Definizione attività di Chaperone Redox-regolati di Hsp33 e mappatura cambiamenti conformazionali su Hsp33 usando la spettrometria totale di scambio di idrogeno-deuterio
Summary
Uno della più difficili condizioni di stress che gli organismi si incontrano durante la loro vita comporta un accumulo di ossidanti. Durante lo sforzo ossidativo, le cellule si basano pesantemente su chaperoni molecolari. Qui, presentiamo i metodi utilizzati per indagare la redox-regolati anti-aggregazione attività, nonché monitorare i cambiamenti strutturali che disciplinano la funzione di chaperone utilizzando HDX-MS.
Abstract
Gli organismi viventi devono regolarmente affrontare ambienti fluttuanti durante il loro ciclo di vita, compresi i cambiamenti nella temperatura, pH, l’accumulo di specie reattive dell’ossigeno e più. Queste fluttuazioni possono portare a una proteina diffusa dispiegarsi, aggregazione e morte cellulare. Pertanto, le cellule hanno evoluto una rete dinamica e stress specifici di chaperoni molecolari, che mantengono un “sano” proteoma durante condizioni di stress. ATP-indipendente chaperoni costituiscono una classe importante di chaperoni molecolari, che servono come molecole di prima linea di difesa, proteggendo l’aggregazione proteica in modo lo stress-dipendente. Una caratteristica di che questi con i supervisori hanno in comune è la loro capacità di utilizzare la plasticità strutturale per la loro attivazione specifica lo stress, il riconoscimento e il rilascio del client misfolded.
In questa carta, ci concentriamo sull’analisi strutturale e funzionale di una tale chaperone intrinsecamente disordinati, la Hsp33 batterica di redox-regolati, che protegge le proteine contro aggregazione durante lo sforzo ossidativo. Qui, presentiamo una serie di strumenti di diverse tecniche per lo studio della attività di chaperone redox-regolati, così come per il mapping dei cambiamenti conformazionali di chaperone, alla sua attività di base. In particolare, descriviamo un flusso di lavoro che prevede la preparazione di proteine completamente ridotte e completamente ossidate, seguita da un’analisi del chaperone attività anti-aggregazione in vitro utilizzando luce-dispersione, concentrandosi sul grado della attività anti-aggregazione e sua cinetica. Per ovviare a frequenti outlier accumulati durante le analisi di aggregazione, descriviamo l’uso di Kfits, un nuovo strumento grafico che permette la facile lavorazione di misure cinetiche. Questo strumento può essere facilmente applicato ad altri tipi di misure cinetiche per valori anomali di smontaggio e montaggio dei parametri cinetici. Per correlare la funzione con la struttura della proteina, descriviamo l’installazione e il flusso di lavoro di una tecnica di spettrometria di massa strutturale, spettrometria di massa dell’idrogeno-deuterio exchange, che consente la mappatura dei cambiamenti conformazionali sul chaperone e substrato durante diverse fasi di attività Hsp33. La stessa metodologia può essere applicata per altre interazioni proteina-proteina e proteina-ligando.
Introduction
Le cellule incontrano spesso un accumulo di specie reattive dell’ossigeno (ROS) prodotte come sottoprodotti di respirazione1,2, proteica e lipidica ossidazione3,4e processi aggiuntivi5, 6,7. Nonostante il ruolo benefico di ROS’ in diversi processi biologici quali8,9 e risposta immunitaria10di segnalazione cellulare, uno squilibrio fra produzione di ROS e la sua disintossicazione potrebbe verificarsi, portando a ossidativo 7di sforzo. I bersagli biologici di ROS sono proteine, lipidi e degli acidi nucleici, l’ossidazione di cui influenzare la loro struttura e funzione. Pertanto, l’accumulo degli ossidanti cellulari è fortemente legata a una vasta gamma di patologie tra cui cancro9,11, infiammazione12,13e invecchiamento14, 15e sono stati trovati per essere coinvolti nell’insorgenza e progressione dei disordini neurodegenerative quali Alzheimer, Parkinson e ALS malattia16,17,18.
