تصور التفاعل بين المسمى قدوت البروتين والحمض النووي λ سيتيسبيسيفيكالي تم التعديل على مستوى جزيء واحد
Summary
نقدم هنا، بروتوكولا لدراسة التفاعلات الحمض النووي-البروتين بالتأمل الداخلي الإجمالي fluorescence مجهرية (تيرفم) استخدام ركيزة λ سيتيسبيسيفيكالي تعديل الحمض النووي وكم-نقطة المسمى البروتين.
Abstract
مجهرية fluorescence إسهامات عظيمة في تشريح آليات معقدة من العمليات البيولوجية على مستوى جزيء واحد. في فحوصات جزيء واحد لدراسة التفاعلات بين الحمض النووي من البروتين، وهناك اثنين من العوامل الهامة للنظر فيها: الركيزة الحمض النووي بما يكفي لطول السهل والمراقبة ووضع العلامات بروتين مع تحقيق فلورسنت مناسب. 48.5 kb λ الحمض النووي مرشح جيد للركيزة الحمض النووي. نقاط الكم (قدوتس)، كفئة من المسابر الفلورسنت، السماح للمراقبة منذ فترة طويلة (دقائق إلى ساعات)، والحصول على صورة عالية الجودة. في هذه الورقة، نقدم بروتوكولا لدراسة تفاعلات البروتين الحمض النووي على مستوى جزيء واحد، الذي يشمل إعداد λ سيتيسبيسيفيكالي تعديل الحمض النووي ووصفها بروتين المستهدف مع المغلفة ستريبتافيدين قدوتس. لدليل على المفهوم، نختار شركة مصفاة نفط عمان (التعرف على منشأ المعقدة) في مهدها الخميرة وتين فائدة وتصور تفاعله مع أرس (تسلسل تكرار صورة مستقلة) باستخدام تيرفم. مقارنة مع أخرى تحقيقات الفلورسنت، قدوتس بمزايا واضحة في دراسات جزيء واحد نظراً لاستقرارها عالية ضد فوتوبليتشينج، ولكن تجدر الإشارة إلى أن هذه الخاصية تحد من تطبيقها في الاختبارات الكمية.
Introduction
التفاعلات بين البروتينات والحمض النووي تعتبر أساسية للعديد من العمليات البيولوجية المعقدة، مثل تكرار الحمض النووي، وإصلاح الحمض النووي، والنسخ. على الرغم من أن النهج التقليدية قد يلقي الضوء على خصائص هذه العمليات، العديد من الآليات الرئيسية لا تزال غير واضحة. ، مع تقنيات جزيء واحد سريع النمو، بعض الآليات في الآونة الأخيرة تناول1،،من23.
تطبيق الفحص المجهري fluorescence جزيء واحد على تصور تفاعلات البروتين-الحمض النووي في الوقت الحقيقي أساسا يعتمد على وضع الكشف عن الأسفار والمسابير الفلورسنت. لدراسة جزيء واحد، من المهم أن تسمية بروتين الاهتمام مع تحقيق فلورسنت مناسب نظراً لأنظمة الكشف عن الأسفار في معظمها متاح تجارياً.
ويشيع استخدام البروتينات الفلورية في البيولوجيا الجزيئية. ومع ذلك، منخفضة الإضاءة الفلورية والاستقرار ضد فوتوبليتشينج تقييد تطبيقها في العديد من فحوصات جزيء واحد. النقاط الكم (قدوتس) إشارات صغيرة جسيمات نانوية4. نظراً لخصائصها الضوئية الفريدة، قدوتس 10-20 مرات أكثر إشراقا والأصباغ عدة آلاف المرات أكثر استقرارا من المستخدمة على نطاق واسع العضوية5. وعلاوة على ذلك، قد قدوتس كبير ستوكس تحول (الفرق بين موقف قمم الإثارة والانبعاثات)5. وهكذا، يمكن استخدام قدوتس للمراقبة منذ فترة طويلة (دقائق إلى ساعات)، والحصول على صور ذات المعدلات العالية من الإشارات إلى الضجيج، في حين أنهم لا يمكن أن تستخدم في الاختبارات الكمية.
