した Qdot 標識タンパク質と Site-specifically 変更された λ DNA の単一分子レベルでの相互作用の可視化
Summary
ここでは、site-specifically 変更された λ DNA 基板とタンパク質をラベル量子ドットを用いた全反射蛍光顕微鏡 (TIRFM) による DNA 蛋白質の相互作用を研究するためのプロトコルを提案する.
Abstract
蛍光顕微鏡は、単一分子レベルでの複雑な生物学的過程のメカニズムを解剖に多大な貢献をしました。単一分子アッセイ DNA 蛋白質の相互作用を研究するため、検討のための 2 つの重要な要因がある: 十分な長さの簡単な観察と適切な蛍光プローブを用いたタンパク質を標識 DNA 基板。48.5 kb λ DNA は DNA の基質の良い候補です。量子ドット (Qdots)、蛍光プローブのクラスとして長年観察 (時間分) と高品質画像の取得を許可します。Site-specifically 変更された λ DNA を準備して、ラベリング、ストレプトアビジン コーティング Qdots と標的タンパク質など分子レベルで DNA 蛋白質の相互作用を研究するためのプロトコルを提案します。コンセプトの証明、我々 興味の蛋白質として出芽酵母におけるオーク (原点認識複合体) を選択し、観察を使用して、アルス (自律的複製シーケンス) との相互作用を視覚化します。他の蛍光プローブと比較して、Qdots は退色、に対して高い安定性のための単一分子の研究で明白な利点を持っているが、定量的アッセイへの応用をこのプロパティに制限に注意してください。
Introduction
タンパク質と DNA の相互作用は、DNA 複製、DNA 修復および転写など、多くの複雑な生物学的プロセスに不可欠です。従来のアプローチは、これらのプロセスのプロパティに光を当てるが、多くの主なメカニズムはまだ明らかではありません。最近では、急速に成長の単一分子技術メカニズムのいくつかは対処1,2,3をされています。
主にリアルタイムで蛋白質 DNA 相互作用の視覚化の単一分子蛍光顕微鏡の応用は、蛍光検出蛍光プローブの開発に依存します。単一分子研究のため適切な蛍光プローブ蛍光検出システム、ほとんど商業的に利用可能なので興味の蛋白質にラベルすることが重要です。
蛍光タンパク質は、分子生物学の一般的使用されます。ただし、低蛍光輝度とフォトブリーチングに対する安定性は、多くの単一分子アッセイへの応用を制限します。量子ドット (Qdots) は、小さな発光ナノ粒子4。彼らのユニークな光学特性のため Qdots は 10-20 倍明るく、数千倍より安定したよりも広く使われている有機染料5。さらに、Qdots は大きなストークス シフト (励起と放射のピークの位置差)5にあります。したがって、彼らは定量的アッセイに利用することはできませんしながら Qdots を長年観察 (時間分) の高い信号対雑音比を持つ画像の取得使用できます。
日には、site-specifically Qdots と標的タンパク質をラベルに 2 つのアプローチがある: ラベリングした Qdot 共役のプライマリまたはセカンダリ抗体6,7,8; の助けを借りてやラベル、ターゲット蛋白質 Qdots と直接、ビオチンとストレプトアビジン9,10、11,12,13間の強い相互作用に基づいています。ストレプトアビジン コーティング Qdots 市販されています。最近の研究では、site-specifically 高効率で出芽酵母のビオチン化タンパク質により精製された・ ビラと avi ファイルのタグ付きタンパク質の過剰発現の co体内10。次一分子アッセイ14,15,16,17を最適化することで我々 は単一分子のレベルを使用した Qdot 標識タンパク質と DNA の相互作用を観察観察10。
ここで、我々 は出芽を選択興味の私達の蛋白質として原点認識複合体 (オーク) を具体的に認識して自律的に複製シーケンス (ARS) バインドできますの酵母。次のプロトコルは、観察を使用してアルスした Qdot というラベルの付いたオークの相互作用を視覚化するステップバイ ステップの手順を示します。Site-specifically 変更された DNA の基質、DNA ビオチン化、coverslip のクリーニングし機能化、フロー セル ・ アセンブリおよび単一分子イメージングの準備を説明します。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、した Qdot 標識タンパク質およびフロー セル内の観察を使用して site-specifically 変更された λ DNA 間の相互作用を観察するためのプロトコルを提案する.必要な手順には DNA 基板、ビオチン化 DNA、coverslip 洗浄し高機能化、フロー セル準備、および単一分子イメージング サイト固有の変更が含まれます。注意すべき 2 つの重要なポイントがあります。まず、すべての λ DNA と手順は、<em…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々 は博士・ ハサン ・ Yardimci に感謝し、種類のフランシスの Crick 研究所の Dr.Sevim Yardimci は、単一分子の実験博士ダニエル Duzdevich、コロンビア大学の博士エリック ・ グリーンの研究室から北京大学の博士タマ太陽との Chunlai ドクター有用な議論の清華大学。本研究は、国家自然科学基金、中国の 31371264、31401059、CA 学際的革新チームと、ニュートン高度な交わり (NA140085) 英国王立協会からによって支えられました。
Materials
| Lambda DNA | New England Biolabs | N3011 | Store 25 μL aliquots at -20 ºC. |
| XhoI enzyme | Thermo Fisher Scientific | FD0694 | |
| Quick-fusion cloning kit | Biotool | B22611 | |
| MaxPlax Lambda Packaging Extracts |
Epicentre | MP5110 | Bacterial strain LE392MP is included in this package. |
| MgSO4 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10013092 | Any brand is acceptable. |
| Tris | Amresco | 0497-5KG | |
| NaCl | Beijing Chemical works | N/A | Any brand is acceptable. |
| MgCl2 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10012818 | |
| Chloroform | Beijing Chemical works | N/A | Any brand is acceptable. |
| NZ-amine | Amresco | J853-250G | |
| Casamino acids | Sigma-Aldrich | 22090-500G | |
