Definición acompañante Regulación Redox actividad de Hsp33 y mapeo de cambios conformacionales en la Hsp33 mediante espectrometría de masas de intercambio hidrógeno-deuterio
Summary
Una de las más difíciles condiciones de estrés que organismos durante toda su vida consiste en la acumulación de oxidantes. Durante el estrés oxidativo, las células dependen pesadamente chaperonas moleculares. Aquí, presentamos los métodos utilizados para investigar la regulación redox agregación de la actividad, así como para dar seguimiento a los cambios estructurales que rigen la función de chaperona con HDX-MS.
Abstract
Los organismos vivos necesitan regularmente hacer frente a ambientes fluctuantes durante su ciclo de vida, incluyendo cambios en la temperatura, pH, la acumulación de especies reactivas del oxígeno y más. Estas fluctuaciones pueden dar lugar a una proteína extensiva despliegue, agregación y muerte celular. Por lo tanto, las células han desarrollado una red dinámica y estrés específico de chaperonas moleculares, que mantener un “sano” proteoma durante condiciones de estrés. Acompañantes independientes de ATP constituyen una importante clase de chaperonas moleculares, que sirven como moléculas de defensa de primera línea, protegiendo contra la agregación de proteínas en una forma dependiente de la tensión. Una característica de que estos acompañantes tienen en común es su capacidad para utilizar la plasticidad estructural para su activación específica de estrés, el reconocimiento y la versión del cliente mal plegado.
En este artículo, nos centramos en el análisis funcional y estructural de un tal acompañante intrínsecamente desordenada, la Hsp33 bacteriana regulada de redox, que protege a las proteínas contra la agregación durante el estrés oxidativo. Aquí, presentamos una caja de herramientas de diversas técnicas para estudiar la actividad de regulación redox acompañante, así como para el mapeo de cambios conformacionales de la acompañante, subyacente a su actividad. Específicamente, se describe un flujo de trabajo que incluye la preparación de proteínas completamente reducidas y completamente oxidadas, seguido de un análisis de chaperone actividad contra la agregación en vitro usando dispersión de luz, centrándose en el grado de la actividad contra la agregación y su cinética. Para superar los frecuentes afloramientos acumuladas durante ensayos de agregación, describimos el uso de Kfits, una nueva herramienta gráfica que permite el fácil procesamiento de medidas cinéticas. Esta herramienta se puede aplicar fácilmente a otros tipos de medidas cinéticas para eliminación de outliers y parámetros cinéticos. Para correlacionar la función con la estructura de la proteína, se describen la configuración y el flujo de trabajo de una técnica estructural espectrometría de masas, espectrometría de masas de intercambio hidrógeno-deuterio, que permite el mapeo de cambios conformacionales en la acompañante y sustrato durante las diferentes etapas de la actividad de la Hsp33. La misma metodología se puede aplicar a otras interacciones proteína-proteína y proteína-ligando.
Introduction
Las células con frecuencia encuentran una acumulación de especies reactivas del oxígeno (ROS), producidas como subproductos de la respiración1,2, proteína, lípido oxidación3,4y procesos adicionales5, 6,7. A pesar del papel beneficioso de ROS en diversos procesos biológicos como celular8,9 y respuesta inmune10de señalización, un desequilibrio entre la producción de ROS y su desintoxicación puede ocurrir, lleva a oxidativo estrés7. Los objetivos biológicos de ROS son las proteínas, lípidos y ácidos nucleicos, la oxidación de las cuales afectan su estructura y función. Por lo tanto, la acumulación de oxidantes celulares está fuertemente vinculada a una amplia gama de patologías como cáncer9,11, inflamación12,13y envejecimiento14, 15y se han encontrado para ser implicado en la aparición y progresión de enfermedades neurodegenerativas como el Alzheimer, Parkinson y ALS enfermedad16,17,18.