وحتى الآن، هناك طريقتان لتسمية بروتين المستهدف مع قدوتس سيتيسبيسيفيكالي: وسم مع المعونة من قدوت مترافق الابتدائي أو الثانوي الأجسام المضادة6،،من78؛ أو وضع العلامات المستهدفة البروتين مع قدوتس مباشرة، التي ترتكز على تفاعل قوي بين البيوتين وستريبتافيدين9،،من1011،،من1213. قدوتس Streptavidin المغلفة متوفرة تجارياً. في دراستنا الأخيرة، سيتيسبيسيفيكالي كانت تنقية البروتينات بيوتينيلاتيد في مهدها الخميرة بكفاءة عالية من co-overexpression من البيرا ومعلم أفي البروتينات في فيفو10. بالتالي والاستفادة المثلى من فحوصات جزيء واحد14،15،،من1617، لاحظنا التفاعلات بين البروتينات المسماة قدوت والحمض النووي في استخدام جزيء واحد مستوى تيرفم10.
هنا، علينا أن نختار في مهدها الخميرة أصل الاعتراف المعقدة (شركة مصفاة نفط عمان)، التي يمكن التعرف على وجه التحديد والربط بتسلسل صورة مستقلة النسخ المتماثل (جمعية الإغاثة اﻷرمنية)، كما لدينا بروتين الفائدة. ويقدم البروتوكول التالي إجراء خطوة بخطوة لتصور التفاعل بين شركة مصفاة نفط عمان المسمى قدوت مع جمعية الإغاثة اﻷرمنية باستخدام تيرفم. ويرد وصف إعداد الركيزة الحمض النووي تم التعديل سيتيسبيسيفيكالي، بيوتينيليشن الحمض النووي، وتنظيف ساترة والروغان، الجمعية تدفق الخلية، وتصوير جزيء واحد.
Protocol
Representative Results
Discussion
نقدم هنا، وضع بروتوكول لمراقبة التفاعل بين البروتين المسمى قدوت والحمض النووي λ سيتيسبيسيفيكالي المعدلة باستخدام تيرفم في خلية تدفق. وتشمل الخطوات اللازمة الخاصة بالموقع تعديل الركازة الحمض النووي والحمض النووي بيوتينيليشن، وتنظيف ساترة والروغان، خلية تدفق إعداد، وتصوير جزيء واحد. وه?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر الدكتور حسن يارديمسى ويارديمسي Dr.Sevim معهد فرانسيس كريك لنوع المساعدة في التجارب جزيء واحد، الدكتور دانيال دوزديفيتش من مختبر الدكتور إريك جيم غرين من جامعة كولومبيا، الدكتور يوجي الشمس من جامعة بكين والدكتور كونلي تشن من جامعة تسينغهوا لإجراء مناقشة مفيدة. وأيد هذه الدراسة “الوطنية العلوم الطبيعية مؤسسة في الصين” 31371264، 31401059، فريق الابتكار متعدد التخصصات الأكاديمية ونيوتن المتقدم الزمالة (NA140085) من “الجمعية الملكية”.
