodierung gen (Abbildung 2). Unconversion Satz reichten von 0 - 15,1 % in allen untersuchten Regionen für unverdaute MtDNA. Jedoch wenn die DNA vor Bisulfit Umwandlung verdaut war, fiel die Unconversion Rate auf maximal 1 % in allen Regionen (Abbildung 3). So illustriert die Bedeutung der BamHI Verdauung vor Bisulfit Umwandlung Überschätzung der MtDNA Methylierung Ebenen zu vermeiden.
Kontamination von Kern-DNA ist unvermeidlich, wenn der mitochondrialen Genoms zu isolieren und da fast das gesamte mitochondriale Genom in das Kerngenom repliziert wurde, es hat zu nuklearen Einfügungen des mitochondrialen Genoms bezeichnet nukleare Mitochondriale Segmente (NUMTs)36. Um sicherzustellen, dass die untersuchten DNA-Methylierung Ebenen die mitochondriale DNA und nicht NUMTs entsprechen, ist es von äußerster Wichtigkeit, Primer zu entwerfen, die speziell für das mitochondriale Genom. Abbildung 4 zeigt, wie die Grundierung Spezifität und Tabelle 1 zeigt menschliche und Maus MtDNA Grundierung Sequenzen zu überprüfen.
| Name | Sequenz | Position | Größe der Amplifikate | Anlasstemperatur | Strang | ||
| Menschlichen | |||||||
| D-Loop | F: AAATCTATCACCCTATTAAC | ||||||
| R: GTGGAAATTTTTTGTTATGATGT | 6-298 | 292 | 55° C | Antisense | |||
| D-Loop | F: CATAACAAAAAATTTCCACCAAAC | ||||||
| R: GGGAAAATAATGTGTTAGTT | 279-458 | 179 | 55° C | Antisense | |||
| 12 S + TF | F: TTTATATAACTTACCTCCTC | ||||||
| R: GTGTTTGATGTTTGTTTTTTTTG | 577-765 | 188 | 55° C | Antisense | |||
| 664 | F: AATAAATTTATAGGTTTTTAAATTATTAAAT | ||||||
| R: TAACTAATAAAATCTTAACATATACTACTC | 2763-2873 | 110 | 53° C | Sinn | |||
| CYTB | F: GGTATTATTTTTTTGTTTGTAATTATAGTA | ||||||
| R: CCTCAAATTCATTAAACTAAATCTATCC | 15091-15243 | 152 | 55° C | Sinn | |||
| Maus | |||||||
| 12 S | F: ACACATACAAACCTCCATAAAC | ||||||
| R: GAGGTATAATTTAGTTAAAT | 111-287 | 176 | 53° C | Antisense | |||
| 664 | F: AAATTCCAATTCTCCAAACATAC | ||||||
| R: TTTGGATTTTTTTTTTAGGT | 1749-1896 | 147 | 53° C | Antisense | |||
| CYTB | F: CTACAAAAACACCTAATAACAAAC | ||||||
| R: AGTGTATGGTTAAGAAAAGA | 14129-14307 | 178 | 55° C | Antisense | |||
| 664 | F: AGAGAAATAGAGTTATTTTATAAATAAG | ||||||
| R: CTAAAAACAAAATTTTAAATCTTAC | 2576-2727 | 151 | 55° C | Sinn | |||
| SD5 | F: TTAAGTTAATTAGGTTTGATAATAGTGA | ||||||
| R: TAAAACCCTATTAAAAATAATATTCCTATA | 12659-12910 | 251 | 55° C | Sinn | |||
| CYTB | F: TGGGTTTTTTTTAGGAGTTTGTTTA | ||||||
| R: CAATAAAAATACTCCAATATTTCAAATTTC | 14242-14504 | 262 | 55° C | Sinn | |||
Tabelle 1: Primer-Sequenzen für Mensch und Maus MtDNA. Beachten Sie, dass glühen Temperaturen von PCR Primer aufgrund von Unterschieden in der Schmelztemperatur Primer variieren.
