Her vises en protokoll for å undersøke tidlig virkningene av amyloid-β (Aβ) i hjernen. Dette viser at Aβ induserer clathrin-mediert endocytose og sammenbruddet av axonal veksten kjeglene. Protokollen er nyttig i å studere tidlig effekter av Aβ på axonal veksten kjeglene og kan lette forebygging av Alzheimers sykdom.
Amyloid-β (Aβ) forårsaker minne impairments i Alzheimers sykdom (AD). Selv om therapeutics har vist seg å redusere Aβ nivåer i hjernen til AD pasienter, bedre dette ikke minne. Siden Aβ samler i hjernen før utseendet av minne impairments, kan målretting Aβ være ineffektivt for behandling av AD pasienter som allerede viser minne underskudd. Derfor bør nedstrøms signalisering på grunn av Aβ avsettelse blokkeres før Annonsen utvikling. Aβ induserer axonal degenerasjon, fører til avbrudd i nevrale nettverk og minne impairments. Selv om det er mange studier på mekanismer for Aβ toksisitet, fortsatt kilden til Aβ toksisitet ukjent. For å identifisere kilden, foreslår vi en ny protokoll som bruker mikroskopi, gene transfection og levende celle for å undersøke tidlig endringer forårsaket av Aβ i axonal veksten kjeglene kulturperler neurons. Denne protokollen avslørte at Aβ indusert clathrin-mediert endocytose i axonal veksten kjeglene etterfulgt av vekst kjegle kollaps, demonstrere at hemming av endocytose hindrer Aβ toksisitet. Denne protokollen vil være nyttig i å studere tidlig effekten av Aβ og kan føre til mer effektiv og forebyggende AD behandling.
Amyloid-β (Aβ) innskudd finnes i hjernen av pasienter med Alzheimers sykdom (AD) og regnes som en viktig årsak til AD1 som forstyrrer nevrale nettverk, fører til minne impairments2,3,4. Mange klinisk narkotika kandidater har vist seg å effektivt hindre amyloid-β (Aβ) produksjon eller fjerne Aβ innskudd. Men har ingen klart å forbedre minnefunksjon i AD pasienter5. Aβ er allerede deponert i hjernen før utbruddet av minne impairments6; Derfor kan redusere Aβ nivåer i hjernen til pasienter stiller minne impairments være ineffektivt. Aβ avsettelse finnes i preklinisk AD pasienter; men presenterer disse pasientene sjelden neuronal degenerasjon og minne underskudd6. Det er en tidsforsinkelse mellom Aβ avsettelse og minne impairments. Derfor blokkerer en viktig strategi for forebygging av AD Aβ toksisitet signalering i den tidlige fasen av Annonsen, før utviklingen av minne underskudd. Aβ avsettelse induserer axon degenerasjon7,8,9,10,11,12,13, som kan føre til en forstyrrelse av nevrale nettverk og permanent nedskrivninger av minnefunksjon. Mange studier har undersøkt virkningsmekanismer Aβ toksisitet; for eksempel har degenerert axons AD mus hjerner blitt vist å ha økt autophagy14. Calcineurin aktivisering har blitt rapportert som en mulig mekanisme Aβ-indusert axonal degenerasjon15; imidlertid fortsatt direkte avtrekkeren axonal degenerasjon ukjent.
Denne studien fokuserer på sammenbruddet av axonal avslutninger kalt veksten kjeglene. Sammenbruddet av axonal veksten kjeglene kan skyldes axonal vekst repellents, som semaphorin 3A og ephrin-A516,17,18,19,20. Skjul-lignende dystrophic axonal avslutninger er observert i hjernen til AD pasienter21,22. I tillegg kan en svikt i vekst kjegle fungerer provosere axonal degenerasjon23. Men er det ukjent om Aβ induserer vekst kjegle kollaps. Derfor presenterer denne studien en ny protokoll å observere tidlig effekten av Aβ i kulturperler nevroner og undersøke Aβ-indusert vekst kjegle kollaps.
Protokollen beskrevet i denne studien aktivert observasjon av tidlig fenomener i axonal veksten kjeglene etter Aβ1-42 behandling. Aβ1-42 indusert endocytose i axonal veksten kjeglene innen 20 min, og vekst kjegle kollaps ble observert i 1t behandling. Denne endocytose var sannsynligvis formidlet av clathrin. Bruker denne protokollen, ble hemming av clathrin-mediert endocytose bekreftet for å hindre Aβ1-42-indusert vekst kjegle kollaps og axonal degenerasjon i kulturperler neurons27. I tillegg …
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble delvis støttet av forskningsmidler fra JSP (KAKENHI 18K 07389), Japan, Takeda Science Foundation, Japan og Kobayashi farmasøytiske co, Ltd, Japan.
ddY mice | SLC | ||
Eight-well culture slide | Falcon | 354108 | |
poly D lysine | Wako | 168-19041 | |
Culture medium, Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
house serum | Gibco | 26050-088 | |
glucose | Wako | 049-31165 | |
L-glutamine | Wako | 074-00522 | |
0.05% trypsin | Gibco | 25300-054 | |
DNase I | Worthington | DP | |
soybean trypsin inhibitor | Gibco | 17075-029 | |
Filter with 70 µm mesh size, cell strainer | Falcon | 352350 | |
B-27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
CO2 incubator | Astec | SCA-165DS | |
Amyloid β1-42 | Sigma-Aldrich | A9810 | |
paraformaldehyde | Wako | 162-16065 | |
sucrose | Wako | 196-00015 | |
Aqueous mounting medium, Aqua-Poly/Mount | polysciences | 18606-20 | |
Inverted microscope A | Carl Zeiss | Axio Observer Z1 | Connected with AxioCam MRm, Heating Unit XL S, CO2 Module S1, and TempModule S1 |
Objective Plan-Apochromat 20x | Carl Zeiss | 420650-9901 | |
Objective Plan-Apochromat 63x | Carl Zeiss | 440762-9904 | |
Objective, CFI Plan Apo Lambda 40X | Nikon | ||
anti-MAP2 IgG | Abcam | ab32454 | |
anti-tau-1 IgG | Chemicon | MAB3420 | |
anti-amyloid β antibody | IBL | 10379 | clone 11A1 |
normal goat serum | Wako | 143-06561 | |
bovine serum albumin | Wako | 010-25783 | |
t-octylphenoxypolyethoxyethanol | Wako | 169-21105 | |
goat anti-mouse IgG conjugated with AlexaFluor 594 | Invitrogen | A11032 | |
goat anti-rabbit IgG conjugated with AlexaFluor 488 | Invitrogen | A11029 | |
hot plate | NISSIN | NHP-M30N | |
cover glass | Fisher Scientific | 12-545-85 | |
35 mm dish | IWAKI | 1000-035 | |
Silicone RTV | Shin-Etsu | KE42T | |
hand punch | Roper Whitney | No. XX | |
Fluorescence membrane probe, FM1-43FX | Invitrogen | F35355 | |
Ca2+– and Mg2+-free Hanks' balanced salt solution | Gibco | 14175-095 | |
Transfection solution, Nucleofector solution | Lonza | VPG-1001 | |
Electroporator, Nucleofector I | Amaxa | ||
Inverted microscope B | Keyence | BZ-X710 | |
Image software, ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ |