提出了一种 microbioreactor 系统在不同条件下并行运行48平行细胞培养的详细协议。介绍了细胞培养过程、收获和随后的抗体效价分析。
自动化微型生物反应器 (15 毫升) 可以是细胞培养工程师的一个有用的工具。它们有助于同时执行多种实验条件, 同时尽量减少潜在的过程变异性。这种方法的应用包括: 克隆筛选, 温度和 pH 值转移, 培养基和补充优化。此外, 小反应器体积有利于大型实验设计, 研究范围广泛的条件。这使得上游过程在放大之前能够得到显著的优化, 因为时间和经济上的限制, 实验的范围更有限。自动化微型生物反应器系统提供了不同的优势比传统的小型细胞培养单位, 如摇瓶或微调烧瓶。然而, 在试点规模过程中, 必须注意确保这些优势得到实现。在谨慎运行的情况下, 系统可以实现高水平的自动化, 可以通过编程的方法来运行 DOE 的变量, 并且可以减少与营养分析仪或单元格计数器集成时的采样时间。在这里提出的专家派生启发式算法的集成, 与目前的自动化微型生物反应器实验可以减少常见的陷阱, 阻碍有意义的结果。在极端情况下, 如果不遵守此处规定的原则, 就会导致设备损坏, 需要昂贵的修理。此外, microbioreactor 系统具有小的培养量, 使得细胞培养条件难以表征。批量模式养殖过程中取样的数量和数量有限, 因为操作卷不能低于10毫升。该方法将讨论微型生物反应器系统的优缺点。
单克隆抗体 (抗体) 在11975年首次在小鼠杂交瘤细胞中产生。自那时以来, 重组蛋白生产的发展已经发生, 以人性化的抗体提高体内的安全性和功效2,3,4。大多数重组蛋白生产过程中都使用中国的仓鼠卵巢 (CHO) 细胞, 以方便他们可以适应血清游离培养基, 他们的能力生产蛋白质具有类似的后转化修改, 以先天的人类蛋白质和他们的可靠性作为宿主细胞5,6。
需求正在增长, 以提供更快的产品, 并为更大的病人人口与一致的质量。除了经济上的好处, 抗体治疗的疾病汇辑正在增加, 现在包括自身免疫性疾病、移植后并发症、关节炎和癌症7。现代商业单克隆生产线的平均产量通常在5-6 克/升范围内, 并持续上升5。部分, 这是通过 CHO 细胞工程和改进的生产线筛选使用高通量生物反应器8。然而, 蛋白质生产的大部分增长归因于过程改进, 包括培养基优化、细胞培养条件和强化喂养策略7、9、10的进步。补充营养不仅对细胞生长有重要意义, 而且对高质量蛋白质的高效生产也是必不可少的。此外, 细胞需要化学计量添加特定的营养素, 需要进一步了解喂养策略优化6,11。传统的优化方法包括单独的介质成分滴定和混合设计的介质混合。然而, 这些方法耗费时间, 劳力密集, 涉及与人为错误12,13相关的风险。
媒体优化研究以前依赖于摇瓶和 1-2 L 生物反应器, 这可能是昂贵的原材料和人力资本。微型也被使用, 但这些方法提供有限的可伸缩性。此外, 这可能仍然需要多个耗时的运行, 引入批处理可变性, 这掩盖了媒体组成和喂养策略14、15、16造成的 CQA 变异性。因此, 需要高吞吐量和高度一致的平行生物反应器系统出现17,18,19,20。
由于传统的工作台式生物反应器 (0.5-5 升) 的运行与大量费用相关, microbioreactors 提供了一种成本降低的替代品, 用于评估生物学衍生药物的生产。21台级搅拌罐反应器是可靠的, 通过感官阵列提供密集的数据。反馈控制系统便于操作的监督。但是, 装配、校准、清洗、人工成本、基板成本和灭菌要求使得工作台规模的搅拌罐生物反应器成本高昂, 劳动密集型操作。摇瓶和微量滴定板消除了与大型生物反应器相关的一些成本和劳动问题, 但是这些替代品提供了对加工条件的微弱控制, 并产生了低密度数据, 通常只有终点测量。22
另外, microbioreactors 利用一个小的工作量, 为细胞线和上游过程的发展提供了一种尺度上的方法。microbioreactor 实验的规模可以通过降低电力、基板、人工、空间和公用事业的利用率来显著降低运行成本。23 Microbioreactors 就像摇瓶, 因为他们很容易处理由于他们的大小, 但他们保留传统的台式生物反应器的优势, 通过在线反馈控制 pH, 温度, 溶解氧, 酸/碱消耗以及其实时数据输出的质量参数, 包括气体组成。Microbioreactor 规模允许高通量筛选能力, 这对于克隆选择和过程开发是有用的。24
先进的微型生物反应器已被证明是 CHO 细胞培养过程表征和发展的有效工具18。在这里, 一个自动化的 ambr15 系统, 包括 48 microbioreactors 并行, 已被证明是可比的大型搅拌坦克反应器在规模上的研究,25使用的方式类似于以前的工作, 优化媒体CHO-DG44 细胞系的组成, 形成嵌合体的模型 IgG16。比较了不同培养基条件对生长和效价的影响, 并进行了分析。本文提出了 microbioreactor 系统运行的一般准则, 并对粗介质样品进行了分析。
正确、高效地运行自动化微生物反应器系统, 需要及时执行多个自动化步骤。运行该系统的最重要的部分之一是编程软件。如果在编写程序时出现错误, 在实验中会出现严重的错误, 可能导致过程中发生意外的变化、喂养策略、取样策略或最终产品质量, 这可能会使研究结果无效。运行该系统的另一个重要方面是正确地放置和拧紧卡板, 以确保正确的控制。最常见的迹象表明, 钳板已收紧不均匀, 是意外的变化, 在做测量的船只 1, 6, 7 和 12 (角落反应堆船只)。整体不稳定性表明, 在钳板的气体入口线上的垫圈松动。此方案可能会妨碍到达 “设置” 点。另一个常见的陷阱, 以避免当启动一个实验是让细胞坐太长时间在接种步骤, 使他们定居。细胞花在坐的时间越少, 就越少的几率逐渐降低, 接种细胞计数会随着反应堆血管的推移而增加, 从而导致明显的偏差, 不知不觉地损害研究结果。最好在多个阶段接种疫苗,即将每个培养站一个接一个地接种, 然后在中间停用步骤, 这样细胞就不会在接种盘中停留超过15分钟。