Las proteínas recién sintetizadas y maduras son muy sensibles a la oxidación debido a las modificaciones potencialmente peligrosas de sus cadenas laterales, que forman la proteína estructura y función19,20. Por lo tanto, el estrés oxidativo conduce generalmente a una inactivación de la proteína generalizada, mal plegamiento y agregación, llevando eventualmente a la muerte celular. Una de las estrategias celulares elegante para hacer frente a los daños potenciales de oxidación de proteínas es utilizar acompañantes redox-dependientes, que inhiben la agregación de proteína generalizada, en vez de formar complejos estables con las proteínas mal plegadas cliente21 ,22,23. Estos acompañantes de primera línea de defensa se activan rápidamente por una oxidación específica (generalmente en residuos de cisteína) que se convierte en potente de la agregación de moléculas24. Puesto que el estrés oxidativo resulta en la inhibición de la respiración y disminuye en los de niveles de ATP celular25, canónicos acompañantes dependientes de ATP son menos eficaces durante el estrés oxidativo condiciones25,26 ,27. Por lo tanto, acompañantes independientes de ATP redox-activa juegan un papel vital en mantener homeostasis de proteínas sobre la acumulación de oxidantes en bacterias y eucariotas (por ejemplo, Hsp3328 y RidA29 en bacterias, Get330 en la levadura, peroxirredoxinas31 en eucariotas). La actividad de estos acompañantes depende fuertemente reversibles estructurales cambios conformacionales inducidos por una oxidación específica que destapa hidrofóbicas regiones implicadas en el reconocimiento de las proteínas mal plegadas del cliente.
Investigación del mecanismo de la agregación y los principios que rigen el reconocimiento de las proteínas del cliente por acompañantes no es fácil debido a la naturaleza dinámica y heterogénea de sustrato acompañante interacciones32,33, 34,35,36,37. Sin embargo, acompañantes regulados por el estrés tienen una oportunidad para avanzar en nuestra comprensión de la función de la agregación debido a su capacidad para: 1) obtener de dos formas diferentes de la acompañante, activo (p. ej., oxidada) e inactivos (por ejemplo, reducido), con la introducción o eliminación de una condición de estrés fácilmente cambiar entre ellos (p. ej., oxidante y reductor), 2) tiene una amplia gama de sustratos, 3) forman complejos muy estables con las proteínas de cliente que pueden ser evaluadas por diferentes metodologías estructurales y 4) se centran exclusivamente en el reconocimiento de sustrato y liberación, mediada por cambios conformacionales redox-dependientes, como la mayoría de estos acompañantes carece de la capacidad de plegado.
Aquí, analizamos la actividad contra la agregación de la bacteriana acompañante regulación redox de la Hsp33, un componente vital de los sistemas de defensa bacteriana contra la oxidación inducida por la proteína agregación28. Cuando reduce, la Hsp33 es una proteína de unión a zinc firmemente doblada sin actividad de acompañante; sin embargo, cuando se exponen al estrés oxidativo, Hsp33 sufre cambios conformacionales extensos que exponen su sustrato Unión regiones38,39. A la oxidación, el ion de zinc que está fuertemente enlazado a cuatro residuos de cisteína altamente conservados del dominio c-terminal es lanzado40. Esto resulta en la formación de enlaces de disulfuro dos, un despliegue de dominio C-terminal y una desestabilización de la región adyacente vinculador del41. Las regiones c-terminal y linker son altamente flexibles y se definen como intrínsecamente o parcialmente desordenado. Regreso a condiciones de estrés no, quedar reducidos las cisteínas y el acompañante vuelve a su estado doblado nativo sin actividad contra la agregación. El refolding de la acompañante conduce a un mayor despliegue y desestabilización de la proteína de clientes consolidados, que desencadena su transferencia al sistema canónicas acompañante, DnaK/J, para repliegue38. Análisis de sitios de interacción de Hsp33 sugiere que Hsp33 usos tanto desordenado su cargada regiones así como las regiones hidrofóbicas en el vinculador y el dominio N-terminal para capturar mal proteínas de cliente y evitar su agregación38, 42. en el estado doblado, estas regiones están ocultos por el vinculador doblado y el dominio C-terminal. Curiosamente, la región de linker sirve como guardián de estado plegado e inactivo de Hsp33 “sensing” el estado plegado de su lado de dominio C-terminal34. Una vez desestabilizado por mutagénesis (ya sea por una mutación de punto o una perturbación de la secuencia completa), Hsp33 se convierte en un acompañante constitutivamente activo independientemente el estado redox de sus cisteínas redox-sensibles43.
Los protocolos presentados aquí permiten monitoreo de actividad redox dependiente acompañante de Hsp33, así como cambios conformacionales mapeo sobre la activación y Unión de proteínas del cliente. Esta metodología se puede adaptar a investigación otros modelos de reconocimiento de acompañante del cliente así como las interacciones proteína-proteína de acompañante no. Por otra parte, se presentan los protocolos para la preparación de acompañantes totalmente reducidas y oxidadas que pueden utilizarse en estudios de otras proteínas redox-switch, para revelar el papel potencial de la oxidación de la proteína sobre la actividad de la proteína.