Materials
| Lambda DNA | New England Biolabs | N3011 | Store 25 μL aliquots at -20 ºC. |
| XhoI enzyme | Thermo Fisher Scientific | FD0694 | |
| Quick-fusion cloning kit | Biotool | B22611 | |
| MaxPlax Lambda Packaging Extracts |
Epicentre | MP5110 | Bacterial strain LE392MP is included in this package. |
| MgSO4 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10013092 | Any brand is acceptable. |
| Tris | Amresco | 0497-5KG | |
| NaCl | Beijing Chemical works | N/A | Any brand is acceptable. |
| MgCl2 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10012818 | |
| Chloroform | Beijing Chemical works | N/A | Any brand is acceptable. |
| NZ-amine | Amresco | J853-250G | |
| Casamino acids | Sigma-Aldrich | 22090-500G | |
| PEG8000 | Beyotime | ST483 | |
| Magnetic stirring apparatus | IKA | KMO2 basic | |
| 15 mL Eppendorf tube | Eppendorf | 30122151 | 15 mL, sterile, bulk, 500pcs |
| Rnase | SIGMA | R4875-100MG | |
| Dnase | SIGMA | D5319-500UG | |
| Proteinase K | Amresco | 0706-100MG | |
| Biotinylated primers | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| T4 DNA ligase, T4 DNA Ligase, Reaction Buffer (10x) | New England Biolabs | M0202 | |
| Coverslip | Thermo Fisher Scientific | 22266882 | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10009259 | |
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | 306568-100G | |
| Acetone | Thermo Fisher Scientific | A949-4 | |
| H2SO4 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80120891 | sulfuric acid |
| H2O2 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10011218 | 30% Hydrogen peroxide |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 322415-2L | |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | V900798 | |
| APTES | Sigma-Aldrich | A3648 | |
| mPEG (methoxy-polyethylene glycol) |
Lysan | mPEG-SVA-5000 | |
| biotin-PEG (biotin-polyethylene glycol) |
Lysan | Biotin-PEG-SVA-5000 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | 31437-500G | |
| Vacuum desiccator | Tianjin Branch Billion Lung Experimental Equipment Co., Ltd. | IPC250-1 | |
| Vacuum sealer | MAGIC SEAL | WP300 | |
| Diamond-tipped glass scribe | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 70036 | |
| Glass slide | Sail Brand | 7101 | |
| Inlet tubing | SCI (Scientific Commodties INC.) | BB31695-PE/2 | inner diameter 0.38 mm; outer diameter 1.09 mm. |
| Outlet tubing | SCI (Scientific Commodties INC.) | BB31695-PE/4 | inner diameter 0.76 mm; outer diameter 1.22 mm. |
| Double-sided tape | Sigma-Aldrich | GBL620001-1EA | |
| Epoxy | LEAFTOP | 9005 | five minutes epoxy |
| Streptavidin | Sigma-Aldrich | S4762 | |
| Fluorescence Microscope | Olympus | IX71 | |
| Infusion/withdrawal programmable pump |
Harvard apparatus | 70-4504 | |
| 532 nm laser | Coherent | Sapphire-532-50 | |
| 640 nm laser | Coherent | OBIS-640-100 | |
| EMCCD Camera | Andor | DU-897E-CS0-BV | |
| W-View Gemini Imaging splitting optics |
Hamamatsu photonics K.K. | A12801-01 | |
| TIRF illumination system | Olympus | IX2-RFAEVA2 | |
| 60×TIRF objective | Olympus | APON60XOTIRF | |
| Quad-edge laser dichroic beamsplitter |
Semrock | Di01-R405/488/ 532/635-25×36 |
|
| Quad-band bandpass filter | Semrock | FF01-446/510/ 581/703-25 |
|
| Dichroic beamsplitter | Semrock | FF649-Di01-25×36 | |
| Emission filter | Chroma Technology Corp | ET585/65m | |
| Emission filter | Chroma Technology Corp | ET665lp | |
| FocalCheck fluorescence, microscope test slide #1 | Thermo Fisher Scientific | F36909 | |
| SYTOX Orange | Thermo Fisher Scientific | S11368 | |
| Qdot705 Streptavidin Conjugate | Thermo Fisher Scientific | Q10163MP | Store at 4 ºC, do not freeze. |
| ATP | Amresco | 0220-25G | Prepare 200 mM ATP solution, using ddH2O, adjust pH to 7.0, and store 10 μL aliquots at -20 ºC. |
| DTT | Amresco | M109-5G | Prepare 1 M solution using ddH2O, and store 10 μl aliquots at -20 ºC. |
References
- Fu, Y. V., et al. Selective Bypass of a Lagging Strand Roadblock by the Eukaryotic Replicative DNA Helicase. Cell. 146 (6), 930-940 (2011).
