軸索の成長円錐の破壊とマウスの培養神経細胞の初期のアミロイド β 効果の可視化
Summary
ここで、脳にアミロイド β (a β) の初期の影響を調査するためのプロトコルが表示されます。 これは、a β がクラスリン依存性エンドサイトーシスと軸索成長円錐の崩壊を誘発することを示しています。プロトコルは有用性軸索成長円錐の a β の初期の影響が、アルツハイマー病の予防を促進するかもしれない。
Abstract
アミロイド β (a β) アルツハイマー病 (AD) のメモリ障害が発生します。治療は、AD 患者の脳内 a β レベルを減らすために示されている、ただしこれらはメモリ機能を改善しません。以来、メモリ障害の出現の前に脳内の a β を集約、a β をターゲットできないがあります既に記憶障害を示す AD 患者を治療するため効率的です。したがって、a β 沈着による下流シグナリングは、広告開発の前にブロックする必要があります。A β は、ニューロン ネットワークとメモリ障害の混乱につながる軸索変性を誘導します。A β 毒性のメカニズムに関する多くの研究がありますが、a β の毒性の原因は不明のまま。ソースを識別するために、顕微鏡、遺伝子導入、培養神経細胞の軸索の成長円錐における a β による初期の変化を調査するためのイメージングを使用して、新しいプロトコルを提案する.このプロトコルでは、a β は、エンドサイトーシスの阻害が a β 毒性を防止することを示す成長円錐の破壊、続いて軸索の成長円錐におけるクラスリン依存性エンドサイトーシスを誘導を明らかにしました。このプロトコルでは、a β の初期効果の研究に有用であるしより効率的かつ予防の AD 治療につながる可能性があります。
Introduction
アミロイド β (a β) の預金はアルツハイマー病 (AD) 患者の脳で発見され、メモリ障害2,3,4につながる神経のネットワークを混乱させる広告1の重要な原因と考えられています。アミロイド β (a β) の生産を効果的に防ぐまたは a β の預金を削除する多くの臨床薬の候補者が示されています。しかし、どれも AD 患者5の記憶機能の改善に成功しています。メモリ障害6; 発症する前に脳に a β が沈着既にしたがって、患者の脳内の a β レベルを低下出展記憶障碍なく効果的かもしれません。A β 沈着がある臨床の AD 患者;しかし、これらの患者はほとんど神経変性とメモリの赤字6提示します。A β 沈着と記憶障害との間のタイムラグがあります。したがって、広告の防止のための重要な戦略は、記憶障害の開発の前に、広告の初期の段階でシグナル a β 毒性をブロックされています。A β の沈着を誘導する軸索変性7,8,9,10、11,12,13の崩壊につながる可能性があります。ニューラル ネットワークとメモリ機能の永久的な障害。多くの研究は、a β 毒性のメカニズムを検討しました。たとえば、広告マウス脳の変性した軸索は、オートファジー14を増加するいると示されています。軸索変性の a β による15の可能なメカニズムとしてカルシニューリンの活性化が報告されています。しかし、軸索変性の直接のトリガーは不明のまま。
本研究は成長円錐と呼ばれる軸索終末の崩壊に焦点を当てています。軸索成長円錐の崩壊は、軸索の成長忌避剤、セマフォリン 3 a と ephrin A516,17,18,19、など20によって引き起こされることができます。崩壊のような栄養障害による軸索終末は、AD 患者21,22の脳で観察されています。さらに、成長円錐の機能の障害は、軸索変性23を引き起こすことができます。しかし、a β が成長円錐の破壊を誘発するかどうかは知られています。したがって、本研究は、培養神経細胞における a β の初期効果を観察し、a β による成長円錐の破壊を調査する新しいプロトコルを提示します。
Protocol
すべての実験ケアと富山大学杉谷キャンパスで実験動物の使用のためのガイドラインに従って実施し、動物と杉谷キャンパスで実験動物の使用委員会によって承認された、富山大学 (A2014INM 1、A2017INM 1)。 1. 崩壊アッセイ ポリ-D-リジン コーティング コートを 5 μ g/mL ポリ-D-リジン (PDL) 400 μ l/8 ウェル文化スライドはリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) と一晩 37 ° C で…
Representative Results
このプロトコルでは Aβ1 42 使用前に 7 日間の 37 ° C で培養された Aβ1 42 の孵化だった有毒フォーム27,28,30,35の生産に必要なため。この後、a β の集計フォーム (図 1 a) を認めた.それは、線維状 a β36Aβ1 42 のような孵化に生産が報告さ…
Discussion
本研究では記述されているプロトコルには、Aβ1 42 治療後軸索成長円錐における初期現象の観察が有効になります。Aβ1 42 20 分以内の軸索の成長円錐におけるエンドサイトーシスと成長円錐の破壊処理の 1 h で観測されていた。このエンドサイトーシスによりクラスリン媒介おそらく。このプロトコルを使用して、クラスリン依存性エンドサイトーシスを抑制は、Aβ1 42 誘起成長円錐の破壊と<s…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、日本学術振興会からの研究補助金によって部分的に支持された (科研費 18 K 07389)、日本、武田科学振興財団、および小林製薬株式会社、日本。
