Visualisierung von axonale Wachstum Kegel Zusammenbruch und frühe Amyloid β-Effekte in kultivierten Maus Neuronen
Summary
Hier präsentiert sich ein Protokoll, das frühe Effekte von Amyloid-β (Aβ) im Gehirn zu untersuchen. Dies zeigt, dass Aβ Clathrin-vermittelte Endozytose und Zusammenbruch der axonalen Wachstum Kegel induziert. Das Protokoll ist nützlich bei der Untersuchung der frühen Auswirkungen von Aβ auf axonale Wachstum Kegel und Prävention der Alzheimer-Krankheit erleichtern kann.
Abstract
Amyloid-β (Aβ) bewirkt, dass Gedächtnisstörungen bei der Alzheimer-Krankheit (AD). Obwohl Therapeutika haben gezeigt, dass Aβ in den Gehirnen von Alzheimer-Patienten zu reduzieren, verbessern diese Memory-Funktionen nicht. Da Aβ im Gehirn vor dem Aufkommen von Gedächtnisstörungen Aggregate, kann gezielt Aβ ineffizient sein zur Behandlung von Alzheimer-Patienten, die bereits Gedächtnisdefizite ausstellen. Daher sollten nachgeschaltete Signalisierung durch Aβ Ablagerung vor AD Entwicklung blockiert werden. Aβ induziert axonalen Degeneration, führt zu einer Störung der neuronalen Netzwerke und Gedächtnisstörungen. Obwohl es viele Studien über die Mechanismen der Aβ-Toxizität gibt, ist die Quelle von Aβ-Toxizität unbekannt. Um die Quelle zu ermitteln, schlagen wir eine neuartige Protokoll, die Mikroskopie, gen Transfektion und live Cell imaging zu frühen Veränderungen durch Aβ axonale Wachstum Zapfen von kultivierten Neuronen untersuchen verwendet. Dieses Protokoll zufolge Aβ induziert Clathrin-vermittelte Endozytose in axonale Wachstum Kegel gefolgt von Wachstum Kegel Zusammenbruch, zeigen, dass die Hemmung der Endozytose Aβ Toxizität verhindert. Dieses Protokoll wird in der frühen Auswirkungen von Aβ nützlich sein und kann dazu führen, effizienter und vorbeugende Behandlung der AD.
Introduction
Ablagerungen von Amyloid-β (Aβ) befinden sich im Gehirn von Patienten mit Alzheimer-Krankheit (AD) und gelten als eine kritische Ursache von AD1 , die neuronale Netze stören zu Speicher Beeinträchtigungen2,3,4. Viele klinische Wirkstoffkandidaten nachweislich effektiv verhindern Amyloid-β (Aβ) Produktion oder Aβ Ablagerungen entfernen. Jedoch ist keine Verbesserung der Gedächtnisfunktion AD Patienten5gelungen. Aβ lagert sich bereits im Gehirn vor dem Beginn der Speicher Beeinträchtigungen6; Daher können Verminderung der Aβ-Zahl in den Gehirnen von Patienten ausstellenden Gedächtnisstörungen unwirksam sein. Aβ Ablagerung ist in präklinischen Alzheimer-Patienten; Allerdings stellen diese Patienten selten mit neuronalen Degeneration und Speicher Defizite6. Gibt es eine zeitliche Verzögerung zwischen Aβ-Ablagerungen und Gedächtnisstörungen. Daher ist eine kritische Strategie zur Prävention von AD Aβ Toxizität während der frühen Stadien von AD, vor der Entwicklung von Gedächtnisstörungen Signalisierung blockiert. Ablagerung von Aβ induziert Axon Degeneration7,8,9,10,11,12,13, führen zu einer Störung der neuronale Netze und dauerhafte Beeinträchtigung der Memory-Funktion. Viele Studien haben die Mechanismen der Aβ-Toxizität untersucht; zum Beispiel zeigten die degenerierten Axone AD Mäuse Gehirne Autophagie14gestiegen. Calcineurin-Aktivierung wurde als ein möglicher Mechanismus der Aβ-induzierte axonalen Degeneration15gemeldet; die direkte Auslöser der axonalen Degeneration bleibt jedoch unbekannt.
