Визуализация взаимодействия между Qdot меченых белков и ДНК Site-specifically модифицированных λ на уровне одной молекулы
Summary
Здесь мы представляем протокол для изучения ДНК белковых взаимодействий по микроскопии флуоресцирования полного внутреннего отражения (TIRFM) с помощью site-specifically модифицированных λ субстрат ДНК и точка квантовой надписью белка.
Abstract
Микроскопии флуоресцирования внесла большой вклад в рассекает механизмов сложных биологических процессов на уровне одной молекулы. В одной молекулы анализов для изучения ДНК белковых взаимодействий, есть два важных факторов для рассмотрения: субстрат ДНК с достаточной длины для легко наблюдения и маркировки белок с подходящей флуоресцентного зонда. 48,5 kb ДНК λ является хорошим кандидатом для субстрат ДНК. Квантовые точки (Qdots), как класс флуоресцентных зондов, позволяют долгое время наблюдения (от минут до часов) и получение высокого качества изображения. В этой статье мы представляем протокол для изучения ДНК белковых взаимодействий на уровне одной молекулы, которая включает в себя подготовку site-specifically модифицированных λ ДНК и маркировки целевого белка с покрытием стрептавидина Qdots. Для доказательство концепции мы выбираем ОРК (происхождения признание комплекс) в многообещающий дрожжи как протеин интереса и визуализировать его взаимодействие с ARS (автономно тиражирование последовательность) с помощью TIRFM. По сравнению с другими флуоресцентных зондов, Qdots имеют очевидные преимущества в одной молекулы исследований благодаря своей высокой стабильности против Фотообесцвечивание, однако следует отметить, что это свойство ограничивает его применение в количественных анализов.
Introduction
Взаимодействие между ДНК и белка имеют важное значение для многих сложных биологических процессов, таких как репликация ДНК, репарации ДНК и транскрипции. Хотя традиционные подходы пролили свет на свойства этих процессов, многие ключевые механизмы по-прежнему неясны. Недавно с быстро развивающейся одной молекулы методами, некоторые из механизмов были рассмотрены1,2,3.
Применение одной молекулы флуоресцентной микроскопии на визуализации взаимодействий протеин дна в режиме реального времени главным образом зависит от развития флуоресцентным обнаружением и флуоресцентных зондов. Для изучения одной молекулы важно для обозначения протеина интереса с подходящей флуоресцентного зонда, поскольку флуоресценции обнаружения систем в основном доступны коммерчески.
Флуоресцентные белки обычно используется в молекулярной биологии. Однако низкой яркости люминесцентных и стабильности против Фотообесцвечивание ограничить ее применение в многих анализов одной молекулы. Квантовые точки (Qdots) являются крошечные светоизлучающих наночастиц4. Благодаря их уникальным оптическим свойствам Qdots 10 – 20 раз ярче и несколько тысячу раз более стабильной, чем широко используются органические красители5. Кроме того Qdots имеют большой Стокса сдвига (разница между положением пики возбуждения и выбросов)5. Таким образом Qdots может использоваться для длительного наблюдения (от минут до часов) и получение изображений с высоким соотношением сигнал шум, в то время как они не могут быть использованы в количественных анализов.
На сегодняшний день, существует два подхода к этикетке целевого белка с Qdots site-specifically: маркировка с помощью первичных или вторичных антител, Qdot конъюгированных6,,78; или маркировки целевого белка с Qdots непосредственно, которая основана на сильное взаимодействие между биотина и стрептавидина9,10,11,12,13. Qdots покрытием стрептавидина коммерчески доступны. В нашем недавнем исследовании, site-specifically биотинилированным белков в многообещающий дрожжей с высокой эффективностью были неразделимая co гиперэкспрессия Бира и Avi тегами белков в естественных условиях10. Следующие и оптимизации одной молекулы анализов14,,1516,17мы наблюдали взаимодействия между Qdot меченых белков и ДНК в одной молекулы уровня с помощью TIRFM10.