Proteine sia recentemente sintetizzate e mature sono altamente sensibili all’ossidazione a causa delle alterazioni potenzialmente nocive delle loro catene laterali, che forma la proteina struttura e funzione19,20. Pertanto, lo sforzo ossidativo conduce solitamente ad un’inattivazione della proteina diffusa, misfolding e aggregazione, finalmente conducendo alla morte delle cellule. Una delle strategie cellulare elegante per affrontare il danno potenziale di ossidazione della proteina è quello di utilizzare chaperoni redox-dipendente, che inibiscono l’aggregazione proteica diffusa, invece di formare complessi stabili con le proteine misfolded client21 ,22,23. Questi accompagnatori di prima linea di difesa sono rapidamente attivati da un’ossidazione site-specific (solitamente sui residui di cisteina) che li converte in potenti molecole anti-aggregazione24. Poiché lo sforzo ossidativo provoca l’inibizione della respirazione e una diminuzione nell’ATP cellulare livelli25, canonico ATP-dipendente chaperoni sono meno efficaci durante lo sforzo ossidativo condizioni25,26 ,27. Di conseguenza, redox-attiva chaperoni ATP-indipendente giocano un ruolo fondamentale nel mantenimento dell’omeostasi della proteina sull’accumulo degli ossidanti nei batteri e negli eucarioti (ad es., Hsp3328 e RidA29 nei batteri, Get330 in lievito, le perossiredossine31 negli eucarioti). L’attività di questi accompagnatori dipende fortemente reversibili strutturali cambiamenti conformazionali indotti da un’ossidazione site-specific che scopre idrofobiche regioni coinvolte nel riconoscimento delle proteine misfolded client.
Ricerca del meccanismo anti-aggregazione e i principi che disciplinano il riconoscimento delle proteine client di chaperoni non è facile a causa della natura dinamica ed eterogeneo di chaperone-substrato interazioni32,33, 34,35,36,37. Tuttavia, lo stress-regolata con i supervisori hanno l’opportunità di avanzare la nostra comprensione della funzione anti-aggregazione dovuto la loro capacità di: 1) ottenere due forme differenti di chaperone, attivo (ad es., ossidato) e inattivo (ad es., ridotto), con l’introduzione o la rimozione di una condizione di stress passare facilmente tra loro (ad es., ossidante e riducente), 2) hanno una vasta gamma di substrati, 3) formano complessi molto stabili con le proteine di client che possono essere valutate mediante diverse metodologie strutturali e 4) concentrarsi esclusivamente sul substrato riconoscimento e rilascio, mediato dai cambiamenti conformazionali redox-dipendente, come la maggior parte di questi accompagnatori manca la capacità pieghevole.
Qui, analizziamo le attività anti-aggregazione del chaperone redox-regolati batterica di Hsp33, una componente essenziale del sistema di difesa batterica contro proteina indotta da ossidazione aggregazione28. Quando ridotto, Hsp33 è una proteina di zinco-leganti strettamente piegata con nessuna attività di chaperone; Tuttavia, quando esposte a stress ossidativo, Hsp33 subisce vasti cambiamenti conformazionali che espongono il relativo substrato associazione regioni38,39. Sopra l’ossidazione, lo ione di zinco che è fortemente associato a quattro residui di cisteina altamente conservata del dominio C-terminale è rilasciato40. Questo provoca la formazione di due ponti disolfuro, uno spiegamento del dominio C-terminale e una destabilizzazione della regione adiacente del linker41. Regioni del C-terminale e del linker sono altamente flessibili e sono definite come intrinsecamente o parzialmente disordinati. Al ritorno in condizioni di non-stress, le cisteine diventano ridotto e il chaperone ritorna al suo stato nativo piegato senza attività anti-aggregazione. Il ripiegamento del chaperone conduce ad un ulteriore svolgimento e destabilizzazione della proteina client associato, che innesca il suo trasferimento al sistema chaperone canonico, DnaK/J, per refolding38. Analisi dei siti di interazione di Hsp33 suggeriscono che Hsp33 usi entrambi che suoi carica disordinata le regioni, come pure le regioni idrofobiche sul linker e il dominio N-terminale di catturare “misfolded” proteine di client e impediscono loro di aggregazione38, 42. in stato piegato, queste regioni sono nascoste per il linker piegato e il dominio C-terminale. È interessante notare che, la regione di linker funge da un gatekeeper di stato piegato e inattivo di Hsp33, lo stato pieghevole della sua adiacente di dominio C-terminale34“sensing”. Una volta che ha destabilizzato mediante mutagenesi (sia da una mutazione di punto o di una perturbazione di sequenza completa), Hsp33 viene convertito in un chaperone costitutivamente attivo indipendentemente lo stato redox della sua redox-sensibili cisteine43.
I protocolli qui presentati consentono di monitoraggio di attività di chaperone di redox-dipendente di Hsp33, nonché dei cambiamenti conformazionali di mappatura all’attivazione del e associazione di proteine di client. Questa metodologia può essere adattata per ricercare altri modelli di riconoscimento di chaperone-client così come le interazioni non-chaperone proteina-proteina. Inoltre, vi presentiamo i protocolli per la preparazione di chaperoni completamente ossidati e ridotti che può essere utilizzato negli studi di altre proteine redox-interruttore, per rivelare potenziali ruoli dell’ossidazione della proteina su attività della proteina.
