Visualizzazione di collasso del cono di crescita assonale ed effetti precoci β amiloide in neuroni coltivati del topo
Summary
Qui è presentato un protocollo per indagare gli effetti precoci dell’amiloide-β (Aβ) nel cervello. Questo dimostra che Aβ induce endocytosis clathrin-mediato e crollo dei coni di crescita assonale. Il protocollo è utile per studiare effetti precoci di Aβ sui coni di crescita assonale e può facilitare la prevenzione del morbo di Alzheimer.
Abstract
Amiloide-β (Aβ) provoca disturbi della memoria nel morbo di Alzheimer (annuncio). Anche se terapeutica sono stati indicati per ridurre i livelli di Aβ nei cervelli dei pazienti dell’annuncio, questi non migliorano le funzioni di memoria. Poiché Aβ aggrega nel cervello prima della comparsa dei disturbi della memoria, targeting Aβ può essere inefficiente per il trattamento di pazienti dell’annuncio che già esibiscono i deficit di memoria. Pertanto, la segnalazione a valle a causa della deposizione di Aβ deve essere bloccato prima di sviluppo AD. Aβ induce degenerazione assonale, che conduce alla rottura delle reti neuronali e disturbi della memoria. Anche se ci sono molti studi sui meccanismi della tossicità Aβ, la fonte di tossicità Aβ rimane sconosciuta. Per identificare la fonte, vi proponiamo un romanzo protocollo che utilizza la microscopia, la transfezione genica e live cell imaging per studiare i primi cambiamenti causati da Aβ in coni di crescita assonali dei neuroni coltivati. Questo protocollo ha rivelato che Aβ indotta endocytosis clathrin-mediato in coni di crescita assonali seguita da collasso di cono di crescita, che dimostrano che l’inibizione dell’endocitosi impedisce la tossicità Aβ. Questo protocollo sarà utile per studiare gli effetti iniziali di Aβ e può condurre al trattamento annuncio più efficace e preventivo.
Introduction
Depositi di amiloide-β (Aβ) si trovano nel cervello dei pazienti con morbo di Alzheimer (annuncio) e sono considerati una causa critica AD1 che interrompono le reti neuronali, che conduce a memoria i danni2,3,4. Molti clinici farmaci candidati hanno dimostrati di prevenire efficacemente la produzione di amiloide-β (Aβ) o rimuovere i depositi di Aβ. Tuttavia, nessuno ha avuto successo nel migliorare la funzione di memoria in annuncio pazienti5. Aβ è già depositato nel cervello prima dell’inizio di memoria menomazioni6; di conseguenza, diminuire i livelli Aβ nei cervelli dei pazienti espositrici menomazioni di memoria possono essere inefficace. Deposizione di Aβ è presente nei pazienti dell’annuncio preclinici; Tuttavia, questi pazienti presentano raramente con deficit di memoria e degenerazione neuronale6. C’è un ritardo tra la deposizione di Aβ e disturbi della memoria. Pertanto, una strategia critica per la prevenzione dell’annuncio sta bloccando la tossicità Aβ segnalazione durante le prime fasi dell’annuncio, prima dello sviluppo dei deficit di memoria. Deposizione di Aβ induce assone degenerazione7,8,9,10,11,12,13, che può portare a una rottura del reti neurali e danno permanente della funzione di memoria. Molti studi hanno studiato i meccanismi di tossicità Aβ; ad esempio, gli assoni degenerati di cervelli dell’annuncio topi sono stati indicati per hanno aumentato l’autofagia14. Attivazione di calcineurina è stata segnalata come un possibile meccanismo di degenerazione assonale indotta da Aβ15; Tuttavia, l’innesco diretto di degenerazione assonale rimane sconosciuto.