Abbildung 1 : Gel-Elektrophorese der BamHI-verdaut oder unverdaute DNA. Genomischer DNA aus menschlichen skelettartigen Muskel war unbehandelt oder behandelt mit BamHI für 4h bei 37° C und Gelelektrophorese wurde auf einem 1,5 % Agarosegel. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Karte des menschlichen mitochondrialen Genoms. Regionen des mitochondrialen Genoms von Bisulfit-Sequenzierung und Ortsbild BamHI Restriktionsenzym untersucht werden angezeigt. Die mitochondriale DNA enthält 13 mRNAs, 2 ribosomalen RNAs und 22 Transfer-RNAs. Abkürzungen: PH1: Heavy-Strang Förderer 1; PH2: Heavy-Strang fördern 2; PL: Licht-Strang Veranstalter; OH: Herkunft der Replikation von Heavy-Strang; OL: Ursprung der Replikation von Licht-Strand. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : BamHI Verdauung vor Bisulfit Umwandlung reduziert die MtDNA Unconversion in menschlichen Skelettmuskelzellen. Von Bisulfit-Sequenzierung, unverdauten und verdaute mitochondriale DNA Unconversion Prozentsatz an fünf verschiedenen Regionen des mitochondrialen Genoms in menschlichen skelettartigen Muskelzellen verhört wurden (N= 3). Das vollständige Quadrat steht für CpG Websites und offenen Quadrat steht für nicht-CpG Websites. Ergebnisse werden mit einem Intervall von min-Max und ein Zeichen-Test wurde verwendet, um signifikante Unconversion Unterschiede zu testen. D-Loop (6-298) P= 1.83E-42; D-Loop (279-458): P= 4.55E-13; tRNA - F + 12 s: P= 8.38E-16; 16 s: P= 5.91E-06; SD5: P= 1.70E-05; CYTB: P= 2.69E-10. D-Loop (6-298) schliesst den Ursprung der Replikation und tRNA - F + 12 s beinhaltet schwere Strang Förderer 2. Diese Daten wurden an anderer Stelle 3veröffentlicht. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 : Die Verwendung von Bisearch, Grundierung Spezifität in Richtung des mitochondrialen Genoms zu überprüfen. (A) Bisulfit-konvertiert Primer-Sequenzen werden hinzugefügt, um die BiSearch-Funktion Primer Suche (http://bisearch.enzim.hu/?m=genompsearch). Das Bisulfit-Kästchen angekreuzt ist, und eine Referenz-Genom wird ausgewählt. B) Beispiel der potenziellen PCR-Produkte auf Sense und Antisense-Ketten erzeugt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Hier bieten wir ein Bisulfit-Sequenzierung-Protokoll, das speziell für die MtDNA-Methylierung zu befragen. Die Unterschiede mit Bisulfit-Sequenzierung Protokolle für genomische DNA liegt bei der Verwertung von eine vorherige Beschränkung Enzym Verdauung Schritt und eine bioinformatische Analyse Urteil, falsche positive aus NUMT Sequenzen.
Wir bieten ein Protokoll zur Bisulfit-Sequenzierung Artefakte zu vermeiden, bei der Untersuchung von MtDNA-Methylierung. Bisulfit Sequenzierung Artefakte zu Fehlalarme waren zuvor gemeldeten37. Unzureichende Beseitigung der DNA Zubehör Proteine durch Proteinase K wurde beschrieben37. Unvollständigen Denaturierung oder partielle reannealing erstreckt sich von unvollständigen Umwandlung führen möglicherweise zu durch Senkung der Zugang von Bisulfit einzelsträngiger DNA37. Die späteren Artefakt könnte spielen bei MtDNA wo eine Sekundärstruktur Zugang zu Cytosines beeinträchtigen würde. Nach bestem Wissen und gewissen wurde zunächst die Zugabe von ein Restriktionsenzym Verdauung Schritt vor der Bisulfit Umwandlung im Rahmen der Schätzung MtDNA-Methylierung in 20163,28berichtet. In unseren Händen senkte auch vorherige Verdauung mit einem Single-Cutter Beschränkung Enzym dramatisch Erkennung von unkonvertierte Cytosines3,28.
