Hsp33의 Redox 규제 보호자 활동을 정의 하 고 수소 중수소 교환 질량 분석을 사용 하 여 Hsp33에 구조적 변화를 매핑
Summary
유기 체는 그들의 일생 동안 발생 하는 가장 어려운 스트레스 조건 중 하나에 oxidants의 축적을 포함 한다. 산화 스트레스, 동안 셀 무 겁 게 의존 분자 보호자. 여기, 우리는 HDX MS를 사용 하 여 보호자 기능을 경 세 하는 구조적인 변화를 모니터링으로 redox 규제 안티 집단 활동, 또한 조사 하는 데 사용 하는 방법 제시.
Abstract
생명체는 온도, pH, 반응 산소 종의 축적 등에서 변화를 포함 하 여 그들의 수명 주기 동안 환경 변동에 대처 하기 위해 정기적으로 필요 합니다. 이러한 변동 광범위 한 단백질 전개, 집계,으로 이어질 수 있으며 세포 죽음. 따라서, 세포 스트레스 조건 중 “건강 한” 프로테옴을 유지 하는 분자 보호자의 역동적이 고 스트레스 관련 네트워크를 진화 했다. ATP-독립 보호자 일선 방위 분자, 스트레스-종속 방식에서 단백질 집계에 대 한 보호로 봉사 하는 분자 보호자의 1 개의 주요 클래스를 구성 합니다. 한 이러한 보호자 공통점 기능은 그들의 스트레스 관련 활성화, 인식 및 misfolded 클라이언트의 버전에 대 한 구조적인가 소성을 활용 하는 능력.
이 문서에서 우리는 한 그러한 본질적으로 무질서 보호자, 단백질 산화 스트레스 동안 집계에 대 한 보호는 세균성 산화 규제 Hsp33의 기능 및 구조 분석에 집중 한다. 여기, 선물이, 보호자의 구조적 변화를 매핑 뿐만 아니라 보호자 redox 규제 활동, 공부에 대 한 다양 한 기술의 도구 상자 밑에 그것의 활동. 특히, 우리는 보호자 안티 집계 활동에서 생체 외에서 빛 산란을 사용 하 여의 정도에 초점을 맞추고의 분석 이어서 완전히 감소 하 고 완벽 하 게 산화 단백질의 준비를 포함 하는 워크플로 설명 합니다 반대로 집계 활동과 그 활동입니다. 극복 하기 위해 자주 outliers 집계 분석 하는 동안 축적 된, Kfits, 운동 측정의 쉬운 처리를 수 있는 새로운 그래픽 도구 사용을 설명 합니다. 이 도구는 쉽게 다른 유형의 outliers를 제거 및 운동 매개 변수 피팅 운동 측정에 적용할 수 있습니다. 단백질 구조와 기능을 연결할 설치 및 워크플로 구조 질량 분석 기술, 수소 중수소 교환 질량 분석, 구조적 변화의 매핑은 보호자 수의 설명 및 Hsp33 활동의 다른 단계 동안 있는 기질 다른 단백질-리간드 및 단백질-단백질 상호 작용에는 동일한 방법론을 적용할 수 있습니다.
Introduction
셀 자주 발생 하는 반응성 산소 종 (선생님)의 호흡1,2, 단백질 및 지질 산화3,4및 추가 프로세스5, 부산물 생산의 축적 6,7. 선생님 셀룰러 신호8,9 및 면역 응답10등 다양 한 생물학 과정에서 유익한 역할에 불구 하 고 선생님 생산 및 그것의 해독 사이의 불균형이 발생할 수 있습니다, 산화를 선도 7스트레스. 선생님의 생물 목표 단백질, 지질 및 핵 산의 산화가 그들의 구조와 기능에 영향을 미칠 있습니다. 따라서, 셀룰러 oxidants의 축적은 강하게 pathologies 암9,11, 염증12,13, 노화14, 등의 다양 한 범위에 연결 15, 그리고 발병 및 Alzheimer의, 파 킨 슨 병 같은 신경 퇴행 성 질환의 진행, 그리고 루 게 릭 병 질환16,,1718에 관련 된 발견 되었습니다.
