시각화 Axonal 성장 콘 붕괴 교양된 마우스 신경에 있는 초기 아 밀 로이드 β 효과
Summary
여기 아 밀 로이드 β (Aβ)는 뇌에서의 초기 효과 조사 하기 위해 프로토콜 제공 됩니다. 이것은 clathrin 중재 된 endocytosis 및 axonal 성장 콘의 붕괴 유도 하는 Aβ 보여준다. 프로토콜 axonal 성장 콘에 Aβ의 초기 효과 공부에 유용 하 고 알 츠 하이 머 병의 예방을 촉진 수 있습니다.
Abstract
아 밀 로이드 β (Aβ)는 Alzheimer의 질병 (광고)에 메모리 장애를 발생합니다. 치료제 광고 환자의 두뇌에서 Aβ 수준을 줄이기 위해 표시 되었습니다, 비록 이러한 메모리 기능을 향상 되지 않습니다. Aβ 메모리 손상의 모양 전에 뇌에 집계, 이후 Aβ를 대상으로 수 있습니다 이미 메모리 적자 전시 광고 환자 치료에 대 한 효율적. 따라서, Aβ 증 착으로 인해 다운스트림 신호 광고 개발 하기 전에 차단 합니다. Aβ 신경 네트워크 및 메모리 손상의 방해로 이어지는 axonal 변성을 유도 합니다. Aβ 독성의 기계 장치에 많은 연구 들이 있더라도, Aβ 독성의 소스를 알 수 없는 남아 있습니다. 소스를 식별 하려면 우리는 현미경 검사 법, 유전자 transfection, 라이브 셀 이미징 교양된 뉴런의 axonal 성장 콘에 Aβ에 의해 발생 하는 초기 변화를 조사 하기 위해 사용 하는 새로운 프로토콜을 제안 합니다. 이 프로토콜은 Aβ 억제 endocytosis의 Aβ 독성을 방지 시연 clathrin 중재 된 endocytosis axonal 성장 콘 성장 콘 붕괴 뒤에 유도 밝혔다. 이 프로토콜은 Aβ의 초기 효과 공부에 도움이 될 것입니다 하 고 보다 효율적이 고 예방 광고 치료로 이어질 수 있습니다.
Introduction
아 밀 로이드 β (Aβ) 예금 Alzheimer의 질병 (광고) 환자의 뇌에서 발견 되 고 메모리 장애2,,34로 이어지는 광고1 신경 네트워크를 방해 하는의 중요 한 원인으로 간주 됩니다. 많은 임상 약물 후보 아 밀 로이드 β (Aβ) 생산을 효과적으로 방지 또는 Aβ 예금을 제거 표시 되었습니다. 그러나, 아무도 AD 환자5에 메모리 기능을 개선에 성공 했다. Aβ는 메모리 장애6;의 발병 전에 뇌에 이미 입금 됩니다. 따라서, 환자의 두뇌에서 Aβ 수준 감소 전시 메모리 장애 수 있습니다 효과. Aβ 증 착은 전 임상 광고 환자; 그러나, 이러한 환자는 거의 신경 변성 및 메모리 적자6제시. Aβ 증 착 및 메모리 장애 사이의 지연 시간입니다. 따라서, 광고의 예방을 위한 중요 한 전략 광고, 이전에 메모리 적자의 개발의 초기 단계 동안 신호 Aβ 독성을 차단 합니다. Aβ 착 유도 축 삭 변성7,,89,10,11,12,13의 중단으로 이어질 수 있는 신경 네트워크 그리고 메모리 기능의 영구 장애입니다. 많은 연구 조사 Aβ 독성;의 메커니즘 예를 들어 광고 쥐 두뇌의 퇴 화 한 축 삭 autophagy14증가 표시 되었습니다. Calcineurin 활성화 Aβ 유도 axonal 변성15;의 가능한 메커니즘으로 보고 되었습니다. 그러나, 직접 트리거 axonal 변성의 알 수 없는 남아 있습니다.
이 연구는 성장 원뿔 이라고 axonal 엔딩의 붕괴에 초점을 맞추고. Axonal 성장 콘의 붕괴 semaphorin 3A와 ephrin A516,17,18,,1920같은 axonal 성장 방수 제에 의해 발생할 수 있습니다. 축소 같은 dystrophic axonal 엔딩 광고 환자21,22의 두뇌에서 관찰 되었습니다. 또한, 성장 콘 기능 실패 axonal 변성23을 자극 수 있습니다. 그러나, 그것 아니다 알려진 Aβ 성장 콘 붕괴를 유도 하는 여부. 따라서,이 연구는 교양된 신경에 있는 Aβ의 초기 효과 관찰 하 고 Aβ 유도 성장 콘 붕괴를 조사 하는 새로운 프로토콜을 선물 한다.