Hier bieten wir eine bioinformatische Pipeline Bisulfit Sequenzierung Ergebnisse zu analysieren und im Rahmen des gesamten mitochondrialen Genoms Bisulfit Bisulfit Sequenzierung Artefakte zu erkennen. Diese Methode stammt aus der Beobachtung, dass MtDNA-Umrechnungskurs war umgekehrt korreliert mit der Sequenzierung Tiefe3,28. Diese Beobachtung legt nahe, dass die sekundäre und sogar tertiäre Struktur der MtDNA die Fragmentierung der MtDNA in bestimmten Regionen während des Baus der Sequenzierung Bibliotheken beeinträchtigt und auch vollen Zugriff von Natrium Bisulfit an MtDNA beeinträchtigen könnte. Da die Verdauung mit einem ein-Cutter-Enzym sekundäre und tertiäre Strukturen freigibt, zeigen unsere Ergebnisse, dass MtDNA-Struktur ist eine Quelle von Bisulfit Artefakt und Validierung der Methoden für die Quantifizierung von Cytosin Methylierung in MtDNA beschriebenen.
Die unvermeidliche Kontamination von Kern-DNA in der mitochondrialen Vorbereitung stellt eine Herausforderung dar. Dies führt zu Verunreinigungen in NUMT Sequenzen in liest, Sequenzierung, die Schätzung der Cytosin Methylierung in MtDNA, bias kann, selbst wenn durchführen gezielt und nicht ganze mitochondrialen Genoms Bisulfit. Um solche Verzerrungen zu vermeiden, erlaubt das Design der einzigartigen Bisulfit Sequenzierung Primer, Verunreinigung durch Methylierung an NUMTs auszuschließen. NUMTs erstrecken sich über bestimmte Regionen des menschlichen und Maus mitochondrialen Genoms mit 100 % Identität, und es ist daher unmöglich, einzigartige Primer auf bestimmte Regionen der MtDNA zu entwerfen. Beim ganzen mitochondriale Bisulfit Genomsequenzierung, lange Sequenzierung durchführen können liest Diskriminierung zwischen MtDNA und NUMTs erleichtern. Ausrichten Lesezugriffe auf das ganze Genom und verwenden Sie nur liest, die eindeutig auf das mitochondriale Genom abgebildet weiter können sicher Erkennung der MtDNA-Methylierung.
Schließlich kann dieses Protokoll werden über mitochondrische Genome, z. B. in anderen Instanzen von Bisulfit-Sequenzierung verwendet wo die sekundäre Struktur der DNA eine potentielle Quelle von Artefakt darstellt. Der Zusammenhang zwischen Methylierung Spiegel und Sequenzierung Tiefe untersucht werden kann, um die Notwendigkeit für eine Vergärung mit einem Restriktionsenzym vor Bisulfit Sequenzierung von komplexen DNA-Sequenzen zu beurteilen.
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Disclosures
Die Autoren haben keinen finanziellen Interessenkonflikt zu erklären.
Acknowledgments
Die Novo Nordisk Stiftungszentrum für metabolische Grundlagenforschung ist ein unabhängiges Forschungsinstitut an der Universität Kopenhagen, teilweise durch eine freie Spende von Novo Nordisk Stiftung finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BamHI | New England BioLabs | # R0136 | |
| EZ DNA methylation-lightning kit | Zymo Research | # D5030 | |
| Qubit ssDNA assay | Thermo Fisher Scientific | # Q10212 | |
| Qubit assay tubes | Thermo Fisher Scientific | # Q32856 | |
| HotStarTaq plus DNA polymerase kit | Qiagen | # 203603 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | # 28704 | |
| NEBNext Ultra DNA Library Kit for Illumina | New England BioLabs | # E7370S | |
| NEBNext Multiplex Oligoes for Illumina | New England BioLabs | # E7335S | |
| AMPure XP Beads | Beckman Coulter | # A63881 | |
| High Sensitivity DNA chip | Agilent | # 5067-4626 | |
| Qubit high sensitivity dsDNA assay | Thermo Fisher Scientific | # Q33230 | |
| MiSeq reagent kit v2 300 cycles | Illumina | # MS-102-2003 | |
| PhiX control v3 | Illumina | # FC-110-3001 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | # S5881 | |
| Thermal cycler C1000 | Biorad | # 1851148 | |
| CFX96 Real-Time PCR detection system | Biorad | #1855195 | |
| Qubit Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | # Q33226 | |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent | # G2939BA | |
| MiSeq instrument | Illumina | # SY-410-1003 |
References
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