Здесь мы представляем протокол для изучения ДНК белковых взаимодействий по микроскопии флуоресцирования полного внутреннего отражения (TIRFM) с помощью site-specifically модифицированных λ субстрат ДНК и точка квантовой надписью белка.
Микроскопии флуоресцирования внесла большой вклад в рассекает механизмов сложных биологических процессов на уровне одной молекулы. В одной молекулы анализов для изучения ДНК белковых взаимодействий, есть два важных факторов для рассмотрения: субстрат ДНК с достаточной длины для легко наблюдения и маркировки белок с подходящей флуоресцентного зонда. 48,5 kb ДНК λ является хорошим кандидатом для субстрат ДНК. Квантовые точки (Qdots), как класс флуоресцентных зондов, позволяют долгое время наблюдения (от минут до часов) и получение высокого качества изображения. В этой статье мы представляем протокол для изучения ДНК белковых взаимодействий на уровне одной молекулы, которая включает в себя подготовку site-specifically модифицированных λ ДНК и маркировки целевого белка с покрытием стрептавидина Qdots. Для доказательство концепции мы выбираем ОРК (происхождения признание комплекс) в многообещающий дрожжи как протеин интереса и визуализировать его взаимодействие с ARS (автономно тиражирование последовательность) с помощью TIRFM. По сравнению с другими флуоресцентных зондов, Qdots имеют очевидные преимущества в одной молекулы исследований благодаря своей высокой стабильности против Фотообесцвечивание, однако следует отметить, что это свойство ограничивает его применение в количественных анализов.
Взаимодействие между ДНК и белка имеют важное значение для многих сложных биологических процессов, таких как репликация ДНК, репарации ДНК и транскрипции. Хотя традиционные подходы пролили свет на свойства этих процессов, многие ключевые механизмы по-прежнему неясны. Недавно с быстро развивающейся одной молекулы методами, некоторые из механизмов были рассмотрены1,2,3.
Применение одной молекулы флуоресцентной микроскопии на визуализации взаимодействий протеин дна в режиме реального времени главным образом зависит от развития флуоресцентным обнаружением и флуоресцентных зондов. Для изучения одной молекулы важно для обозначения протеина интереса с подходящей флуоресцентного зонда, поскольку флуоресценции обнаружения систем в основном доступны коммерчески.
Флуоресцентные белки обычно используется в молекулярной биологии. Однако низкой яркости люминесцентных и стабильности против Фотообесцвечивание ограничить ее применение в многих анализов одной молекулы. Квантовые точки (Qdots) являются крошечные светоизлучающих наночастиц4. Благодаря их уникальным оптическим свойствам Qdots 10 – 20 раз ярче и несколько тысячу раз более стабильной, чем широко используются органические красители5. Кроме того Qdots имеют большой Стокса сдвига (разница между положением пики возбуждения и выбросов)5. Таким образом Qdots может использоваться для длительного наблюдения (от минут до часов) и получение изображений с высоким соотношением сигнал шум, в то время как они не могут быть использованы в количественных анализов.
На сегодняшний день, существует два подхода к этикетке целевого белка с Qdots site-specifically: маркировка с помощью первичных или вторичных антител, Qdot конъюгированных6,,78; или маркировки целевого белка с Qdots непосредственно, которая основана на сильное взаимодействие между биотина и стрептавидина9,10,11,12,13. Qdots покрытием стрептавидина коммерчески доступны. В нашем недавнем исследовании, site-specifically биотинилированным белков в многообещающий дрожжей с высокой эффективностью были неразделимая co гиперэкспрессия Бира и Avi тегами белков в естественных условиях10. Следующие и оптимизации одной молекулы анализов14,,1516,17мы наблюдали взаимодействия между Qdot меченых белков и ДНК в одной молекулы уровня с помощью TIRFM10.
Здесь, мы выбираем многообещающий дрожжевого происхождения признание комплекс (ОРК), которые могут конкретно признать и привязать к автономно тиражирование последовательности (ARS), как наш протеин интереса. Следующий протокол представляет пошаговую процедуру визуализации взаимодействия Qdot меченых ОРКОВ с ARS с помощью TIRFM. Подготовка site-specifically модифицированных субстрат ДНК, ДНК biotinylation, coverslip очистки и функционализации, поток cell Ассамблеи, и сингл молекула изображений описаны.
Здесь мы представляем протокол наблюдать взаимодействие между Qdot меченых белков и ДНК site-specifically модифицированных λ, используя TIRFM в ячейку потока. Необходимые меры включают участкам модификации субстрат ДНК, ДНК biotinylation, coverslip очистки и функционализации, подготовка потока клетки, и одн?…
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим д-р Хасан Йардимчи и Dr.Sevim Йардимчи Фрэнсиса Крика института рода помощь в сингл молекулярных экспериментов, д-р Даниэль Duzdevich из лаборатории д-р Эрик C. Грин Колумбийского университета, доктор Юйцзе солнце Пекинского университета и доктор Чен Чуньлай из Университет Цинхуа для полезного обсуждения. Это исследование было поддержано национальным естественных наук фонд Китая 31371264, 31401059, CAS-междисциплинарная команда инноваций и Ньютон расширенный стипендий (NA140085) из Королевского общества.