Здесь, мы выбираем многообещающий дрожжевого происхождения признание комплекс (ОРК), которые могут конкретно признать и привязать к автономно тиражирование последовательности (ARS), как наш протеин интереса. Следующий протокол представляет пошаговую процедуру визуализации взаимодействия Qdot меченых ОРКОВ с ARS с помощью TIRFM. Подготовка site-specifically модифицированных субстрат ДНК, ДНК biotinylation, coverslip очистки и функционализации, поток cell Ассамблеи, и сингл молекула изображений описаны.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы представляем протокол наблюдать взаимодействие между Qdot меченых белков и ДНК site-specifically модифицированных λ, используя TIRFM в ячейку потока. Необходимые меры включают участкам модификации субстрат ДНК, ДНК biotinylation, coverslip очистки и функционализации, подготовка потока клетки, и одн?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим д-р Хасан Йардимчи и Dr.Sevim Йардимчи Фрэнсиса Крика института рода помощь в сингл молекулярных экспериментов, д-р Даниэль Duzdevich из лаборатории д-р Эрик C. Грин Колумбийского университета, доктор Юйцзе солнце Пекинского университета и доктор Чен Чуньлай из Университет Цинхуа для полезного обсуждения. Это исследование было поддержано национальным естественных наук фонд Китая 31371264, 31401059, CAS-междисциплинарная команда инноваций и Ньютон расширенный стипендий (NA140085) из Королевского общества.
Materials
| Lambda DNA | New England Biolabs | N3011 | Store 25 μL aliquots at -20 ºC. |
| XhoI enzyme | Thermo Fisher Scientific | FD0694 | |
| Quick-fusion cloning kit | Biotool | B22611 | |
| MaxPlax Lambda Packaging Extracts |
Epicentre | MP5110 | Bacterial strain LE392MP is included in this package. |
| MgSO4 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10013092 | Any brand is acceptable. |
| Tris | Amresco | 0497-5KG | |
| NaCl | Beijing Chemical works | N/A | Any brand is acceptable. |
| MgCl2 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10012818 | |
| Chloroform | Beijing Chemical works | N/A | Any brand is acceptable. |
| NZ-amine | Amresco | J853-250G | |
| Casamino acids | Sigma-Aldrich | 22090-500G | |
| PEG8000 | Beyotime | ST483 | |
| Magnetic stirring apparatus | IKA | KMO2 basic | |
| 15 mL Eppendorf tube | Eppendorf | 30122151 | 15 mL, sterile, bulk, 500pcs |
| Rnase | SIGMA | R4875-100MG | |
| Dnase | SIGMA | D5319-500UG | |
| Proteinase K | Amresco | 0706-100MG | |
| Biotinylated primers | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| T4 DNA ligase, T4 DNA Ligase, Reaction Buffer (10x) | New England Biolabs | M0202 | |
| Coverslip | Thermo Fisher Scientific | 22266882 | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10009259 | |
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | 306568-100G | |
| Acetone | Thermo Fisher Scientific | A949-4 | |
| H2SO4 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80120891 | sulfuric acid |
| H2O2 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10011218 | 30% Hydrogen peroxide |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 322415-2L | |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | V900798 | |
| APTES | Sigma-Aldrich | A3648 | |
| mPEG (methoxy-polyethylene glycol) |
Lysan | mPEG-SVA-5000 | |
| biotin-PEG (biotin-polyethylene glycol) |
Lysan | Biotin-PEG-SVA-5000 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | 31437-500G | |
| Vacuum desiccator | Tianjin Branch Billion Lung Experimental Equipment Co., Ltd. | IPC250-1 | |
| Vacuum sealer | MAGIC SEAL | WP300 | |
| Diamond-tipped glass scribe | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 70036 | |
| Glass slide | Sail Brand | 7101 | |
| Inlet tubing | SCI (Scientific Commodties INC.) | BB31695-PE/2 | inner diameter 0.38 mm; outer diameter 1.09 mm. |
| Outlet tubing | SCI (Scientific Commodties INC.) | BB31695-PE/4 | inner diameter 0.76 mm; outer diameter 1.22 mm. |
| Double-sided tape | Sigma-Aldrich | GBL620001-1EA | |
| Epoxy | LEAFTOP | 9005 | five minutes epoxy |
| Streptavidin | Sigma-Aldrich | S4762 | |
| Fluorescence Microscope | Olympus | IX71 | |
| Infusion/withdrawal programmable pump |
Harvard apparatus | 70-4504 | |
| 532 nm laser | Coherent | Sapphire-532-50 | |
| 640 nm laser | Coherent | OBIS-640-100 | |
| EMCCD Camera | Andor | DU-897E-CS0-BV | |
| W-View Gemini Imaging splitting optics |
Hamamatsu photonics K.K. | A12801-01 | |
| TIRF illumination system | Olympus | IX2-RFAEVA2 | |
| 60×TIRF objective | Olympus | APON60XOTIRF | |
| Quad-edge laser dichroic beamsplitter |
Semrock | Di01-R405/488/ 532/635-25×36 |
|
| Quad-band bandpass filter | Semrock | FF01-446/510/ 581/703-25 |
|
| Dichroic beamsplitter | Semrock | FF649-Di01-25×36 | |
| Emission filter | Chroma Technology Corp | ET585/65m | |
| Emission filter | Chroma Technology Corp | ET665lp | |
| FocalCheck fluorescence, microscope test slide #1 | Thermo Fisher Scientific | F36909 | |
| SYTOX Orange | Thermo Fisher Scientific | S11368 | |
| Qdot705 Streptavidin Conjugate | Thermo Fisher Scientific | Q10163MP | Store at 4 ºC, do not freeze. |
| ATP | Amresco | 0220-25G | Prepare 200 mM ATP solution, using ddH2O, adjust pH to 7.0, and store 10 μL aliquots at -20 ºC. |
| DTT | Amresco | M109-5G | Prepare 1 M solution using ddH2O, and store 10 μl aliquots at -20 ºC. |
References
- Fu, Y. V., et al. Selective Bypass of a Lagging Strand Roadblock by the Eukaryotic Replicative DNA Helicase. Cell. 146 (6), 930-940 (2011).
- Qi, Z., et al. DNA sequence alignment by microhomology sampling during homologous recombination. Cell. 160 (5), 856-869 (2015).
- Chong, S., Chen, C., Ge, H., Xie, X. S. Mechanism of transcriptional bursting in bacteria. Cell. 158 (2), 314-326 (2014).
- Wegner, K. D., Hildebrandt, N. Quantum dots: bright and versatile in vitro and in vivo fluorescence imaging biosensors. Chemical Society Reviews. 44 (14), 4792-4834 (2015).
- Gao, X., et al. In vivo molecular and cellular imaging with quantum dots. Current opinion in biotechnology. 16 (1), 63-72 (2005).
- Sternberg, S. H., Redding, S., Jinek, M., Greene, E. C., Doudna, J. A. DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9. Nature. 507 (7490), 62 (2014).
- Lee, J. Y., Finkelstein, I. J., Arciszewska, L. K., Sherratt, D. J., Greene, E. C. Single-molecule imaging of FtsK translocation reveals mechanistic features of protein-protein collisions on DNA. Molecular cell. 54 (5), 832-843 (2014).
- Wang, H., Tessmer, I., Croteau, D. L., Erie, D. A., Van Houten, B. Functional characterization and atomic force microscopy of a DNA repair protein conjugated to a quantum dot. Nano letters. 8 (6), 1631-1637 (2008).
- Redding, S., et al. Surveillance and processing of foreign DNA by the Escherichia coli CRISPR-Cas system. Cell. 163 (4), 854-865 (2015).
- Xue, H., et al. Utilizing Biotinylated Proteins Expressed in Yeast to Visualize DNA-Protein Interactions at the Single-Molecule Level. Frontiers in microbiology. 8, 2062 (2017).
- Duzdevich, D., et al. The dynamics of eukaryotic replication initiation: origin specificity, licensing, and firing at the single-molecule level. Molecular cell. 58 (3), 483-494 (2015).
- Hughes, C. D., et al. Real-time single-molecule imaging reveals a direct interaction between UvrC and UvrB on DNA tightropes. Nucleic acids research. 41 (9), 4901-4912 (2013).
- Kad, N. M., Wang, H., Kennedy, G. G., Warshaw, D. M., Van Houten, B. Collaborative dynamic DNA scanning by nucleotide excision repair proteins investigated by single-molecule imaging of quantum-dot-labeled proteins. Molecular cell. 37 (5), 702-713 (2010).
- Chandradoss, S. D., et al. Surface Passivation for Single-molecule Protein Studies. Jove-Journal of Visualized Experiments. (86), (2014).
- Chen, X. Q., Zhao, E. S., Fu, Y. V. Using single-molecule approach to visualize the nucleosome assembly in yeast nucleoplasmic extracts. Science Bulletin. 62 (6), 399-404 (2017).
- Yardimci, H., Loveland, A. B., van Oijen, A. M., Walter, J. C. Single-molecule analysis of DNA replication in Xenopus egg extracts. Methods. 57 (2), 179-186 (2012).
- Tanner, N. A., Loparo, J. J., van Oijen, A. M. Visualizing single-molecule DNA replication with fluorescence microscopy. Journal of visualized experiments: JoVE. (32), (2009).
- Lockett, T. J. A bacteriophage λ DNA purification procedure suitable for the analysis of DNA from either large or multiple small lysates. Analytical biochemistry. 185 (2), 230-234 (1990).
- Smith, E. A., Chen, W. How to prevent the loss of surface functionality derived from aminosilanes. Langmuir. 24 (21), 12405-12409 (2008).
- Kim, Y., Torre, A., Leal, A. A., Finkelstein, I. J. Efficient modification of λ-DNA substrates for single-molecule studies. Scientific reports. 7 (1), 2071 (2017).