Específicamente, se describe un procedimiento para monitorear actividad chaperona en vitro y definir su especificidad de sustrato bajo diferentes tipos de agregación de la proteína (químicamente o térmicamente inducida) con dispersión de la luz (LS) medida por un fluorospectrometer44. Durante la agregación, dispersión de luz en 360 nm aumenta rápidamente debido a la creciente turbiedad. Por lo tanto, la agregación puede ser monitoreada en forma dependiente del tiempo en esta longitud de onda. LS es un método rápido y sensible para las pruebas de agregación de la proteína y, por tanto, la actividad contra la agregación de una proteína de interés usando concentraciones nanomolares, lo que permite la caracterización de los parámetros cinéticos relacionados con la agregación de proteína bajo diferentes condiciones. Además, el protocolo de LS descrito aquí no requiere la instrumentación costosa y puede establecerse fácilmente en cualquier laboratorio.
Sin embargo, es muy difícil obtener curvas cinéticas “limpio” y obtener parámetros cinéticos de la proteína de tal luz dispersión de experimentos, debido al ruido y la gran cantidad de afloramientos generada por las burbujas de aire y los grandes agregados. Para superar este obstáculo, presentamos una nueva herramienta gráfica, Kfits45, utilizada para reducir niveles de ruido en diferentes medidas cinéticas, equipados específicamente para datos cinéticos de la agregación de proteínas. Este software proporciona parámetros cinéticos preliminares para una primera evaluación de los resultados y le permite “limpiar” grandes cantidades de datos rápidamente sin afectar sus propiedades cinéticas. Kfits es implementado en Python y está disponible en código abierto a 45.
Una de las preguntas difíciles en el campo se refiere a la asignación de sitios de interacción entre acompañantes y sus proteínas de cliente y entender cómo acompañantes reconocen una amplia gama de sustratos mal plegadas. Esta pregunta es más complicada cuando el estudio de complejos de proteína altamente dinámicos que implican intrínsecamente desordenada acompañantes y propensas a la agregación de sustratos. Afortunadamente, espectrometría de masas estructural ha avanzado considerablemente en la última década y ha proporcionado con éxito enfoques útiles y herramientas para analizar la plasticidad estructural y mapa de residuos implicados en el reconocimiento de la proteína46, 47 , 48 , 49., presentamos aquí un tal cambio de técnica-hidrógeno-deuterio espectrometría de masas (HDX-MS)-que permite el mapeo de cambios del nivel del residuo en una conformación estructural sobre modificación de la proteína o proteína/ligando vinculante35, 50,51,52,53,54,55. HDX-MS utiliza el intercambio continuo de hidrógenos de la columna vertebral por deuterio, la tasa de que se ve afectada por el ambiente químico, accesibilidad, y covalentes y no covalentes56. HDX-MS pistas de estos procesos de cambio utilizando un disolvente deuterado, comúnmente agua pesada (D2O) y permite la medición basada en el cambio de peso molecular tras el hidrógeno al intercambio de deuterio. Más lenta tasa de intercambio hidrógeno-deuterio puede resultar de hidrógenos participar en enlaces de hidrógeno o, simplemente, de impedimento estérico, que indica los cambios locales en estructura57. Cambios a un ligando o modificaciones post-traduccionales también pueden conducir a diferencias en el entorno de hidrógeno, con un enlace lo que resulta en diferencias en el hidrógeno-deuterio intercambio (HDX) tarifas46,53.
Hemos aplicado esta tecnología a las regiones 1) mapa Hsp33 que rápidamente desarrollan sobre oxidación, conduciendo a la activación de la Hsp33 y 2) definen la interfaz de enlace potencial de la Hsp33 con su cuerpo entero sustrato mal plegada, citrato sintetasa (CS)38.
Los métodos descritos en este manuscrito pueden aplicarse para estudiar funciones redox-dependientes de las proteínas en vitro, definiendo la actividad contra la agregación y la función de los cambios estructurales (si cualquiera) en función de la proteína. Estas metodologías pueden ser fácilmente adaptadas a diversos sistemas biológicos y aplicadas en el laboratorio.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este trabajo, nos proporciona protocolos para el análisis de la actividad de acompañante de redox-dependientes y la caracterización de los cambios estructurales en la Unión de una proteína de cliente. Estas son metodologías complementarias para definir posibles complejos de sustrato acompañante y analizar posibles sitios de interacción.