Diese Studie konzentriert sich auf den Zusammenbruch der axonalen Endungen genannt Wachstum Kegel. Der Zusammenbruch der axonalen Wachstum Zapfen kann durch axonale Wachstum Repellentien wie semaphorin-3A und Ephrin-A516,17,18,19,20verursacht werden. Kollaps-wie dystrophischen axonale Endungen sind in den Gehirnen von AD Patienten21,22beobachtet worden. Darüber hinaus kann ein Versagen des Wachstums Kegel funktionieren axonalen Degeneration23provozieren. Es ist jedoch unbekannt, ob Aβ Wachstum Kegel Zusammenbruch induziert. Diese Studie stellt daher eine neuartige Protokoll um die frühen Auswirkungen von Aβ in kultivierten Neuronen zu beobachten und untersuchen Aβ-induzierte Wachstum Kegel Zusammenbruch.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das Protokoll in dieser Studie beschriebenen aktiviert die Beobachtung der frühen Phänomene in axonale Wachstum Zapfen nach Aβ1-42-Behandlung. Aβ1-42 induzierte Endozytose in axonale Wachstum Zapfen innerhalb von 20 min, und Wachstum Kegel Zusammenbruch wurde innerhalb 1 h nach Behandlung beobachtet. Diese Endozytose wurde wahrscheinlich durch Clathrin vermittelt. Durch die Verwendung dieses Protokolls, bestätigte die Hemmung der Clathrin-vermittelte Endozytose um Aβ1-42-induzierte Wachstum Kegel Zusammenbruch und …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde teilweise unterstützt von Forschungsstipendien von JSPS (KAKENHI 18K 07389), Japan, Takeda Science Foundation, Japan und Kobayashi Pharmaceutical Co., Ltd., Japan.
Materials
| ddY mice | SLC | ||
| Eight-well culture slide | Falcon | 354108 | |
| poly D lysine | Wako | 168-19041 | |
| Culture medium, Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| house serum | Gibco | 26050-088 | |
| glucose | Wako | 049-31165 | |
| L-glutamine | Wako | 074-00522 | |
| 0.05% trypsin | Gibco | 25300-054 | |
| DNase I | Worthington | DP | |
| soybean trypsin inhibitor | Gibco | 17075-029 | |
| Filter with 70 µm mesh size, cell strainer | Falcon | 352350 | |
| B-27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| CO2 incubator | Astec | SCA-165DS | |
| Amyloid β1-42 | Sigma-Aldrich | A9810 | |
| paraformaldehyde | Wako | 162-16065 | |
| sucrose | Wako | 196-00015 | |
| Aqueous mounting medium, Aqua-Poly/Mount | polysciences | 18606-20 | |
| Inverted microscope A | Carl Zeiss | Axio Observer Z1 | Connected with AxioCam MRm, Heating Unit XL S, CO2 Module S1, and TempModule S1 |
| Objective Plan-Apochromat 20x | Carl Zeiss | 420650-9901 | |
| Objective Plan-Apochromat 63x | Carl Zeiss | 440762-9904 | |
| Objective, CFI Plan Apo Lambda 40X | Nikon | ||
| anti-MAP2 IgG | Abcam | ab32454 | |
| anti-tau-1 IgG | Chemicon | MAB3420 | |
| anti-amyloid β antibody | IBL | 10379 | clone 11A1 |
| normal goat serum | Wako | 143-06561 | |
| bovine serum albumin | Wako | 010-25783 | |
| t-octylphenoxypolyethoxyethanol | Wako | 169-21105 | |
| goat anti-mouse IgG conjugated with AlexaFluor 594 | Invitrogen | A11032 | |
| goat anti-rabbit IgG conjugated with AlexaFluor 488 | Invitrogen | A11029 | |
| hot plate | NISSIN | NHP-M30N | |
| cover glass | Fisher Scientific | 12-545-85 | |
| 35 mm dish | IWAKI | 1000-035 | |
| Silicone RTV | Shin-Etsu | KE42T | |
| hand punch | Roper Whitney | No. XX | |
| Fluorescence membrane probe, FM1-43FX | Invitrogen | F35355 | |
| Ca2+– and Mg2+-free Hanks' balanced salt solution | Gibco | 14175-095 | |
| Transfection solution, Nucleofector solution | Lonza | VPG-1001 | |
| Electroporator, Nucleofector I | Amaxa | ||
| Inverted microscope B | Keyence | BZ-X710 | |
| Image software, ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ |
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