| PEG8000 | Beyotime | ST483 | |
| Magnetic stirring apparatus | IKA | KMO2 basic | |
| 15 mL Eppendorf tube | Eppendorf | 30122151 | 15 mL, sterile, bulk, 500pcs |
| Rnase | SIGMA | R4875-100MG | |
| Dnase | SIGMA | D5319-500UG | |
| Proteinase K | Amresco | 0706-100MG | |
| Biotinylated primers | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| T4 DNA ligase, T4 DNA Ligase, Reaction Buffer (10x) | New England Biolabs | M0202 | |
| Coverslip | Thermo Fisher Scientific | 22266882 | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10009259 | |
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | 306568-100G | |
| Acetone | Thermo Fisher Scientific | A949-4 | |
| H2SO4 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80120891 | sulfuric acid |
| H2O2 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10011218 | 30% Hydrogen peroxide |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 322415-2L | |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | V900798 | |
| APTES | Sigma-Aldrich | A3648 | |
| mPEG (methoxy-polyethylene glycol) |
Lysan | mPEG-SVA-5000 | |
| biotin-PEG (biotin-polyethylene glycol) |
Lysan | Biotin-PEG-SVA-5000 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | 31437-500G | |
| Vacuum desiccator | Tianjin Branch Billion Lung Experimental Equipment Co., Ltd. | IPC250-1 | |
| Vacuum sealer | MAGIC SEAL | WP300 | |
| Diamond-tipped glass scribe | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 70036 | |
| Glass slide | Sail Brand | 7101 | |
| Inlet tubing | SCI (Scientific Commodties INC.) | BB31695-PE/2 | inner diameter 0.38 mm; outer diameter 1.09 mm. |
| Outlet tubing | SCI (Scientific Commodties INC.) | BB31695-PE/4 | inner diameter 0.76 mm; outer diameter 1.22 mm. |
| Double-sided tape | Sigma-Aldrich | GBL620001-1EA | |
| Epoxy | LEAFTOP | 9005 | five minutes epoxy |
| Streptavidin | Sigma-Aldrich | S4762 | |
| Fluorescence Microscope | Olympus | IX71 | |
| Infusion/withdrawal programmable pump |
Harvard apparatus | 70-4504 | |
| 532 nm laser | Coherent | Sapphire-532-50 | |
| 640 nm laser | Coherent | OBIS-640-100 | |
| EMCCD Camera | Andor | DU-897E-CS0-BV | |
| W-View Gemini Imaging splitting optics |
Hamamatsu photonics K.K. | A12801-01 | |
| TIRF illumination system | Olympus | IX2-RFAEVA2 | |
| 60×TIRF objective | Olympus | APON60XOTIRF | |
| Quad-edge laser dichroic beamsplitter |
Semrock | Di01-R405/488/ 532/635-25×36 |
|
| Quad-band bandpass filter | Semrock | FF01-446/510/ 581/703-25 |
|
| Dichroic beamsplitter | Semrock | FF649-Di01-25×36 | |
| Emission filter | Chroma Technology Corp | ET585/65m | |
| Emission filter | Chroma Technology Corp | ET665lp | |
| FocalCheck fluorescence, microscope test slide #1 | Thermo Fisher Scientific | F36909 | |
| SYTOX Orange | Thermo Fisher Scientific | S11368 | |
| Qdot705 Streptavidin Conjugate | Thermo Fisher Scientific | Q10163MP | Store at 4 ºC, do not freeze. |
| ATP | Amresco | 0220-25G | Prepare 200 mM ATP solution, using ddH2O, adjust pH to 7.0, and store 10 μL aliquots at -20 ºC. |
| DTT | Amresco | M109-5G | Prepare 1 M solution using ddH2O, and store 10 μl aliquots at -20 ºC. |
References
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