Здесь представлен протокол расследовать раннего воздействия амилоид β (значения) в головном мозге. Это показывает, что значения индуцирует Клатрин опосредованный эндоцитоз и распада аксональное роста шишки. Протокол является полезным при изучении раннего воздействия значения на конусы роста axonal и может способствовать предотвращению болезни Альцгеймера.
Амилоид β (значения) вызывает расстройства памяти в Альцгеймера (AD). Хотя терапии было показано, уменьшить значения уровней в мозгах пациентов AD, они не улучшают функции памяти. Поскольку значения агрегатов в головном мозге до появления нарушениями памяти, ориентации значения может быть неэффективным для лечения больных ад, которые уже проявляют дефицита памяти. Таким образом ниже по течению сигналов из-за значения осаждения должен быть заблокирован до развития AD. Значения индуцирует аксональной дегенерации, ведущие к срыву нейрональных сетей и нарушениями памяти. Хотя существует множество исследований о механизмах значения токсичности, источник значения токсичности остается неизвестным. Чтобы помочь определить источник, мы предлагаем новый протокол, использующий микроскопии, Гене transfection и живой клетки, imaging для исследовать ранние изменения, вызванные значения в конусы роста axonal культивировали нейронов. Этот протокол показало, что значения индуцированной Клатрин опосредованный эндоцитоз в аксональное роста шишки следуют краха конус роста, демонстрируя, что ингибирование эндоцитоза предотвращает значения токсичности. Этот протокол будет полезным при изучении ранних эффектов значения и может привести к более эффективной и профилактическое лечение AD.
Амилоид β (значения) месторождений находятся в мозге пациентов с болезнью Альцгеймера (AD) и считаются критическим причиной AD1 , нарушить нейрональных сетей, приводит к памяти нарушениями2,,34. Многие клинические наркотиков кандидатов было показано эффективно предотвращать производство амилоид β (значения) или удалить значения месторождений. Однако никто не преуспели в улучшение функции памяти в AD пациентов5. Значения уже сдали на хранение в головном мозге до начала расстройства памяти6; Таким образом уменьшение значения уровней в мозгах пациентов выставке нарушениями памяти могут оказаться неэффективными. Значения осаждения присутствует в доклинической AD больных; Однако эти пациенты редко представляют с нейронной дегенерации и памяти дефицита6. Существует временной лаг между значения осаждения и нарушениями памяти. Таким образом критически важной стратегией для предотвращения AD блокирует значения токсичности, сигнализации на ранних этапах AD, до развития дефицита памяти. Значения осаждения индуцирует аксона дегенерации7,8,9,10,11,12,13, которые могут привести к нарушению Нейронные сети и постоянное нарушение функции памяти. Многие исследования изучили механизмы значения токсичности; к примеру выродились аксоны AD мышей мозг показали увеличились autophagy14. Кальциневрина активации было сообщено как возможный механизм значения индуцированной аксональной дегенерации15; Однако прямой триггера аксональной дегенерации остается неизвестным.
Это исследование фокусируется на крах аксональное окончаний под названием конусы роста. Крах конусы аксональное роста может быть вызвана аксональное роста репелленты, например Семафорин 3A и Эфрины A516,,1718,19,20. Крах как дистрофические аксональное окончаний наблюдались в мозги AD пациентов21,22. Кроме того отказ функционирования конус роста может спровоцировать аксональной дегенерации23. Однако это неизвестно ли значения индуцирует рост конуса краха. Таким образом это исследование представляет Роман протокола соблюдать раннего воздействия значения в культивированный нейронов и исследовать значения индуцированной роста конуса краха.
Наблюдение ранних явлений в конусы аксональное роста после лечения Aβ1-42 включен протокол, описанные в данном исследовании. Aβ1-42 индуцированной эндоцитоза в конусы аксональное роста в течение 20 мин, и крах конус роста наблюдалось в течение 1 ч лечения. Этот эндоцитоза вероятно опосредов?…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа частично поддерживается научно-исследовательских грантов от JSP-страницы (KAKENHI 18K 07389), Япония, Такэда научный фонд, Японии и Кобаяси фармацевтическая Co. Ltd., Япония.
ddY mice | SLC | ||
Eight-well culture slide | Falcon | 354108 | |
poly D lysine | Wako | 168-19041 | |
Culture medium, Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
house serum | Gibco | 26050-088 | |
glucose | Wako | 049-31165 | |
L-glutamine | Wako | 074-00522 | |
0.05% trypsin | Gibco | 25300-054 | |
DNase I | Worthington | DP | |
soybean trypsin inhibitor | Gibco | 17075-029 | |
Filter with 70 µm mesh size, cell strainer | Falcon | 352350 | |
B-27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
CO2 incubator | Astec | SCA-165DS | |
Amyloid β1-42 | Sigma-Aldrich | A9810 | |
paraformaldehyde | Wako | 162-16065 | |
sucrose | Wako | 196-00015 | |
Aqueous mounting medium, Aqua-Poly/Mount | polysciences | 18606-20 | |
Inverted microscope A | Carl Zeiss | Axio Observer Z1 | Connected with AxioCam MRm, Heating Unit XL S, CO2 Module S1, and TempModule S1 |
Objective Plan-Apochromat 20x | Carl Zeiss | 420650-9901 | |
Objective Plan-Apochromat 63x | Carl Zeiss | 440762-9904 | |
Objective, CFI Plan Apo Lambda 40X | Nikon | ||
anti-MAP2 IgG | Abcam | ab32454 | |
anti-tau-1 IgG | Chemicon | MAB3420 | |
anti-amyloid β antibody | IBL | 10379 | clone 11A1 |
normal goat serum | Wako | 143-06561 | |
bovine serum albumin | Wako | 010-25783 | |
t-octylphenoxypolyethoxyethanol | Wako | 169-21105 | |
goat anti-mouse IgG conjugated with AlexaFluor 594 | Invitrogen | A11032 | |
goat anti-rabbit IgG conjugated with AlexaFluor 488 | Invitrogen | A11029 | |
hot plate | NISSIN | NHP-M30N | |
cover glass | Fisher Scientific | 12-545-85 | |
35 mm dish | IWAKI | 1000-035 | |
Silicone RTV | Shin-Etsu | KE42T | |
hand punch | Roper Whitney | No. XX | |
Fluorescence membrane probe, FM1-43FX | Invitrogen | F35355 | |
Ca2+– and Mg2+-free Hanks' balanced salt solution | Gibco | 14175-095 | |
Transfection solution, Nucleofector solution | Lonza | VPG-1001 | |
Electroporator, Nucleofector I | Amaxa | ||
Inverted microscope B | Keyence | BZ-X710 | |
Image software, ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ |