Un protocole d’enquêter sur les premiers effets de β amyloïde (Aß) dans le cerveau est présenté ici. Cela montre que le bêta-amyloïdes induit endocytose clathrine et effondrement des cônes de croissance axonale. Le protocole est utile dans l’étude des effets précoces de bêta-amyloïdes sur les cônes de croissance axonale et peut-être faciliter la prévention de la maladie d’Alzheimer.
Β amyloïde (Aß) provoque des troubles de la mémoire dans la maladie d’Alzheimer (ma). Bien que thérapeutique ont été montré pour réduire les concentrations de bêta-amyloïdes dans le cerveau des patients atteints de ma, ceux-ci ne s’améliorent pas les fonctions de mémoire. Regroupe les bêta-amyloïdes dans le cerveau avant l’apparition de troubles de la mémoire, ciblage Aβ peut être inefficace pour le traitement des patients atteints de ma qui présentent déjà des déficits de mémoire. Par conséquent, signalisation en aval en raison des dépôts de Aβ doit être bloquée avant le développement de l’AD. Aβ induit une dégénérescence axonale, conduisant à la perturbation des réseaux de neurones et de troubles de la mémoire. Bien qu’il existe beaucoup d’études sur les mécanismes de toxicité Aβ, la source de bêta-amyloïdes toxicité reste inconnue. Pour aider à identifier la source, nous proposons un protocole novateur qui utilise la microscopie, transfection du gène et imagerie afin d’étudier les changements précoces causées par les bêta-amyloïdes dans les cônes de croissance axonale des neurones en culture de cellules vivantes. Ce protocole a révélé que Aβ induite par endocytose clathrine dans les cônes de croissance axonale suivie d’effondrement de la croissance de cône, ce qui démontre que l’inhibition de l’endocytose empêche toxicité Aβ. Ce protocole sera utile pour étudier les premiers effets de la bêta-amyloïdes et peut conduire à un traitement plus efficace et préventif AD.
Dépôts d’amyloïde-β (Aβ) sont trouvent dans le cerveau des patients atteints de la maladie d’Alzheimer (ma) et sont considérés comme une cause essentielle de AD1 qui perturbent les réseaux neuronaux, conduisant à une déficience de mémoire pour2,3,4. De nombreux candidats-médicaments cliniques montrent à prévenir efficacement la production de β amyloïde (Aß) ou éliminer les dépôts de bêta-amyloïdes. Toutefois, aucun ont réussi à améliorer la fonction de mémoire dans AD patients5. Aβ est déjà déposé dans le cerveau avant l’apparition de déficiences de mémoire6; par conséquent, baisse des niveaux de bêta-amyloïdes dans le cerveau des patients présentant troubles de la mémoire peuvent être inefficaces. Dépôts d’Aβ sont présent dans Alzheimer préclinique ; Toutefois, ces patients présentent rarement neuronale dégénérescence et la mémoire déficits6. Il y a un décalage entre les dépôts de bêta-amyloïdes et troubles de la mémoire. Par conséquent, une stratégie essentielle pour la prévention des AD bloque toxicité Aβ signalisation durant les premiers stades de l’AD, avant l’apparition de déficits de mémoire. Dépôts d’Aβ induit axon dégénérescence7,8,9,10,11,12,13, qui peut conduire à une perturbation du réseaux de neurones et une déficience permanente d’une fonction mémoire. De nombreuses études ont étudié les mécanismes de la toxicité de l’Aß ; par exemple, les axones dégénérées de cerveaux de souris ont démontré avoir augmenté autophagie14. Activation de la calcineurine a été signalée comme un éventuel mécanisme de la dégénérescence axonale induite par l’Aß15; Cependant, la détente directe d’une dégénérescence axonale reste inconnue.
Cette étude se concentre sur l’effondrement des terminaisons axonales appelé cônes de croissance. L’effondrement des cônes de croissance axonale peut être causée par les répulsifs croissance axonale, type sémaphorine-3 a et éphrine-A516,17,18,19,20. Terminaisons axonales dystrophiques effondrement semblable ont été observées dans le cerveau des AD patients21,22. En outre, une défaillance du fonctionnement de cône de croissance peut provoquer une dégénérescence axonale23. Cependant, on ne sait pas si Aβ induit effondrement de cône de croissance. Par conséquent, cette étude présente un nouveau protocole pour observer les premiers effets de la bêta-amyloïdes dans les neurones en culture et enquêter sur effondrement de cône de croissance induite par l’Aß.
Le protocole décrit dans la présente étude a permis l’observation de phénomènes précoces dans les cônes de croissance axonale après traitement Aβ1-42. Aβ1-42 induite par endocytose dans les cônes de croissance axonale dans les 20 min et effondrement de cône de croissance a été observée dans 1 h de traitement. Cette endocytose a été probablement véhiculée par la clathrine. En utilisant ce protocole, l’inhibition de l’endocytose clathrine a été confirmée pour empêcher l’effondrement de cône …
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été partiellement pris en charge par des subventions de recherche du JSPS (KAKENHI 18K 07389), Japon, Takeda (FNS), le Japon et Kobayashi Pharmaceutical Co., Ltd., Japon.
ddY mice | SLC | ||
Eight-well culture slide | Falcon | 354108 | |
poly D lysine | Wako | 168-19041 | |
Culture medium, Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
house serum | Gibco | 26050-088 | |
glucose | Wako | 049-31165 | |
L-glutamine | Wako | 074-00522 | |
0.05% trypsin | Gibco | 25300-054 | |
DNase I | Worthington | DP | |
soybean trypsin inhibitor | Gibco | 17075-029 | |
Filter with 70 µm mesh size, cell strainer | Falcon | 352350 | |
B-27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
CO2 incubator | Astec | SCA-165DS | |
Amyloid β1-42 | Sigma-Aldrich | A9810 | |
paraformaldehyde | Wako | 162-16065 | |
sucrose | Wako | 196-00015 | |
Aqueous mounting medium, Aqua-Poly/Mount | polysciences | 18606-20 | |
Inverted microscope A | Carl Zeiss | Axio Observer Z1 | Connected with AxioCam MRm, Heating Unit XL S, CO2 Module S1, and TempModule S1 |
Objective Plan-Apochromat 20x | Carl Zeiss | 420650-9901 | |
Objective Plan-Apochromat 63x | Carl Zeiss | 440762-9904 | |
Objective, CFI Plan Apo Lambda 40X | Nikon | ||
anti-MAP2 IgG | Abcam | ab32454 | |
anti-tau-1 IgG | Chemicon | MAB3420 | |
anti-amyloid β antibody | IBL | 10379 | clone 11A1 |
normal goat serum | Wako | 143-06561 | |
bovine serum albumin | Wako | 010-25783 | |
t-octylphenoxypolyethoxyethanol | Wako | 169-21105 | |
goat anti-mouse IgG conjugated with AlexaFluor 594 | Invitrogen | A11032 | |
goat anti-rabbit IgG conjugated with AlexaFluor 488 | Invitrogen | A11029 | |
hot plate | NISSIN | NHP-M30N | |
cover glass | Fisher Scientific | 12-545-85 | |
35 mm dish | IWAKI | 1000-035 | |
Silicone RTV | Shin-Etsu | KE42T | |
hand punch | Roper Whitney | No. XX | |
Fluorescence membrane probe, FM1-43FX | Invitrogen | F35355 | |
Ca2+– and Mg2+-free Hanks' balanced salt solution | Gibco | 14175-095 | |
Transfection solution, Nucleofector solution | Lonza | VPG-1001 | |
Electroporator, Nucleofector I | Amaxa | ||
Inverted microscope B | Keyence | BZ-X710 | |
Image software, ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ |