Visualizar el colapso del cono de crecimiento Axonal y temprano efectos β amiloidea en las neuronas de ratón cultivadas
Summary
Aquí se presenta un protocolo para investigar los efectos tempranos de la amiloide-β (Aß) en el cerebro. Esto demuestra que Aβ induce la endocitosis mediada por clatrina y colapso de conos de crecimiento axonal. El protocolo es útil en el estudio de efectos tempranos de Aβ en conos de crecimiento axonal y puede facilitar la prevención de la enfermedad de Alzheimer.
Abstract
Amiloide-β (Aβ) provoca deterioro de memoria en la enfermedad de Alzheimer (AD). Aunque la terapéutica se ha demostrado para reducir los niveles de Aß en el cerebro de pacientes con EA, estos no mejoran las funciones de memoria. Ya agregados de Aβ en el cerebro antes de la aparición de deficiencias de memoria, puede ser ineficaz para el tratamiento de pacientes con EA que ya exhiben déficits de memoria contra Aβ. Por lo tanto, aguas abajo de señalización debido a la deposición de Aβ debe bloquearse antes del desarrollo de AD. Aβ induce la degeneración axonal, conduciendo a la interrupción de las redes neuronales y problemas de memoria. Aunque hay muchos estudios sobre los mecanismos de la toxicidad Aβ, la fuente de la toxicidad Aβ sigue siendo desconocida. Para ayudar a identificar la fuente, proponemos un nuevo protocolo que utiliza la microscopia, transfección génica y celular directo imágenes para investigar cambios tempranos causados por Aβ en conos de crecimiento axonal de neuronas cultivadas. Este protocolo reveló que Aβ induce la endocitosis mediada por clatrina en conos de crecimiento axonal seguida por colapso del cono de crecimiento, demostrando que la inhibición de la endocitosis previene toxicidad Aβ. Este Protocolo será útil en el estudio de los efectos tempranos de Aß y puede llevar a más eficiente y preventivo Tratamiento AD.
Introduction
Depósitos de amiloide-β (Aβ) se encuentran en el cerebro de pacientes con enfermedad de Alzheimer (EA) y se consideran una causa crítica de AD1 redes neuronales, que conduce a deficiencias de memoria2,3,4. Muchos candidatos de clínicos de drogas han demostrado para prevenir con eficacia la producción de amiloide-β (Aβ) o eliminar los depósitos Aβ. Sin embargo, no han logrado mejorar la función de memoria en pacientes de AD5. Aβ ya se deposita en el cerebro antes de la aparición de deficiencias de memoria6; por lo tanto, disminuyendo los niveles de Aß en el cerebro de los pacientes que exhiben problemas de memoria pueden ser ineficaces. Depósito de Aß está presente en pacientes con EA preclínicos; sin embargo, estos pacientes rara vez presentan neuronal degeneración y memoria déficit de6. Hay un desfase de tiempo entre el depósito de Aß y debilitaciones de la memoria. Por lo tanto, una estrategia fundamental para la prevención de la EA está bloqueando la toxicidad Aβ señalización durante las etapas tempranas de la EA, antes del desarrollo de déficits de la memoria. Depósito de Aβ induce axon degeneración7,8,9,10,11,12,13, que puede conducir a una interrupción de redes neuronales y debilitación permanente de la función de memoria. Muchos estudios han investigado los mecanismos de la toxicidad Aβ; por ejemplo, los axones degenerados de los cerebros de ratones AD han demostrado aumentaron autofagia14. Activación de la calcineurina se ha divulgado como un posible mecanismo de degeneración axonal inducida por Aß15; sin embargo, la activación directa de la degeneración axonal sigue siendo desconocido.
