Aqui apresenta-se um protocolo para investigar os efeitos iniciais da amiloide-β (Aβ) no cérebro. Isto mostra que Aβ induz endocitose mediada por Clatrina e colapso dos cones de crescimento axonal. O protocolo é útil em estudar os efeitos iniciais de Aβ em cones de crescimento axonal e pode facilitar a prevenção da doença de Alzheimer.
Amiloide-β (Aβ) provoca deficiências de memória na doença de Alzheimer (AD). Apesar de terapêutica foram mostrados para reduzir os níveis Aβ no cérebro de pacientes, estas não melhorar as funções de memória. Desde Aβ agrega no cérebro antes do aparecimento de perturbações de memória, alvejando Aβ pode ser ineficiente no tratamento de pacientes que já apresentam défices de memória. Portanto, sinalizando a jusante devido à deposição de Aβ deve ser bloqueado antes do desenvolvimento da AD. Aβ induz a degeneração axonal, levando ao rompimento de redes neuronais e deficiências de memória. Embora existam muitos estudos sobre os mecanismos de toxicidade Aβ, a fonte de toxicidade Aβ permanece desconhecida. Para ajudar a identificar a fonte, propomos um novo protocolo que usa microscopia, transfecção do gene e célula viva de imagem para investigar mudanças adiantadas causadas por Aβ em cones de crescimento axonal de neurônios cultivados. Este protocolo revelou que Aβ induzida por endocitose mediada por Clatrina em cones de crescimento axonal, seguido pelo colapso do cone de crescimento, demonstrando que a inibição da endocitose impede que a toxicidade Aβ. O presente protocolo será útil em estudar os efeitos iniciais de Aβ e pode levar a um tratamento mais eficiente e preventivo AD.
Depósitos de amiloide-β (Aβ) são encontrados no cérebro de pacientes com doença de Alzheimer (AD) e são considerados uma causa fundamental de AD1 que disrupt redes neuronais, levando a deficiências de memória2,3,4. Muitos candidatos clínico foram mostrados para prevenir eficazmente a produção amiloide-β (Aβ) ou remover os depósitos Aβ. No entanto, ninguém conseguiu na melhoria da função de memória em pacientes de AD5. Aβ já é depositado no cérebro antes do início da deficiência de memória6; Portanto, diminuindo os níveis Aβ nos cérebros de pacientes exibem deficiência de memória pode ser ineficaz. Deposição de aβ está presente em pacientes pré-clínicos de AD; no entanto, estes pacientes raramente apresentam com neuronal défices degeneração e memória6. Há um desfasamento entre a deposição de Aβ e deficiências de memória. Portanto, uma estratégia fundamental para a prevenção do anúncio está bloqueando a toxicidade Aβ sinalização durante os estágios iniciais do anúncio, antes do desenvolvimento dos défices de memória. Deposição de aβ induz axônio degeneração7,8,9,10,11,12,13, que pode levar a uma ruptura do redes neurais e comprometimento permanente da função de memória. Muitos estudos têm investigado os mecanismos de toxicidade Aβ; por exemplo, os axônios degenerados dos cérebros de ratos de AD foram mostrados para ter aumentado de autofagia14. Ativação de calcineurina tem sido relatada como um possível mecanismo de degeneração axonal induzida por Aβ15; no entanto, o gatilho directo de degeneração axonal permanece desconhecido.
Este estudo enfoca o colapso do axonal terminações chamadas de cones de crescimento. O colapso dos cones de crescimento axonal pode ser causado por repelentes de crescimento axonal, tais como semaforina-3A e ephrin-A516,17,18,19,20. Colapso-como distróficos axonal finais foram observadas no cérebro de pacientes de AD21,22. Além disso, uma falha de funcionamento de cone de crescimento pode provocar degeneração axonal23. No entanto, é desconhecido se Aβ induz o colapso do cone de crescimento. Portanto, este estudo apresenta um novo protocolo para observar os primeiros efeitos de Aβ nos neurônios cultivados e investigar o colapso do cone de crescimento induzido por Aβ.
O protocolo descrito neste estudo permitiu a observação de fenômenos precoce em cones de crescimento axonal após tratamento Aβ1-42. Aβ1-42 induzida por endocitose em cones de crescimento axonal dentro de 20 min, e colapso do cone de crescimento foi observado dentro de 1 h de tratamento. Esta endocitose era provavelmente mediada por Clatrina. Usando este protocolo, a inibição de endocitose mediada por Clatrina foi confirmada para evitar o colapso do cone de crescimento Aβ1-42-induzido e degeneração axonal em ne…
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi parcialmente financiado por bolsas de investigação de JSPS (KAKENHI 18K 07389), Japão, Takeda Science Foundation, Japão e Kobayashi Pharmaceutical Co., Ltd., Japão.
ddY mice | SLC | ||
Eight-well culture slide | Falcon | 354108 | |
poly D lysine | Wako | 168-19041 | |
Culture medium, Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
house serum | Gibco | 26050-088 | |
glucose | Wako | 049-31165 | |
L-glutamine | Wako | 074-00522 | |
0.05% trypsin | Gibco | 25300-054 | |
DNase I | Worthington | DP | |
soybean trypsin inhibitor | Gibco | 17075-029 | |
Filter with 70 µm mesh size, cell strainer | Falcon | 352350 | |
B-27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
CO2 incubator | Astec | SCA-165DS | |
Amyloid β1-42 | Sigma-Aldrich | A9810 | |
paraformaldehyde | Wako | 162-16065 | |
sucrose | Wako | 196-00015 | |
Aqueous mounting medium, Aqua-Poly/Mount | polysciences | 18606-20 | |
Inverted microscope A | Carl Zeiss | Axio Observer Z1 | Connected with AxioCam MRm, Heating Unit XL S, CO2 Module S1, and TempModule S1 |
Objective Plan-Apochromat 20x | Carl Zeiss | 420650-9901 | |
Objective Plan-Apochromat 63x | Carl Zeiss | 440762-9904 | |
Objective, CFI Plan Apo Lambda 40X | Nikon | ||
anti-MAP2 IgG | Abcam | ab32454 | |
anti-tau-1 IgG | Chemicon | MAB3420 | |
anti-amyloid β antibody | IBL | 10379 | clone 11A1 |
normal goat serum | Wako | 143-06561 | |
bovine serum albumin | Wako | 010-25783 | |
t-octylphenoxypolyethoxyethanol | Wako | 169-21105 | |
goat anti-mouse IgG conjugated with AlexaFluor 594 | Invitrogen | A11032 | |
goat anti-rabbit IgG conjugated with AlexaFluor 488 | Invitrogen | A11029 | |
hot plate | NISSIN | NHP-M30N | |
cover glass | Fisher Scientific | 12-545-85 | |
35 mm dish | IWAKI | 1000-035 | |
Silicone RTV | Shin-Etsu | KE42T | |
hand punch | Roper Whitney | No. XX | |
Fluorescence membrane probe, FM1-43FX | Invitrogen | F35355 | |
Ca2+– and Mg2+-free Hanks' balanced salt solution | Gibco | 14175-095 | |
Transfection solution, Nucleofector solution | Lonza | VPG-1001 | |
Electroporator, Nucleofector I | Amaxa | ||
Inverted microscope B | Keyence | BZ-X710 | |
Image software, ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ |