Visualizar la interacción entre la proteína marcada Qdot y λ Site-specifically modificada de ADN en el nivel de molécula única
Summary
Aquí, presentamos un protocolo de estudio de las interacciones DNA-proteína por microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRFM) utilizando un sustrato de ADN λ site-specifically modificado y un etiquetado proteína del punto cuántico.
Abstract
La microscopía de fluorescencia ha hecho grandes contribuciones en la disección de los mecanismos de los procesos biológicos complejos en el plano de la molécula sola. En los ensayos de molécula única para el estudio de las interacciones DNA proteína, hay dos factores importantes para su consideración: el sustrato de ADN con suficiente longitud para la observación fácil y etiquetado una proteína con una sonda fluorescente adecuada. 48,5 kb λ DNA es un buen candidato para el sustrato de la ADN. Puntos cuánticos (Qdots), como una clase de sondas fluorescentes, permiten la observación de largo plazo (de minutos a horas) y adquisición de imágenes de alta calidad. En este trabajo, presentamos un protocolo de estudio de las interacciones DNA-proteína a nivel de una sola molécula, que incluye preparar un site-specifically modificado λ DNA y etiquetado una proteína diana con Qdots recubiertas de estreptavidina. Para una prueba de concepto, elegir ORC (reconocimiento de origen complejo) en levadura de florecimiento como una proteína de interés y visualizar su interacción con un ARS (secuencia de replicación Autónoma) usando TIRFM. En comparación con otras sondas fluorescentes, Qdots tienen ventajas obvias en los estudios de molécula única debido a su alta estabilidad contra el fotoblanqueo, pero cabe señalar que esta propiedad limita su aplicación en ensayos cuantitativos.
Introduction
Las interacciones entre proteínas y ADN son esenciales para muchos procesos biológicos complejos, como la replicación del DNA, la reparación del ADN y la transcripción. Aunque los enfoques convencionales han arrojado luz sobre las propiedades de estos procesos, muchos de los mecanismos claves aún no están claros. Recientemente, con el rápido desarrollo técnicas sola molécula, algunos de los mecanismos han sido accedido1,2,3.
La aplicación de la microscopia de la fluorescencia de una sola molécula en visualizar las interacciones DNA proteína en tiempo real sobre todo depende del desarrollo de la detección de fluorescencia y sondas fluorescentes. Para el estudio de una sola molécula, es importante identificar la proteína de interés con una sonda fluorescente adecuada desde sistemas de detección de fluorescencia sobre todo están disponibles comercialmente.
Proteínas fluorescentes se utilizan en biología molecular. Sin embargo, el bajo brillo fluorescente y estabilidad contra el fotoblanqueo restringen su aplicación en muchos análisis a la sola molécula. Puntos cuánticos (Qdots) son pequeños emisores de luz nanopartículas4. Debido a sus propiedades ópticas únicas, Qdots son 10 – 20 veces más brillantes y varios miles de veces más estable que el ampliamente utilizado orgánicos colorantes5. Por otra parte, Qdots tienen un gran Stokes shift (la diferencia entre la posición de los picos de excitación y emisión)5. Así, Qdots puede utilizarse para la observación desde hace mucho tiempo (minutos a horas) y adquisición de imágenes con altos cocientes signal-to-noise, mientras que no pueden ser utilizados en los ensayos cuantitativos.
Hasta la fecha, existen dos enfoques para identificar una proteína diana con Qdots site-specifically: etiquetado con la ayuda de anticuerpos primarios o secundarios conjugados Qdot6,7,8; o etiquetado la proteína diana con Qdots directamente, que se basa en la fuerte interacción entre biotina y estreptavidina9,10,11,12,13. Recubiertas de estreptavidina Qdots están comercialmente disponibles. En nuestro reciente estudio, site-specifically proteínas biotinilado en levadura de florecimiento con la eficacia alta se purificaron por co-sobreexpresión de BirA y proteínas etiquetadas Avi en vivo10. Siguiente y optimización de los ensayos de una sola molécula14,15,16,17, observamos las interacciones entre etiquetado Qdot proteínas y DNA en la sola molécula nivel utilizando TIRFM10.
Aquí, elegimos el florecimiento levadura origen reconocimiento complejo (ORC), que específicamente puede reconocer y unirse a la secuencia de replicación autónoma (ARS), como la proteína de interés. El siguiente protocolo presenta un procedimiento paso a paso de visualizar la interacción de ORC Qdot etiquetados con ARS usando TIRFM. Se describen la preparación del sustrato de ADN site-specifically modificado, la Biotinilación de ADN, la limpieza de cubreobjetos y funcionalización, el montaje de celda de flujo y la proyección de imagen de una sola molécula.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí, presentamos un protocolo para observar la interacción entre la proteína marcada Qdot y el ADN λ site-specifically modificado utilizando el TIRFM en una celda de flujo. Las medidas incluyen la modificación específica de sustrato de ADN, ADN biotinylation, cubreobjetos limpieza y funcionalización, celda de flujo la preparación y proyección de imagen de una sola molécula. Hay dos puntos clave que deben tenerse. En primer lugar, todos los pasos involucrados con λ DNA deben manipularse con cuidado para reduci…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos al Dr. Hasan Yardimci y Dr.Sevim Yardimci del Instituto Francis Crick de tipo ayuda en los experimentos de una sola molécula, Dr. Daniel Duzdevich del laboratorio del Dr. Eric C. Greene de la Universidad de Columbia, Dr. Yujie Sun de la Universidad de Pekín y Dr. Chunlai Chen de La Universidad de Tsinghua de discusión útil. Este estudio fue apoyado por la nacional Ciencias naturales Fundación de China 31371264, 31401059, equipo de innovación interdisciplinar del CAS y la Newton avanzado beca (NA140085) de la Real Sociedad.
