Qdot etiketli Protein ve Site-specifically tarihinde λ DNA molekülünü düzeyinde arasındaki etkileşimi görüntülenmesi
Summary
Burada, DNA-protein etkileşimleri site-specifically değiştirilmiş λ DNA substrat ve protein etiketli bir kuantum nokta kullanarak toplam iç yansıma floresans mikroskobu tarafından (TIRFM) eğitim için bir iletişim kuralı mevcut.
Abstract
Floresans mikroskobu karmaşık biyolojik süreçlerin tek molekül düzeyinde mekanizmaları dissekan harika katkılar yaptı. DNA-protein etkileşimleri çalışmak için tek molekül deneyleri içinde değerlendirilmesi için iki önemli etken vardır: DNA substrat kolay gözlem ve bir protein ile uygun bir floresan probe etiketleme için yeterli uzunlukta. 48,5 kb λ DNA DNA substrat için iyi bir adaydır. Kuantum nokta (Qdots), uzun süre gözlem (dakika saat) ve yüksek kaliteli resim alma floresan problar, bir sınıf olarak izin verir. Bu yazıda, biz DNA-protein etkileşimleri site-specifically değiştirilmiş λ DNA hazırlama ve streptavidin kaplı Qdots bir hedef proteini etiketleme içerir tek molekül düzeyinde eğitim için bir iletişim kuralı mevcut. Kavram kanıtı için ORC (kökenli tanıma karmaşık) içinde mayası faiz bir protein seçin ve TIRFM kullanarak bir ARS (özerk Çoğaltma sırası) ile etkileşimi görselleştirin. Diğer Floresan problar ile karşılaştırıldığında, Qdots ise tek molekül çalışmaları nedeniyle yüksek istikrarı photobleaching karşı bariz avantajı var, ama bu özellik nicel deneyleri kendi uygulamasında sınırlar unutulmamalıdır.
Introduction
Protein ve DNA arasındaki etkileşimler DNA ikileşmesi, DNA tamiri ve transkripsiyon gibi birçok karmaşık biyolojik süreçler için gereklidir. Her ne kadar geleneksel yaklaşımlar özellikleri bu süreçlerin ışık, birçok anahtar mekanizmaları hala pek açık değildir. Son zamanlarda, hızla gelişen tek molekül teknikleri ile bazı mekanizmalar ele1,2,3olmuştur.
Protein-DNA etkileşimleri gerçek zamanlı olarak esas olarak görüntülenmesi üzerinde tek molekül floresans mikroskobu uygulanması floresans algılama ve floresan problar gelişimi üzerinde bağlıdır. Bir tek molekül çalışma için beri floresans algılama sistemleri çoğunlukla ticari olarak mevcuttur faiz protein ile uygun bir floresan probe etiketlemek önemlidir.
Floresan Proteinlerin moleküler biyolojide yaygın olarak kullanılır. Ancak, düşük floresan parlaklık ve istikrar photobleaching karşı birçok tek molekül deneyleri kendi uygulamasında kısıtlayın. Kuantum nokta (Qdots) olan küçük ışık yayan nano tanecikleri4. Nedeniyle benzersiz optik özellikleri, Qdots 10 – 20 kat daha parlak ve5birkaç bin kere daha istikrarlı daha yaygın olarak kullanılan organik boya. Ayrıca, Qdots bir büyük Stokes kayması (uyarma ve emisyon doruklarına konumunu arasındaki fark)5var. Niceliksel deneyleri kullanılan olamaz böylece, Qdots uzun süre gözlem (dakika saat) ve yüksek sinyal gürültü oranı, görüntülerle edinimi için kullanılabilir.
Bugüne kadar Qdots bir hedef proteini site-specifically etiketlemek için iki yaklaşım vardır: birincil veya ikincil antikorlar Qdot Birleşik6,7,8; yardımı ile etiketleme ya da güçlü etkileşim arasında biotin streptavidin9,10,11,12,ve13temel hedef protein Qdots ile doğrudan, etiketleme. Streptavidin kaplı Qdots ticari olarak kullanılabilir. Bizim son çalışmada, site-specifically co-overexpression BirA ve AVI öğesini proteinler tarafından biotinylated proteinleri mayası yüksek verimlilik ile saf vivo içinde10. Aşağıda ve tek molekül deneyleri14,15,16,17en iyi duruma getirme, biz tek molekül düzey kullanarak Qdot etiketli proteinler ve DNA arasındaki etkileşimler gözlenen TIRFM10.
Burada, tomurcuklanma seçtiğiniz ilgi bizim protein özellikle tanımak ve bağlama özerk Çoğaltma sırası (ARS), kökeni tanıma karmaşık (ork), Maya. Aşağıdaki iletişim kuralı TIRFM kullanarak Qdot etiketli ORC ARS ile etkileşim görselleştirmenin adım adım bir yordam sunar. Site-specifically değiştirilmiş DNA substrat, DNA biotinylation, coverslip temizlik ve functionalization, akış hücreli montaj ve tek molekül görüntüleme hazırlanması açıklanmıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, Qdot etiketli protein ve TIRFM akışı hücrede kullanarak site-specifically değiştirilmiş λ DNA arasındaki etkileşim gözlemlemek için bir protokol mevcut. Gerekli adımlar DNA substrat, DNA biotinylation, coverslip temizlik ve functionalization, hücre içi akış hazırlama ve tek molekül görüntüleme siteye özgü bir değişiklik içerir. Unutulmamalıdır iki anahtar nokta vardır. Yukarı ve aşağı üst üste pipetting karıştırma kaçınarak ilk olarak, tüm λ DNA ile ilgili adımlar yava?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. Hasan Yardimci teşekkür ediyoruz ve Dr.Sevim Yardimci Francis Crick Enstitüsü tarz için Dr Yujie güneş Pekin Üniversitesi ve Dr Chunlai Chen, Dr. Daniel Duzdevich, Columbia Üniversitesi, Dr Eric C. Greene’in laboratuarından tek molekül denemelerinde yardımcı Tsinghua Üniversitesi yararlı tartışma için. Bu çalışmada, Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı Çin 31371264, 31401059, CAS disiplinler arası yenilik takım ve Newton gelişmiş Bursu (NA140085) Royal Society tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Lambda DNA | New England Biolabs | N3011 | Store 25 μL aliquots at -20 ºC. |
| XhoI enzyme | Thermo Fisher Scientific | FD0694 | |
| Quick-fusion cloning kit | Biotool | B22611 | |
| MaxPlax Lambda Packaging Extracts |
Epicentre | MP5110 | Bacterial strain LE392MP is included in this package. |
| MgSO4 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10013092 | Any brand is acceptable. |
| Tris | Amresco | 0497-5KG | |
| NaCl | Beijing Chemical works | N/A | Any brand is acceptable. |
| MgCl2 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10012818 | |
| Chloroform | Beijing Chemical works | N/A | Any brand is acceptable. |
| NZ-amine | Amresco | J853-250G | |
| Casamino acids | Sigma-Aldrich | 22090-500G | |
| PEG8000 | Beyotime | ST483 | |
| Magnetic stirring apparatus | IKA | KMO2 basic | |
| 15 mL Eppendorf tube | Eppendorf | 30122151 | 15 mL, sterile, bulk, 500pcs |
| Rnase | SIGMA | R4875-100MG | |
| Dnase | SIGMA | D5319-500UG | |
| Proteinase K | Amresco | 0706-100MG | |
| Biotinylated primers | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| T4 DNA ligase, T4 DNA Ligase, Reaction Buffer (10x) | New England Biolabs | M0202 | |
| Coverslip | Thermo Fisher Scientific | 22266882 | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10009259 | |
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | 306568-100G | |
| Acetone | Thermo Fisher Scientific | A949-4 | |
| H2SO4 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80120891 | sulfuric acid |
| H2O2 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10011218 | 30% Hydrogen peroxide |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 322415-2L | |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | V900798 | |
| APTES | Sigma-Aldrich | A3648 | |
| mPEG (methoxy-polyethylene glycol) |
Lysan | mPEG-SVA-5000 | |
| biotin-PEG (biotin-polyethylene glycol) |
Lysan | Biotin-PEG-SVA-5000 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | 31437-500G | |
| Vacuum desiccator | Tianjin Branch Billion Lung Experimental Equipment Co., Ltd. | IPC250-1 | |
| Vacuum sealer | MAGIC SEAL | WP300 | |
| Diamond-tipped glass scribe | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 70036 | |
| Glass slide | Sail Brand | 7101 | |
| Inlet tubing | SCI (Scientific Commodties INC.) | BB31695-PE/2 | inner diameter 0.38 mm; outer diameter 1.09 mm. |
| Outlet tubing | SCI (Scientific Commodties INC.) | BB31695-PE/4 | inner diameter 0.76 mm; outer diameter 1.22 mm. |
| Double-sided tape | Sigma-Aldrich | GBL620001-1EA | |
| Epoxy | LEAFTOP | 9005 | five minutes epoxy |
| Streptavidin | Sigma-Aldrich | S4762 | |
| Fluorescence Microscope | Olympus | IX71 | |
| Infusion/withdrawal programmable pump |
Harvard apparatus | 70-4504 | |
| 532 nm laser | Coherent | Sapphire-532-50 | |
| 640 nm laser | Coherent | OBIS-640-100 | |
| EMCCD Camera | Andor | DU-897E-CS0-BV | |
| W-View Gemini Imaging splitting optics |
Hamamatsu photonics K.K. | A12801-01 | |
| TIRF illumination system | Olympus | IX2-RFAEVA2 | |
| 60×TIRF objective | Olympus | APON60XOTIRF | |
| Quad-edge laser dichroic beamsplitter |
Semrock | Di01-R405/488/ 532/635-25×36 |
|
| Quad-band bandpass filter | Semrock | FF01-446/510/ 581/703-25 |
|
| Dichroic beamsplitter | Semrock | FF649-Di01-25×36 | |
| Emission filter | Chroma Technology Corp | ET585/65m | |
| Emission filter | Chroma Technology Corp | ET665lp | |
| FocalCheck fluorescence, microscope test slide #1 | Thermo Fisher Scientific | F36909 | |
| SYTOX Orange | Thermo Fisher Scientific | S11368 | |
| Qdot705 Streptavidin Conjugate | Thermo Fisher Scientific | Q10163MP | Store at 4 ºC, do not freeze. |
| ATP | Amresco | 0220-25G | Prepare 200 mM ATP solution, using ddH2O, adjust pH to 7.0, and store 10 μL aliquots at -20 ºC. |
| DTT | Amresco | M109-5G | Prepare 1 M solution using ddH2O, and store 10 μl aliquots at -20 ºC. |
References
- Fu, Y. V., et al. Selective Bypass of a Lagging Strand Roadblock by the Eukaryotic Replicative DNA Helicase. Cell. 146 (6), 930-940 (2011).
- Qi, Z., et al. DNA sequence alignment by microhomology sampling during homologous recombination. Cell. 160 (5), 856-869 (2015).
- Chong, S., Chen, C., Ge, H., Xie, X. S. Mechanism of transcriptional bursting in bacteria. Cell. 158 (2), 314-326 (2014).
- Wegner, K. D., Hildebrandt, N. Quantum dots: bright and versatile in vitro and in vivo fluorescence imaging biosensors. Chemical Society Reviews. 44 (14), 4792-4834 (2015).
- Gao, X., et al. In vivo molecular and cellular imaging with quantum dots. Current opinion in biotechnology. 16 (1), 63-72 (2005).
- Sternberg, S. H., Redding, S., Jinek, M., Greene, E. C., Doudna, J. A. DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9. Nature. 507 (7490), 62 (2014).
- Lee, J. Y., Finkelstein, I. J., Arciszewska, L. K., Sherratt, D. J., Greene, E. C. Single-molecule imaging of FtsK translocation reveals mechanistic features of protein-protein collisions on DNA. Molecular cell. 54 (5), 832-843 (2014).
- Wang, H., Tessmer, I., Croteau, D. L., Erie, D. A., Van Houten, B. Functional characterization and atomic force microscopy of a DNA repair protein conjugated to a quantum dot. Nano letters. 8 (6), 1631-1637 (2008).
- Redding, S., et al. Surveillance and processing of foreign DNA by the Escherichia coli CRISPR-Cas system. Cell. 163 (4), 854-865 (2015).
- Xue, H., et al. Utilizing Biotinylated Proteins Expressed in Yeast to Visualize DNA-Protein Interactions at the Single-Molecule Level. Frontiers in microbiology. 8, 2062 (2017).
- Duzdevich, D., et al. The dynamics of eukaryotic replication initiation: origin specificity, licensing, and firing at the single-molecule level. Molecular cell. 58 (3), 483-494 (2015).
- Hughes, C. D., et al. Real-time single-molecule imaging reveals a direct interaction between UvrC and UvrB on DNA tightropes. Nucleic acids research. 41 (9), 4901-4912 (2013).
- Kad, N. M., Wang, H., Kennedy, G. G., Warshaw, D. M., Van Houten, B. Collaborative dynamic DNA scanning by nucleotide excision repair proteins investigated by single-molecule imaging of quantum-dot-labeled proteins. Molecular cell. 37 (5), 702-713 (2010).
- Chandradoss, S. D., et al. Surface Passivation for Single-molecule Protein Studies. Jove-Journal of Visualized Experiments. (86), (2014).
- Chen, X. Q., Zhao, E. S., Fu, Y. V. Using single-molecule approach to visualize the nucleosome assembly in yeast nucleoplasmic extracts. Science Bulletin. 62 (6), 399-404 (2017).
- Yardimci, H., Loveland, A. B., van Oijen, A. M., Walter, J. C. Single-molecule analysis of DNA replication in Xenopus egg extracts. Methods. 57 (2), 179-186 (2012).
- Tanner, N. A., Loparo, J. J., van Oijen, A. M. Visualizing single-molecule DNA replication with fluorescence microscopy. Journal of visualized experiments: JoVE. (32), (2009).
- Lockett, T. J. A bacteriophage λ DNA purification procedure suitable for the analysis of DNA from either large or multiple small lysates. Analytical biochemistry. 185 (2), 230-234 (1990).
- Smith, E. A., Chen, W. How to prevent the loss of surface functionality derived from aminosilanes. Langmuir. 24 (21), 12405-12409 (2008).
- Kim, Y., Torre, A., Leal, A. A., Finkelstein, I. J. Efficient modification of λ-DNA substrates for single-molecule studies. Scientific reports. 7 (1), 2071 (2017).