모두 새로 합성 하 고 성숙한 단백질 단백질 구조와 기능19,20모양 그들의 사이드 체인의 잠재적으로 유해한 수정으로 인 산화에 매우 민감합니다. 따라서, 산화 스트레스는 일반적으로 광범위 한 단백질 비활성화, misfolding 및 집계, 결국 세포 죽음으로 이어지는 리드. 광범위 한 단백질 집계 misfolded 클라이언트 단백질21와 안정 되어 있는 복합물을 형성 하는 대신 억제 redox 종속 보호자를 활용 하는 단백질 산화의 잠재적인 손상에 대처 하기 위해 우아한 셀룰러 전략 중 하나 ,,2223. 이 첫 번째-라인 방어 보호자 강력한 안티 집계 분자24로 그들을 변환 하는 (보통에 시스테인 잔류물) 사이트별 산화에 의해 급속 하 게 활성화 됩니다. 산화 스트레스 조건25,26 동안 정식 ATP 의존 보호자는 덜 효과적인 산화 스트레스 결과 호흡 억제 및 세포질 ATP 레벨25감소, 이후 27. 따라서, ATP 독립 보호자 redox 활성화 재생 oxidants 박테리아 및 진핵생물의 축적에 따라 단백질 항상성 유지에 중요 한 역할 (예:Hsp3328 , RidA29 박테리아, Get3에에서30 효 모, peroxiredoxins31 진핵생물에서에서). 이러한 보호자의 활동 강하게 소수 지역 misfolded 클라이언트 단백질의 인식에 관련 된 폭로 사이트 산화에 의해 유도 된 가역 구조 구조적 변화에 따라 달라 집니다.
반대로 집계 메커니즘 및 클라이언트 단백질의 인식 보호자에 의해 통치 원리의 연구 보호자 기판 상호 작용32,33의 역동적이 고 heterogenic 특성상 쉽지 않다 34,35,,3637. 그러나, 스트레스 통제 보호자는 그들의 능력 때문 반대로 집계 함수에 대 한 우리의 이해를 전진 하는 기회: 1)는 보호자, (예를 들면, 산화) 활성 및 비활성 (예를 들어, 두 가지 형태를 얻을 감소), 소개 또는 쉽게 전환 (예:산화 제, 환 원제), 그들 2 스트레스 조건 제거)는 광범위 한 기판, 3) 클라이언트 단백질에 의해 평가 될 수 있는 매우 안정적인 단지 형성 다른 구조적 방법론, 및 4) 기판 인식 및 릴리스, 대부분 이러한 보호자의 접는 기능 부족으로 redox-종속 구조적 변화에 의해 중재에 전적으로 초점을.
여기, 우리 세균 redox 규제 보호자 Hsp33의 안티 집계 활동, 산화 유도 단백질 집계28에 대 한 세균 방어 시스템의 중요 한 구성 요소를 분석합니다. Hsp33는 활동 없이 보호자; 밀접 하 게 접힌된 아연-바인딩 단백질 감소, 그러나, 산화 스트레스에 노출 되 면 Hsp33의 기판 바인딩 지역38,39노출 광범위 한 구조적 변화를 겪 습. 산화, 시 C 터미널 도메인의 4 개의 높은 보존된 시스테인 잔류물에 강력 하 게 바인딩된 아연 이온 출시40입니다. 이 결과 C 터미널 도메인 및 인접 한 링커 지역41의 불안의 전개는 두 개의 이황화 결합의 대형에. C-터미널, 링커가 지역은 매우 유연 하며 본질적으로 또는 부분적으로 무질서로 정의 됩니다. 아닌 스트레스 조건에 반환, 시는 시스테인 감소 되 고는 보호자 안티 집계 활동 없이 네이티브 접힌된 상태로 돌아갑니다. 보호자의 refolding 더 전개를 지도 하 고 바인딩된 클라이언트 단백질 트리거 refolding38정식 보호자 시스템, DnaK/J, 그것의 이동의 불안정. Hsp33의 상호 작용 사이트의 분석 제안 Hsp33 사용 하 여 두의 충전 무질서 잡으려고 링커 N 맨끝 도메인에 소수 성 영역 뿐만 아니라 영역 클라이언트 단백질을 misfolded 고 방지 그들의 집계38, 42. 접힌된 상태에서이 지역 접힌된 링커 및 C 터미널 도메인으로 숨겨져 있습니다. 흥미롭게도, 링커 지역 “감지” 그것의 인접 한 C 터미널 도메인34의 접는 상태 Hsp33의 접힌된 비활성 상태의 게이트 키퍼 역할을 합니다. (포인트 돌연변이 또는 전체 순서 섭 동에 의해 중) mutagenesis에 의해 불안정 하 게, 일단 그것의 산화 환 원에 민감한 시스테인43의 산화 환 원 상태 Hsp33 constitutively 활성 보호자 관계 없이로 변환 됩니다.
여기에 제시 된 프로토콜 활성화 시 매핑은 구조적 변화 뿐만 아니라 Hsp33의 redox 종속 보호자 활동 모니터링 클라이언트 단백질의 바인딩을 허용 합니다. 이 방법론은 다른 보호자 클라이언트 인식 모델 뿐만 아니라 비 보호자 단백질-단백질 상호 작용 연구에 적용할 수 있습니다. 또한, 우리는 단백질 활동에 단백질 산화의 잠재적인 역할을 다른 산화 환 원 스위치 단백질의 연구에 사용할 수 있는 완벽 하 게 감소 하 고 산화 보호자의 준비에 대 한 프로토콜을 제시.