Materials
| Lambda DNA | New England Biolabs | N3011 | Store 25 μL aliquots at -20 ºC. |
| XhoI enzyme | Thermo Fisher Scientific | FD0694 | |
| Quick-fusion cloning kit | Biotool | B22611 | |
| MaxPlax Lambda Packaging Extracts |
Epicentre | MP5110 | Bacterial strain LE392MP is included in this package. |
| MgSO4 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10013092 | Any brand is acceptable. |
| Tris | Amresco | 0497-5KG | |
| NaCl | Beijing Chemical works | N/A | Any brand is acceptable. |
| MgCl2 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10012818 | |
| Chloroform | Beijing Chemical works | N/A | Any brand is acceptable. |
| NZ-amine | Amresco | J853-250G | |
| Casamino acids | Sigma-Aldrich | 22090-500G | |
| PEG8000 | Beyotime | ST483 | |
| Magnetic stirring apparatus | IKA | KMO2 basic | |
| 15 mL Eppendorf tube | Eppendorf | 30122151 | 15 mL, sterile, bulk, 500pcs |
| Rnase | SIGMA | R4875-100MG | |
| Dnase | SIGMA | D5319-500UG | |
| Proteinase K | Amresco | 0706-100MG | |
| Biotinylated primers | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| T4 DNA ligase, T4 DNA Ligase, Reaction Buffer (10x) | New England Biolabs | M0202 | |
| Coverslip | Thermo Fisher Scientific | 22266882 | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10009259 | |
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | 306568-100G | |
| Acetone | Thermo Fisher Scientific | A949-4 | |
| H2SO4 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 80120891 | sulfuric acid |
| H2O2 | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10011218 | 30% Hydrogen peroxide |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 322415-2L | |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | V900798 | |
| APTES | Sigma-Aldrich | A3648 | |
| mPEG (methoxy-polyethylene glycol) |
Lysan | mPEG-SVA-5000 | |
| biotin-PEG (biotin-polyethylene glycol) |
Lysan | Biotin-PEG-SVA-5000 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | 31437-500G | |
| Vacuum desiccator | Tianjin Branch Billion Lung Experimental Equipment Co., Ltd. | IPC250-1 | |
| Vacuum sealer | MAGIC SEAL | WP300 | |
| Diamond-tipped glass scribe | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 70036 | |
| Glass slide | Sail Brand | 7101 | |
| Inlet tubing | SCI (Scientific Commodties INC.) | BB31695-PE/2 | inner diameter 0.38 mm; outer diameter 1.09 mm. |
| Outlet tubing | SCI (Scientific Commodties INC.) | BB31695-PE/4 | inner diameter 0.76 mm; outer diameter 1.22 mm. |
| Double-sided tape | Sigma-Aldrich | GBL620001-1EA | |
| Epoxy | LEAFTOP | 9005 | five minutes epoxy |
| Streptavidin | Sigma-Aldrich | S4762 | |
| Fluorescence Microscope | Olympus | IX71 | |
| Infusion/withdrawal programmable pump |
Harvard apparatus | 70-4504 | |
| 532 nm laser | Coherent | Sapphire-532-50 | |
| 640 nm laser | Coherent | OBIS-640-100 | |
| EMCCD Camera | Andor | DU-897E-CS0-BV | |
| W-View Gemini Imaging splitting optics |
Hamamatsu photonics K.K. | A12801-01 | |
| TIRF illumination system | Olympus | IX2-RFAEVA2 | |
| 60×TIRF objective | Olympus | APON60XOTIRF | |
| Quad-edge laser dichroic beamsplitter |
Semrock | Di01-R405/488/ 532/635-25×36 |
|
| Quad-band bandpass filter | Semrock | FF01-446/510/ 581/703-25 |
|
| Dichroic beamsplitter | Semrock | FF649-Di01-25×36 | |
| Emission filter | Chroma Technology Corp | ET585/65m | |
| Emission filter | Chroma Technology Corp | ET665lp | |
| FocalCheck fluorescence, microscope test slide #1 | Thermo Fisher Scientific | F36909 | |
| SYTOX Orange | Thermo Fisher Scientific | S11368 | |
| Qdot705 Streptavidin Conjugate | Thermo Fisher Scientific | Q10163MP | Store at 4 ºC, do not freeze. |
| ATP | Amresco | 0220-25G | Prepare 200 mM ATP solution, using ddH2O, adjust pH to 7.0, and store 10 μL aliquots at -20 ºC. |
| DTT | Amresco | M109-5G | Prepare 1 M solution using ddH2O, and store 10 μl aliquots at -20 ºC. |
References
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