Aquí, hemos aplicado estos protocolos para la caracterización de un complejo entre el acompañante regulación redox Hsp33 con un sustrato de acom…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores están agradecidos a Meytal Radzinski para sus discusiones útiles y crítica de la lectura del artículo y a Patrick Griffin y los miembros de su laboratorio por su ilimitada ayuda estableciendo la plataforma de análisis HDX. Los autores agradecemos a la Fundación alemana-Israel (I-2332-1149.9/2012), la Fundación binacional de ciencia (2015056), la beca de integración de Marie Curie (618806), la Fundación de Ciencias de Israel (1765/13 y 2629/16) y la ciencia humana de la frontera Programa (CDA00064/2014) por su apoyo financiero.
Materials
| Chemicals, Reagents | |||
| Acetonitrile HPLC plus | Sigma Aldrich | 34998-2.5L | solvent |
| Formic acid Optima LC/MS | Fisher Chemicals | A117-50 | solvent supplement |
| Isopropyl alcohol, HPLC grade | Fisher Chemicals | P750717 | solvent |
| Methanol | Fisher Chemicals | A456-212 | solvent |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma Aldrich | 252859 | buffer |
| Trifluoroacetic acid | Sigma Aldrich | 76-05-1 | solvent |
| Water for HPLC | Sigma Aldrich | 270733-2.5L-M | solvent |
| ZnCl2, Zinc Chloride | Merck | B0755416 308 | reagent |
| DTT | goldbio | 27565-41-9 | reducing agent |
| PD mini trap G-25 columns GE healthcare | GE healthcare | 29-9180-07 | desalting column |
| Potassium Phosphate | United states Biochemical Corporation | 20274 | buffer |
| Hydrogen peroxide 30% | Merck | K46809910526 | oxidizing agent |
| citrate synthase | sigma aldrich | C3260 | substrate |
| HEPES acid free | sigma aldrich | 7365-45-9 | buffer |
| Gndcl | sigma aldrich | G3272-500G | denaturant |
| Deuterium Chloride Solution | sigma aldrich | 543047-10G | buffer |
| Deuterium Oxide 99% | sigma aldrich | 151882-100G | solvent |
| TCEP | bioworld | 42000058-2 | reducing agent |
| 150uL Micro-Insert with Mandrel Interior & Polymer Feet, 29*5mm | La-Pha-Pack -Thermo Fischer Scientific | ||
| 1.5mL Clear Short Thread Vial 9mm Thread, 11.6*32mm | La-Pha-Pack -Thermo Fischer Scientific | ||
| quartz cuvette | Hellma 101-QS | ||
| Instruments | |||
| Jasco FP-8500 Fluorospectrometer | Jasco | ||
| Thermomixer Comfort | Eppendorf | 13058/0 | |
| Heraeus Megafuge 16R, bench topCentrifuge | Thermo Scientific | ||
| pH meter , PB-11 sartorius | Sartorius | 13119/0 | |
| AffiPro Immobilized Pepsin column (20mm length, 2.0mm diameter). | AffiPro | ||
| Waters Pre-column (ACQUITY UPLC BEH C18 VanGuard 130 Å, 1.7um, 2.1mmx5mm) | Waters | ||
| C18 analytical column (ACQUITY UPLC Peptide BEH c18 Column, 130 Å, 1.7um, 2.1mmx50mm) | |||
| Vinyl Anaerobic chamber with Airlock door | COY | ||
| Q-exactive-orbitrap mass spectrometer | Thermo-Fischer Scientific | ||
| PAL system LHX – robotic system for handling HDX samples | PAL system | https://www.palsystem.com/index.php?id=840 | |
| Dionex Ultimate 3000, XRS pump | Thermo Scientific | ||
| Dionex AXP-MS auxiliary pump | Thermo Scientific | ||
| Software, Software Tools, Database search | |||
| Kfits: Fit aggregation Data | http://kfits.reichmannlab.com/fitter/ | ||
| Thermo Scientific Xcalibur software | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/OPTON-30487 | ||
| Q Exactive MS Series Tune Interface (Tune) | https://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/WS-MS-Q-Exactive-Calibration-Maintenance-iQuan2016-EN.pdf | ||
| Chronos software (Axel Semrau) | http://www.axel-semrau.de/en/Software/Software+Solutions/Chronos-p-966.html | ||
| Proteome Discoverer V1.4 software | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/OPTON-30795 | ||
| HDX workbench software | http://hdx.florida.scripps.edu/hdx_workbench/Home.html | ||
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