Protocol
모든 실험 관심과 도야마 대학 스기타 캠퍼스에서 실험 동물의 사용에 대 한 지침에 따라 실시 했다 및 동물 관리 및 사용의 실험실 동물의 스기타 캠퍼스에 대 한 위원회에 의해 승인 된 대학교의 도야마 (A2014INM-1, A2017INM-1). 1. 붕괴 분석 결과 폴 리-D-리 코팅 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)에 5 μ g/mL 폴 리-D-라이 신 (PDL)의 400 μ와 8 잘 문화 슬라이드 코트 하 고 37 ° C?…
Representative Results
이 프로토콜에서 Aβ1-42는 incubated 37 ° C에서 사용 하기 전에 7 일 동안 부 화 Aβ1-42의 독성 형태27,28,,3035생산 필요 했다 때문에. 이 부 화 후 Aβ의 집계 된 형태 (그림 1A)를 관찰 했다. Aβ1-42의 비슷한 인큐베이션 fibril 형태 Aβ36의 생산으로…
Discussion
이 연구에서 설명 하는 프로토콜 Aβ1-42 치료 후 axonal 성장 콘에 초기 현상의 관찰을 사용할 수 있습니다. Aβ1-42 유도 axonal 성장 콘 20 분 이내에 endocytosis 그리고 성장 콘 축소 치료의 1 시간 이내에 관찰 되었다. 이 endocytosis clathrin에 의해 아마 중재 했다. 이 프로토콜을 사용 하 여 억제 clathrin 중재 된 endocytosis의 Aβ1-42-유도 된 성장 콘 붕괴와 교양된 신경27axonal 변성을 방지 하기 위…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 부분적으로 JSP에서 연구 보조금 지원 (KAKENHI 18 K 07389), 일본, 다케다 과학 재단, 일본, 그리고 고바야시 제약, 일본.
Materials
| ddY mice | SLC | ||
| Eight-well culture slide | Falcon | 354108 | |
| poly D lysine | Wako | 168-19041 | |
| Culture medium, Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| house serum | Gibco | 26050-088 | |
| glucose | Wako | 049-31165 | |
| L-glutamine | Wako | 074-00522 | |
| 0.05% trypsin | Gibco | 25300-054 | |
| DNase I | Worthington | DP | |
| soybean trypsin inhibitor | Gibco | 17075-029 | |
| Filter with 70 µm mesh size, cell strainer | Falcon | 352350 | |
| B-27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| CO2 incubator | Astec | SCA-165DS | |
| Amyloid β1-42 | Sigma-Aldrich | A9810 | |
| paraformaldehyde | Wako | 162-16065 | |
| sucrose | Wako | 196-00015 | |
| Aqueous mounting medium, Aqua-Poly/Mount | polysciences | 18606-20 | |
| Inverted microscope A | Carl Zeiss | Axio Observer Z1 | Connected with AxioCam MRm, Heating Unit XL S, CO2 Module S1, and TempModule S1 |
| Objective Plan-Apochromat 20x | Carl Zeiss | 420650-9901 | |
| Objective Plan-Apochromat 63x | Carl Zeiss | 440762-9904 | |
| Objective, CFI Plan Apo Lambda 40X | Nikon | ||
| anti-MAP2 IgG | Abcam | ab32454 | |
| anti-tau-1 IgG | Chemicon | MAB3420 | |
| anti-amyloid β antibody | IBL | 10379 | clone 11A1 |
| normal goat serum | Wako | 143-06561 | |
| bovine serum albumin | Wako | 010-25783 | |
| t-octylphenoxypolyethoxyethanol | Wako | 169-21105 | |
| goat anti-mouse IgG conjugated with AlexaFluor 594 | Invitrogen | A11032 | |
| goat anti-rabbit IgG conjugated with AlexaFluor 488 | Invitrogen | A11029 | |
| hot plate | NISSIN | NHP-M30N | |
| cover glass | Fisher Scientific | 12-545-85 | |
| 35 mm dish | IWAKI | 1000-035 | |
| Silicone RTV | Shin-Etsu | KE42T | |
| hand punch | Roper Whitney | No. XX | |
| Fluorescence membrane probe, FM1-43FX | Invitrogen | F35355 | |
| Ca2+– and Mg2+-free Hanks' balanced salt solution | Gibco | 14175-095 | |
| Transfection solution, Nucleofector solution | Lonza | VPG-1001 | |
| Electroporator, Nucleofector I | Amaxa | ||
| Inverted microscope B | Keyence | BZ-X710 | |
| Image software, ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ |
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Citer Cet Article
Kuboyama, T. Visualizing Axonal Growth Cone Collapse and Early Amyloid β Effects in Cultured Mouse Neurons. J. Vis. Exp. (140), e58229, doi:10.3791/58229 (2018).