In particolare, descriviamo una procedura per monitorare chaperone attività in vitro e definire la sua specificità di substrato sotto diversi tipi di aggregazione proteica (indotta chimicamente o termicamente), utilizzando la diffrazione della luce (LS) misurato da un fluorospectrometer44. Durante l’aggregazione, light scattering a 360 nm aumenta rapidamente a causa della torbidità crescente. Così, l’aggregazione può essere monitorata in modo dipendente dal tempo a questa lunghezza d’onda. LS è un metodo veloce e sensibile per i test di aggregazione proteica e quindi l’attività anti-aggregazione di una proteina di interesse utilizzando concentrazioni nanomolari, consentendo la caratterizzazione delle proteine correlate a aggregazione parametri cinetici sotto diversi condizioni. Inoltre, il protocollo di LS qui descritto non richiede strumentazione costosa e può stabilire facilmente in qualsiasi laboratorio.
Tuttavia, è abbastanza impegnativo per ottenere curve cinetiche “pulito” e derivare i parametri cinetici di una proteina da tali esperimenti, a causa di rumore e il gran numero di valori anomali generati da bolle d’aria e grandi aggregati di diffusione della luce. Per superare questo ostacolo, vi presentiamo un nuovo strumento grafico, Kfits45, utilizzato per ridurre i livelli di rumore in diverse misure cinetiche, specificamente attrezzati per dati cinetici di aggregazione di proteine. Questo software fornisce parametri cinetici preliminari per una prima valutazione dei risultati e consente all’utente di “pulire” grandi quantità di dati rapidamente senza influire sulle proprietà cinetiche. Kfits è implementato in Python ed è disponibile in open source 45.
Una delle domande difficili nel campo riguarda mappatura siti di interazione tra accompagnatori e le loro proteine di client e la comprensione come chaperoni riconoscono una vasta gamma di substrati misfolded. Questa domanda è ulteriormente complicato quando lo studio di complessi di proteine altamente dinamico che comportano intrinsecamente disordinati chaperoni e substrati aggregazione-incline. Fortunatamente, spettrometria di massa strutturale ha avanzato notevolmente nell’ultimo decennio e con successo ha fornito utili approcci e strumenti per analizzare la plasticità strutturale e mappa residui coinvolti nella proteina riconoscimento46, 47 , 48 , 49. qui, presentiamo un tale cambio di tecnica-idrogeno-deuterio spettrometria di massa (HDX-MS)-che consente la mappatura delle modifiche a livello di residui in una conformazione strutturale su modifica della proteina o proteina/ligando associazione35, 50,51,52,53,54,55. HDX-MS utilizza lo scambio continuo di atomi di idrogeno spina dorsale di deuterio, la cui aliquota è influenzata dall’ambiente chimico, accessibilità, e covalenti e non covalenti56. HDX-MS tiene traccia di questi processi di exchange utilizzando un solvente deuterato, comunemente acqua pesante (D2O) e consente di misurazione basato sul cambiamento di peso molecolare seguendo l’idrogeno per cambio di deuterio. Velocità di scambio di idrogeno-deuterio può derivare da atomi di idrogeno che partecipano a legami idrogeno o, semplicemente, da sterico, che indica le modifiche locali nella struttura57. Modifiche su un ligando o modificazioni post-traduzionali possono anche portare a differenze nell’ambiente di idrogeno, con un’associazione con conseguente differenze per quanto riguarda il cambio (HDX) di idrogeno-deuterio tariffe46,53.
Abbiamo applicato questa tecnologia nelle regioni 1) Mappa Hsp33 che rapidamente si svolgono sopra l’ossidazione, che portano all’attivazione di Hsp33, 2) definire l’interfaccia di associazione potenziale di Hsp33 con il suo substrato misfolded full-length, citrato sintasi (CS)38.
I metodi descritti in questo manoscritto possono essere applicati per studiare funzioni redox-dipendente di proteine in vitro, definire attività anti-aggregazione e il ruolo dei cambiamenti strutturali (se qualsiasi) in funzione della proteina. Queste metodologie possono essere facilmente adattate a diversi sistemi biologici e applicate in laboratorio.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questa carta, abbiamo fornito protocolli per l’analisi dell’attività di chaperone di redox-dipendente e la caratterizzazione dei cambiamenti strutturali al momento l’associazione di una proteina di client. Si tratta di metodologie complementari per definire potenziali complessi di chaperone-substrato e analizzare i potenziali siti di interazione.