Materials
| ddY mice | SLC | ||
| Eight-well culture slide | Falcon | 354108 | |
| poly D lysine | Wako | 168-19041 | |
| Culture medium, Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| house serum | Gibco | 26050-088 | |
| glucose | Wako | 049-31165 | |
| L-glutamine | Wako | 074-00522 | |
| 0.05% trypsin | Gibco | 25300-054 | |
| DNase I | Worthington | DP | |
| soybean trypsin inhibitor | Gibco | 17075-029 | |
| Filter with 70 µm mesh size, cell strainer | Falcon | 352350 | |
| B-27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| CO2 incubator | Astec | SCA-165DS | |
| Amyloid β1-42 | Sigma-Aldrich | A9810 | |
| paraformaldehyde | Wako | 162-16065 | |
| sucrose | Wako | 196-00015 | |
| Aqueous mounting medium, Aqua-Poly/Mount | polysciences | 18606-20 | |
| Inverted microscope A | Carl Zeiss | Axio Observer Z1 | Connected with AxioCam MRm, Heating Unit XL S, CO2 Module S1, and TempModule S1 |
| Objective Plan-Apochromat 20x | Carl Zeiss | 420650-9901 | |
| Objective Plan-Apochromat 63x | Carl Zeiss | 440762-9904 | |
| Objective, CFI Plan Apo Lambda 40X | Nikon | ||
| anti-MAP2 IgG | Abcam | ab32454 | |
| anti-tau-1 IgG | Chemicon | MAB3420 | |
| anti-amyloid β antibody | IBL | 10379 | clone 11A1 |
| normal goat serum | Wako | 143-06561 | |
| bovine serum albumin | Wako | 010-25783 | |
| t-octylphenoxypolyethoxyethanol | Wako | 169-21105 | |
| goat anti-mouse IgG conjugated with AlexaFluor 594 | Invitrogen | A11032 | |
| goat anti-rabbit IgG conjugated with AlexaFluor 488 | Invitrogen | A11029 | |
| hot plate | NISSIN | NHP-M30N | |
| cover glass | Fisher Scientific | 12-545-85 | |
| 35 mm dish | IWAKI | 1000-035 | |
| Silicone RTV | Shin-Etsu | KE42T | |
| hand punch | Roper Whitney | No. XX | |
| Fluorescence membrane probe, FM1-43FX | Invitrogen | F35355 | |
| Ca2+– and Mg2+-free Hanks' balanced salt solution | Gibco | 14175-095 | |
| Transfection solution, Nucleofector solution | Lonza | VPG-1001 | |
| Electroporator, Nucleofector I | Amaxa | ||
| Inverted microscope B | Keyence | BZ-X710 | |
| Image software, ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ |
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Citer Cet Article
Kuboyama, T. Visualizing Axonal Growth Cone Collapse and Early Amyloid β Effects in Cultured Mouse Neurons. J. Vis. Exp. (140), e58229, doi:10.3791/58229 (2018).