Questo studio si concentra sul crollo delle terminazioni assonali chiamati coni di crescita. Il crollo dei coni di crescita assonale può essere causato da repellenti per la crescita assonale, come semaforine-3A ed efrina-A516,17,18,19,20. Collasso-come terminazioni assonali distrofici sono state osservate nei cervelli dei pazienti AD21,22. Inoltre, un fallimento della crescita cono funzionamento può provocare la degenerazione assonale23. Tuttavia, non è noto se Aβ induca collasso del cono di crescita. Di conseguenza, questo studio presenta un romanzo protocollo per osservare i primi effetti di Aβ in colture di neuroni e indagare il collasso del cono di crescita indotta da Aβ.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo descritto in questo studio abilitato l’osservazione di fenomeni precoce nei coni di crescita assonale dopo il trattamento Aβ1-42. Aβ1-42 indotto endocitosi in coni di crescita assonali entro 20 min, e collasso del cono di crescita è stato osservato entro 1 h di trattamento. Questa endocitosi probabilmente è stata mediata da clatrina. Utilizzando questo protocollo, l’inibizione dell’endocitosi clatrina-mediata è stata confermata per prevenire il collasso del cono di crescita indotta da Aβ1-42 e degener…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato parzialmente sostenuto da borse di ricerca da JSP (KAKENHI 18K 07389), Giappone, Takeda Science Foundation, Giappone e Kobayashi Pharmaceutical Co., Ltd., Giappone.
Materials
| ddY mice | SLC | ||
| Eight-well culture slide | Falcon | 354108 | |
| poly D lysine | Wako | 168-19041 | |
| Culture medium, Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| house serum | Gibco | 26050-088 | |
| glucose | Wako | 049-31165 | |
| L-glutamine | Wako | 074-00522 | |
| 0.05% trypsin | Gibco | 25300-054 | |
| DNase I | Worthington | DP | |
| soybean trypsin inhibitor | Gibco | 17075-029 | |
| Filter with 70 µm mesh size, cell strainer | Falcon | 352350 | |
| B-27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| CO2 incubator | Astec | SCA-165DS | |
| Amyloid β1-42 | Sigma-Aldrich | A9810 | |
| paraformaldehyde | Wako | 162-16065 | |
| sucrose | Wako | 196-00015 | |
| Aqueous mounting medium, Aqua-Poly/Mount | polysciences | 18606-20 | |
| Inverted microscope A | Carl Zeiss | Axio Observer Z1 | Connected with AxioCam MRm, Heating Unit XL S, CO2 Module S1, and TempModule S1 |
| Objective Plan-Apochromat 20x | Carl Zeiss | 420650-9901 | |
| Objective Plan-Apochromat 63x | Carl Zeiss | 440762-9904 | |
| Objective, CFI Plan Apo Lambda 40X | Nikon | ||
| anti-MAP2 IgG | Abcam | ab32454 | |
| anti-tau-1 IgG | Chemicon | MAB3420 | |
| anti-amyloid β antibody | IBL | 10379 | clone 11A1 |
| normal goat serum | Wako | 143-06561 | |
| bovine serum albumin | Wako | 010-25783 | |
| t-octylphenoxypolyethoxyethanol | Wako | 169-21105 | |
| goat anti-mouse IgG conjugated with AlexaFluor 594 | Invitrogen | A11032 | |
| goat anti-rabbit IgG conjugated with AlexaFluor 488 | Invitrogen | A11029 | |
| hot plate | NISSIN | NHP-M30N | |
| cover glass | Fisher Scientific | 12-545-85 | |
| 35 mm dish | IWAKI | 1000-035 | |
| Silicone RTV | Shin-Etsu | KE42T | |
| hand punch | Roper Whitney | No. XX | |
| Fluorescence membrane probe, FM1-43FX | Invitrogen | F35355 | |
| Ca2+– and Mg2+-free Hanks' balanced salt solution | Gibco | 14175-095 | |
| Transfection solution, Nucleofector solution | Lonza | VPG-1001 | |
| Electroporator, Nucleofector I | Amaxa | ||
| Inverted microscope B | Keyence | BZ-X710 | |
| Image software, ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ |
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