우리가 보호자 활동에서 생체 외에서 모니터링 하 고 다른 유형의 단백질 집계 (화학적 또는 열 유도) 산란 (LS)에 의해 측정을 사용 하 여에서 그것의 기질 특이성을 정의 하는 절차를 설명 하는 구체적으로 fluorospectrometer44. 집계, 동안 360 nm 증가 급속 하 게 증가 탁 때문에 분산을 빛. 따라서,이 파장에서 시간에 따른 방식으로 집계를 모니터링할 수 있습니다. LS는 단백질 집계 및 따라서 nanomolar 농도, 활성화 단백질 집계 관련 운동 매개 변수에서 다른 특성을 사용 하 여 관심사의 단백질의 안티 집계 작업 테스트를 위한 신속 하 고 민감한 방법 조건입니다. 또한, 여기에 설명 된 LS 프로토콜 비싼 장비를 요구 하지 않는다 그리고 어떤 실험실에 쉽게 설치 될 수 있다.
그럼에도 불구 하 고, 그것은 “깨끗 한” 운동 곡선을 얻을 수와 같은 빛을 뿌리는 실험, 소음 및 공기 방울 및 큰 집계에 의해 생성 된 outliers의 많은 수에서 단백질의 운동 매개 변수를 파생 하는 매우 도전. 이 장애물을 극복 하기 위해 소설 그래픽 도구, Kfits45, 다른 운동 측정, 특히 단백질 집계 운동 데이터에 대 한 장착에 잡음 레벨을 감소 시키기를 위해 사용 하는 것이 선물이. 이 소프트웨어는 결과의 초기 평가 대 한 예비 운동 매개 변수를 제공 하 고 “깨끗 한” 많은 양의 데이터 신속 하 게 운동 속성을 영향을 주지 않고 사용자 수 있습니다. Kfits 파이썬에서 구현 이며 45오픈 소스에서 사용할 수 있습니다.
필드에 도전적인 질문 중 하나는 보호자와 그들의 클라이언트 단백질 사이 상호 작용 사이트를 매핑 및 보호자 misfolded 기판의 넓은 범위를 인식 하는 방법을 이해 관련이 있습니다. 이 질문은 더 복잡 보호자 및 집계 경향이 기판 무질서 공부 본질적으로 포함 하는 매우 동적인 단백질 복합물. 다행히도, 구조 질량 분석은 극적으로 지난 10 년간 고급 고가 성공적으로 도움이 접근 및 구조상가 소성을 분석 하 고 잔류물 단백질 인식46, 에 지도 하는 도구 47 , 48 , 49. 여기, 선물이 하나 이러한 기술은 수소 중수소 교환 질량 분석 (HDX-MS)-단백질 수정 또는 단백질/Ligand 바인딩35, 구조 형태에 잔류물 수준 변경의 매핑 수 있습니다 50,51,,5253,54,55. HDX MS 중수소, 화학 환경, 접근성, 속도의 영향을 받는 여 백본 hydrogens의 지속적인 교류를 사용 및 공유 및 공유 결합56. HDX MS deuterated 용 매, 일반적으로 중 수 (D2O)를 사용 하 여 이러한 exchange 프로세스를 추적 하 고 측정 수소 중수소 교환에 따라 분자량의 변화에 따라 수 있습니다. 수소 중수소 교환 속도가 느리거나 hydrogens 수소 결합에 참여 또는, 간단 하 게, 구조57에서 로컬 변경 사항을 나타내는 입체 방해에서에서 발생할 수 있습니다. Ligand 바인딩 또는 포스트 번역 상 수정 변경 수소 중수소 교환 (HDX) 요금46,53에 차이에 결과 바인딩을 사용 하 여 수소 환경에 차이 또한 발생할 수 있습니다.
우리는 급속 하 게 산화, Hsp33의 활성화로 이어지는 시 전개 2) 그것의 전체 길이 misfolded 기판, 구 연산 염 synthase (CS)38와 Hsp33의 잠재적인 바인딩 인터페이스 정의 1) 지도 Hsp33 지역에이 기술을 적용.
이 원고에 설명 된 방법은 redox 종속 기능 단백질에 체 외에, 안티 집계 활동 및 정의 구조 변경의 역할 (있을 경우) 단백질 기능 연구에 적용할 수 있습니다. 이러한 방법론을 쉽게 다양 한 생물 학적 시스템에 적응 하 고 실험실에서 적용 될 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 문서에서 우리는 redox 종속 보호자 활동의 분석 및 클라이언트 단백질의 바인딩 따라 구조 변화의 특성에 대 한 프로토콜 제공. 이들은 잠재적인 보호자 기판 단지 정의 하 고 잠재적인 상호 작용 사이트 분석을 보완 방법론입니다.
여기, 우리는 잘 공부 보호자 기판 CS와 redox 규제 보호자 Hsp33 사이 복잡 한 특성에 대 한 이러한 프로토콜을 적용. 우리는 두 가지 유형의 단백?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 그녀의 도움이 토론에 대 한 Meytal Radzinski에 게 감사 하 고 HDX 분석 플랫폼을 설정 하는 동안 그들의 무제한 지원에 대 한 문서, 그리고 패트릭 그리핀와 그의 실험실 멤버를 읽고 중요 한 있습니다. 저자는 독일-이스라엘 재단 (나-2332-1149.9/2012), Binational 과학 재단 (2015056), 마리 퀴리 통합 그랜트 (618806), 이스라엘 과학 재단 감사 (1765/13 고 2629/16), 그리고 인간 프론티어 과학 그들의 재정 지원 프로그램 (CDA00064/2014).
Materials
| Chemicals, Reagents | |||
| Acetonitrile HPLC plus | Sigma Aldrich | 34998-2.5L | solvent |
| Formic acid Optima LC/MS | Fisher Chemicals | A117-50 | solvent supplement |
| Isopropyl alcohol, HPLC grade | Fisher Chemicals | P750717 | solvent |
| Methanol | Fisher Chemicals | A456-212 | solvent |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma Aldrich | 252859 | buffer |
| Trifluoroacetic acid | Sigma Aldrich | 76-05-1 | solvent |
| Water for HPLC | Sigma Aldrich | 270733-2.5L-M | solvent |
| ZnCl2, Zinc Chloride | Merck | B0755416 308 | reagent |
| DTT | goldbio | 27565-41-9 | reducing agent |
| PD mini trap G-25 columns GE healthcare | GE healthcare | 29-9180-07 | desalting column |
| Potassium Phosphate | United states Biochemical Corporation | 20274 | buffer |
| Hydrogen peroxide 30% | Merck | K46809910526 | oxidizing agent |
| citrate synthase | sigma aldrich | C3260 | substrate |
| HEPES acid free | sigma aldrich | 7365-45-9 | buffer |
| Gndcl | sigma aldrich | G3272-500G | denaturant |
| Deuterium Chloride Solution | sigma aldrich | 543047-10G | buffer |
| Deuterium Oxide 99% | sigma aldrich | 151882-100G | solvent |
| TCEP | bioworld | 42000058-2 | reducing agent |
| 150uL Micro-Insert with Mandrel Interior & Polymer Feet, 29*5mm | La-Pha-Pack -Thermo Fischer Scientific | ||
| 1.5mL Clear Short Thread Vial 9mm Thread, 11.6*32mm | La-Pha-Pack -Thermo Fischer Scientific | ||
| quartz cuvette | Hellma 101-QS | ||
| Instruments | |||
| Jasco FP-8500 Fluorospectrometer | Jasco | ||
| Thermomixer Comfort | Eppendorf | 13058/0 | |
| Heraeus Megafuge 16R, bench topCentrifuge | Thermo Scientific | ||
| pH meter , PB-11 sartorius | Sartorius | 13119/0 | |
| AffiPro Immobilized Pepsin column (20mm length, 2.0mm diameter). | AffiPro | ||
| Waters Pre-column (ACQUITY UPLC BEH C18 VanGuard 130 Å, 1.7um, 2.1mmx5mm) | Waters | ||
| C18 analytical column (ACQUITY UPLC Peptide BEH c18 Column, 130 Å, 1.7um, 2.1mmx50mm) | |||
| Vinyl Anaerobic chamber with Airlock door | COY | ||
| Q-exactive-orbitrap mass spectrometer | Thermo-Fischer Scientific | ||
| PAL system LHX – robotic system for handling HDX samples | PAL system | https://www.palsystem.com/index.php?id=840 | |
| Dionex Ultimate 3000, XRS pump | Thermo Scientific | ||
| Dionex AXP-MS auxiliary pump | Thermo Scientific | ||
| Software, Software Tools, Database search | |||
| Kfits: Fit aggregation Data | http://kfits.reichmannlab.com/fitter/ | ||
| Thermo Scientific Xcalibur software | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/OPTON-30487 | ||
| Q Exactive MS Series Tune Interface (Tune) | https://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/WS-MS-Q-Exactive-Calibration-Maintenance-iQuan2016-EN.pdf | ||
| Chronos software (Axel Semrau) | http://www.axel-semrau.de/en/Software/Software+Solutions/Chronos-p-966.html | ||
| Proteome Discoverer V1.4 software | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/OPTON-30795 | ||
| HDX workbench software | http://hdx.florida.scripps.edu/hdx_workbench/Home.html | ||
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