Lambda DNA | New England Biolabs | N3011 | Store 25 μL aliquots at -20 ºC. |
XhoI enzyme | Thermo Fisher Scientific | FD0694 | |
Quick-fusion cloning kit | Biotool | B22611 | |
MaxPlax Lambda Packaging Extracts |
Epicentre | MP5110 | Bacterial strain LE392MP is included in this package. |
MgSO4 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10013092 | Any brand is acceptable. |
Tris | Amresco | 0497-5KG | |
NaCl | Beijing Chemical works | N/A | Any brand is acceptable. |
MgCl2 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10012818 | |
Chloroform | Beijing Chemical works | N/A | Any brand is acceptable. |
NZ-amine | Amresco | J853-250G | |
Casamino acids | Sigma-Aldrich | 22090-500G | |
PEG8000 | Beyotime | ST483 | |
Magnetic stirring apparatus | IKA | KMO2 basic | |
15 mL Eppendorf tube | Eppendorf | 30122151 | 15 mL, sterile, bulk, 500pcs |
Rnase | SIGMA | R4875-100MG | |
Dnase | SIGMA | D5319-500UG | |
Proteinase K | Amresco | 0706-100MG | |
Biotinylated primers | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
T4 DNA ligase, T4 DNA Ligase, Reaction Buffer (10x) | New England Biolabs | M0202 | |
Coverslip | Thermo Fisher Scientific | 22266882 | |
Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10009259 | |
Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | 306568-100G | |
Acetone | Thermo Fisher Scientific | A949-4 | |
H2SO4 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80120891 | sulfuric acid |
H2O2 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10011218 | 30% Hydrogen peroxide |
Methanol | Sigma-Aldrich | 322415-2L | |
Acetic acid | Sigma-Aldrich | V900798 | |
APTES | Sigma-Aldrich | A3648 | |
mPEG (methoxy-polyethylene glycol) |
Lysan | mPEG-SVA-5000 | |
biotin-PEG (biotin-polyethylene glycol) |
Lysan | Biotin-PEG-SVA-5000 | |
NaHCO3 | Sigma-Aldrich | 31437-500G | |
Vacuum desiccator | Tianjin Branch Billion Lung Experimental Equipment Co., Ltd. | IPC250-1 | |
Vacuum sealer | MAGIC SEAL | WP300 | |
Diamond-tipped glass scribe | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 70036 | |
Glass slide | Sail Brand | 7101 | |
Inlet tubing | SCI (Scientific Commodties INC.) | BB31695-PE/2 | inner diameter 0.38 mm; outer diameter 1.09 mm. |
Outlet tubing | SCI (Scientific Commodties INC.) | BB31695-PE/4 | inner diameter 0.76 mm; outer diameter 1.22 mm. |
Double-sided tape | Sigma-Aldrich | GBL620001-1EA | |
Epoxy | LEAFTOP | 9005 | five minutes epoxy |
Streptavidin | Sigma-Aldrich | S4762 | |
Fluorescence Microscope | Olympus | IX71 | |
Infusion/withdrawal programmable pump |
Harvard apparatus | 70-4504 | |
532 nm laser | Coherent | Sapphire-532-50 | |
640 nm laser | Coherent | OBIS-640-100 | |
EMCCD Camera | Andor | DU-897E-CS0-BV | |
W-View Gemini Imaging splitting optics |
Hamamatsu photonics K.K. | A12801-01 | |
TIRF illumination system | Olympus | IX2-RFAEVA2 | |
60×TIRF objective | Olympus | APON60XOTIRF | |
Quad-edge laser dichroic beamsplitter |
Semrock | Di01-R405/488/ 532/635-25×36 |
|
Quad-band bandpass filter | Semrock | FF01-446/510/ 581/703-25 |
|
Dichroic beamsplitter | Semrock | FF649-Di01-25×36 | |
Emission filter | Chroma Technology Corp | ET585/65m | |
Emission filter | Chroma Technology Corp | ET665lp | |
FocalCheck fluorescence, microscope test slide #1 | Thermo Fisher Scientific | F36909 | |
SYTOX Orange | Thermo Fisher Scientific | S11368 | |
Qdot705 Streptavidin Conjugate | Thermo Fisher Scientific | Q10163MP | Store at 4 ºC, do not freeze. |
ATP | Amresco | 0220-25G | Prepare 200 mM ATP solution, using ddH2O, adjust pH to 7.0, and store 10 μL aliquots at -20 ºC. |
DTT | Amresco | M109-5G | Prepare 1 M solution using ddH2O, and store 10 μl aliquots at -20 ºC. |