Este estudio se centra en el colapso de las terminaciones axonales llamados conos de crecimiento. El colapso de conos de crecimiento axonal puede ser causado por repelentes de crecimiento axonal, como Semaforina 3A y efrina-A516,17,18,19,20. Colapso-como distróficos terminales axonales se han observado en los cerebros de pacientes de AD21,22. Además, un fallo de funcionamiento de cono de crecimiento puede provocar degeneración axonal23. Sin embargo, se desconoce si Aβ induce colapso del cono de crecimiento. Por lo tanto, este estudio presenta un nuevo protocolo para observar los primeros efectos del Aß en neuronas cultivadas e investigar el colapso del cono de crecimiento inducida por Aß.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo descrito en este estudio permitió la observación de fenómenos tempranos en conos de crecimiento axonal Aβ1-42 postratamiento. Aβ1-42 inducida por endocitosis en conos de crecimiento axonal dentro de 20 min, y colapso del cono de crecimiento se observó dentro de 1 h de tratamiento. Esta endocitosis fue probablemente mediada por clatrina. Mediante este protocolo, se confirmó la inhibición de la endocitosis mediada por clatrina para evitar el colapso del cono de Aβ1-42-inducida por el crecimiento y deg…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue parcialmente apoyado por becas de investigación de JSP (KAKENHI 18K 07389), Japón, Fundación Ciencia de Takeda, Japón y Kobayashi Pharmaceutical Co., Ltd., Japón.
Materials
| ddY mice | SLC | ||
| Eight-well culture slide | Falcon | 354108 | |
| poly D lysine | Wako | 168-19041 | |
| Culture medium, Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| house serum | Gibco | 26050-088 | |
| glucose | Wako | 049-31165 | |
| L-glutamine | Wako | 074-00522 | |
| 0.05% trypsin | Gibco | 25300-054 | |
| DNase I | Worthington | DP | |
| soybean trypsin inhibitor | Gibco | 17075-029 | |
| Filter with 70 µm mesh size, cell strainer | Falcon | 352350 | |
| B-27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| CO2 incubator | Astec | SCA-165DS | |
| Amyloid β1-42 | Sigma-Aldrich | A9810 | |
| paraformaldehyde | Wako | 162-16065 | |
| sucrose | Wako | 196-00015 | |
| Aqueous mounting medium, Aqua-Poly/Mount | polysciences | 18606-20 | |
| Inverted microscope A | Carl Zeiss | Axio Observer Z1 | Connected with AxioCam MRm, Heating Unit XL S, CO2 Module S1, and TempModule S1 |
| Objective Plan-Apochromat 20x | Carl Zeiss | 420650-9901 | |
| Objective Plan-Apochromat 63x | Carl Zeiss | 440762-9904 | |
| Objective, CFI Plan Apo Lambda 40X | Nikon | ||
| anti-MAP2 IgG | Abcam | ab32454 | |
| anti-tau-1 IgG | Chemicon | MAB3420 | |
| anti-amyloid β antibody | IBL | 10379 | clone 11A1 |
| normal goat serum | Wako | 143-06561 | |
| bovine serum albumin | Wako | 010-25783 | |
| t-octylphenoxypolyethoxyethanol | Wako | 169-21105 | |
| goat anti-mouse IgG conjugated with AlexaFluor 594 | Invitrogen | A11032 | |
| goat anti-rabbit IgG conjugated with AlexaFluor 488 | Invitrogen | A11029 | |
| hot plate | NISSIN | NHP-M30N | |
| cover glass | Fisher Scientific | 12-545-85 | |
| 35 mm dish | IWAKI | 1000-035 | |
| Silicone RTV | Shin-Etsu | KE42T | |
| hand punch | Roper Whitney | No. XX | |
| Fluorescence membrane probe, FM1-43FX | Invitrogen | F35355 | |
| Ca2+– and Mg2+-free Hanks' balanced salt solution | Gibco | 14175-095 | |
| Transfection solution, Nucleofector solution | Lonza | VPG-1001 | |
| Electroporator, Nucleofector I | Amaxa | ||
| Inverted microscope B | Keyence | BZ-X710 | |
| Image software, ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ |
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