Qui, abbiamo applicato questi protocolli per la caratterizzazione di un complesso tra il chaperone redox-regolati Hsp33 con un substrato ben stud…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori sono grati a Meytal Radzinski per sue discussioni utili e lettura dell’articolo e di Patrick Griffin e membri del suo laboratorio per la loro assistenza illimitata durante la creazione della piattaforma di analisi HDX critica. Gli autori sono grati per la Fondazione di tedesco-Israele (I-2332-1149.9/2012), il Binational Science Foundation (2015056), la concessione di integrazione di Marie-Curie (618806), la Fondazione di scienza di Israele (1765/13 e 2629/16) e la scienza di frontiera umana Programma (CDA00064/2014) per il loro sostegno finanziario.
Materials
| Chemicals, Reagents | |||
| Acetonitrile HPLC plus | Sigma Aldrich | 34998-2.5L | solvent |
| Formic acid Optima LC/MS | Fisher Chemicals | A117-50 | solvent supplement |
| Isopropyl alcohol, HPLC grade | Fisher Chemicals | P750717 | solvent |
| Methanol | Fisher Chemicals | A456-212 | solvent |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma Aldrich | 252859 | buffer |
| Trifluoroacetic acid | Sigma Aldrich | 76-05-1 | solvent |
| Water for HPLC | Sigma Aldrich | 270733-2.5L-M | solvent |
| ZnCl2, Zinc Chloride | Merck | B0755416 308 | reagent |
| DTT | goldbio | 27565-41-9 | reducing agent |
| PD mini trap G-25 columns GE healthcare | GE healthcare | 29-9180-07 | desalting column |
| Potassium Phosphate | United states Biochemical Corporation | 20274 | buffer |
| Hydrogen peroxide 30% | Merck | K46809910526 | oxidizing agent |
| citrate synthase | sigma aldrich | C3260 | substrate |
| HEPES acid free | sigma aldrich | 7365-45-9 | buffer |
| Gndcl | sigma aldrich | G3272-500G | denaturant |
| Deuterium Chloride Solution | sigma aldrich | 543047-10G | buffer |
| Deuterium Oxide 99% | sigma aldrich | 151882-100G | solvent |
| TCEP | bioworld | 42000058-2 | reducing agent |
| 150uL Micro-Insert with Mandrel Interior & Polymer Feet, 29*5mm | La-Pha-Pack -Thermo Fischer Scientific | ||
| 1.5mL Clear Short Thread Vial 9mm Thread, 11.6*32mm | La-Pha-Pack -Thermo Fischer Scientific | ||
| quartz cuvette | Hellma 101-QS | ||
| Instruments | |||
| Jasco FP-8500 Fluorospectrometer | Jasco | ||
| Thermomixer Comfort | Eppendorf | 13058/0 | |
| Heraeus Megafuge 16R, bench topCentrifuge | Thermo Scientific | ||
| pH meter , PB-11 sartorius | Sartorius | 13119/0 | |
| AffiPro Immobilized Pepsin column (20mm length, 2.0mm diameter). | AffiPro | ||
| Waters Pre-column (ACQUITY UPLC BEH C18 VanGuard 130 Å, 1.7um, 2.1mmx5mm) | Waters | ||
| C18 analytical column (ACQUITY UPLC Peptide BEH c18 Column, 130 Å, 1.7um, 2.1mmx50mm) | |||
| Vinyl Anaerobic chamber with Airlock door | COY | ||
| Q-exactive-orbitrap mass spectrometer | Thermo-Fischer Scientific | ||
| PAL system LHX – robotic system for handling HDX samples | PAL system | https://www.palsystem.com/index.php?id=840 | |
| Dionex Ultimate 3000, XRS pump | Thermo Scientific | ||
| Dionex AXP-MS auxiliary pump | Thermo Scientific | ||
| Software, Software Tools, Database search | |||
| Kfits: Fit aggregation Data | http://kfits.reichmannlab.com/fitter/ | ||
| Thermo Scientific Xcalibur software | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/OPTON-30487 | ||
| Q Exactive MS Series Tune Interface (Tune) | https://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/WS-MS-Q-Exactive-Calibration-Maintenance-iQuan2016-EN.pdf | ||
| Chronos software (Axel Semrau) | http://www.axel-semrau.de/en/Software/Software+Solutions/Chronos-p-966.html | ||
| Proteome Discoverer V1.4 software | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/OPTON-30795 | ||
| HDX workbench software | http://hdx.florida.scripps.edu/hdx_workbench/Home.html | ||
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