- Qi, Z., et al. DNA sequence alignment by microhomology sampling during homologous recombination. Cell. 160 (5), 856-869 (2015).
- Chong, S., Chen, C., Ge, H., Xie, X. S. Mechanism of transcriptional bursting in bacteria. Cell. 158 (2), 314-326 (2014).
- Wegner, K. D., Hildebrandt, N. Quantum dots: bright and versatile in vitro and in vivo fluorescence imaging biosensors. Chemical Society Reviews. 44 (14), 4792-4834 (2015).
- Gao, X., et al. In vivo molecular and cellular imaging with quantum dots. Current opinion in biotechnology. 16 (1), 63-72 (2005).
- Sternberg, S. H., Redding, S., Jinek, M., Greene, E. C., Doudna, J. A. DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9. Nature. 507 (7490), 62 (2014).
- Lee, J. Y., Finkelstein, I. J., Arciszewska, L. K., Sherratt, D. J., Greene, E. C. Single-molecule imaging of FtsK translocation reveals mechanistic features of protein-protein collisions on DNA. Molecular cell. 54 (5), 832-843 (2014).
- Wang, H., Tessmer, I., Croteau, D. L., Erie, D. A., Van Houten, B. Functional characterization and atomic force microscopy of a DNA repair protein conjugated to a quantum dot. Nano letters. 8 (6), 1631-1637 (2008).
- Redding, S., et al. Surveillance and processing of foreign DNA by the Escherichia coli CRISPR-Cas system. Cell. 163 (4), 854-865 (2015).
- Xue, H., et al. Utilizing Biotinylated Proteins Expressed in Yeast to Visualize DNA-Protein Interactions at the Single-Molecule Level. Frontiers in microbiology. 8, 2062 (2017).
- Duzdevich, D., et al. The dynamics of eukaryotic replication initiation: origin specificity, licensing, and firing at the single-molecule level. Molecular cell. 58 (3), 483-494 (2015).
- Hughes, C. D., et al. Real-time single-molecule imaging reveals a direct interaction between UvrC and UvrB on DNA tightropes. Nucleic acids research. 41 (9), 4901-4912 (2013).
- Kad, N. M., Wang, H., Kennedy, G. G., Warshaw, D. M., Van Houten, B. Collaborative dynamic DNA scanning by nucleotide excision repair proteins investigated by single-molecule imaging of quantum-dot-labeled proteins. Molecular cell. 37 (5), 702-713 (2010).
- Chandradoss, S. D., et al. Surface Passivation for Single-molecule Protein Studies. Jove-Journal of Visualized Experiments. (86), (2014).
- Chen, X. Q., Zhao, E. S., Fu, Y. V. Using single-molecule approach to visualize the nucleosome assembly in yeast nucleoplasmic extracts. Science Bulletin. 62 (6), 399-404 (2017).
- Yardimci, H., Loveland, A. B., van Oijen, A. M., Walter, J. C. Single-molecule analysis of DNA replication in Xenopus egg extracts. Methods. 57 (2), 179-186 (2012).
- Tanner, N. A., Loparo, J. J., van Oijen, A. M. Visualizing single-molecule DNA replication with fluorescence microscopy. Journal of visualized experiments: JoVE. (32), (2009).
- Lockett, T. J. A bacteriophage λ DNA purification procedure suitable for the analysis of DNA from either large or multiple small lysates. Analytical biochemistry. 185 (2), 230-234 (1990).
- Smith, E. A., Chen, W. How to prevent the loss of surface functionality derived from aminosilanes. Langmuir. 24 (21), 12405-12409 (2008).
- Kim, Y., Torre, A., Leal, A. A., Finkelstein, I. J. Efficient modification of λ-DNA substrates for single-molecule studies. Scientific reports. 7 (1), 2071 (2017).