关于日常使用, 保持不孕是至关重要的。虽然该系统是在一个生物安全柜, 不育是不保证, 由于频繁的运动进出的引擎盖。因此, 所有的东西, 在引擎盖必须喷洒70% 投资促进机构。其次, 必须确保在养殖过程中发生最小的起泡现象;介质可以堵塞气体和排气线, 导致钳板的损坏, 甚至是下面的核心部件。在任何微生物反应器方案设计中, 预防性抗泡沫添加步骤都是至关重要的。如果出现 “泡沫出”, 将有利于遵循制造商的清洁协议, 并可以防止永久性损坏的夹具板。或者, 使用非旋流器的船只可能有利于较低的细胞密度或当运行在分批模式, 因为更高的表面体积比, 使有效的氧气, 即使缺乏 sparger。然而, 非旋流器血管可能对高细胞密度或灌注培养不太有用, 因为头部空间不足以跟上不断增长的氧气消耗。
microbioreactor 系统提供了许多优点, 因为它能使多个受控文化在小规模平行运行, 比摇瓶更有控制权。17因此, 该系统促进了筛选研究的执行, 进行了高通量克隆研究和转染研究。自动化的液体处理也减少了分析师对分析师的变异性, 同时也减少了训练有素人员的繁琐和耗费时间的劳动。虽然该系统有几个优点, 但还有几个关键缺点需要考虑。首先, 15 毫升的养殖量极大地限制了过程取样和最终收获材料, 而且最近已有多种替代小型生物反应器 (多达500毫升)。该系统最近的一个进展是将自动化微型生物反应器与 BioProfile FLEX 2 分析仪集成到新的生物医学中, 通过减少细胞密度和养分分析样本量来减轻过程取样问题。.好处可以包括快速设置和几乎没有清洁, 导致操作节省, 但一次性单位的成本应考虑到长期项目, 因为它可能比可重用的传统系统购买单位昂贵。
本文所讨论的方法主要适用于批模式单元格区域性, 但可以根据用户的需要进行修改。每个培养站都有独立的温度控制, 而在单个反应器容器的水平上, pH 值可以变化。缝匠还提供了专门设计的能源部规划软件, 以便为微型生物反应器系统量身定做实验。使用制造商提供的新的能源部软件进行大规模的能源部研究可以帮助媒体和补充优化。虽然在这里没有使用, microbioreactor 系统也可以进行美联储批次的研究。该系统尚未优化灌注细胞培养。然而, 目前在微生物反应器系统中模拟灌注细胞培养操作的研究和试验有限。26这种方法可以通过细胞沉降来模拟高密度灌注培养。通过改变吸管插入反应器的高度, 通过优化沉淀时间, 可以去除和补充介质, 以反映丰富多彩的文化模式。有新的产品在这个发展中的地区, 可能会更好地工作, 比这里提出的系统, 如果需要灌注模式的文化。
总之, 本研究表明, 利用自动化微生物反应器和相关分析的 CHO 细胞培养操作, 以产生和表征一个模型 IgG1 单克隆抗体。强调小尺度微生物反应器在生物生产中的作用及其对细胞培养和培养基筛选的影响。虽然使用自动化小规模系统有许多优点, 但要充分实现其效益过程理解和分析特性势在必行。本研究为用户提供了使用自动化微型反应堆系统的指南, 可以根据个别的研究需要开发和改进。
The authors have nothing to disclose.
作者希望感谢斯科特琵琶提供的分析支持。CDER 关键路径计划 (CA #1-13) 提供了部分内部资金和对这项工作的支持。这一项目的部分支持是由美国食品和药物管理局生物技术产品办公室的实习/研究参与计划, 由橡树岭科学和教育研究所管理, 通过一个美国能源部与 FDA 之间的跨部门协议。
CHO DG44 Cell Line | Invitrogen | A1100001 | |
ambr 15 automated microbioreactor system | Sartorius | 001-2804 | automated micro bioreactor |
ambr 15 Cell Culture 24 Disposable Bioreactors – Sparged | Sartorius | 001-2B80 | |
1 mL disposable pipette tips, sterilized | Sartorius | A-0040 | |
5 mL disposable pipette tips, sterilized | Sartorius | A-0039 | |
24 Well deep well plates | Sartorius | A-0038 | |
1 Well plates | Sartorius | A-0068 | |
Vi-Cell XR cell counter | Beckman Coulter | 731050 | automated cell counter |
EX-CELL Antifoam (gamma irradiated) | Sigma-Aldrich | 59920C-1B | |
CD OptiCHO AGT Medium | Thermo Fisher Scientific | A1122205 | |
200 mM L-glutamine | Corning | 25-005-CV | |
100X Penicillin/Streptomycin | Corning | 30-001-CI | |
125 mL F-Bottom Shake Flasks (Sterile, Vented) | Fisher Scientific | PBV12-5 | |
125 mL glass Spinner Flasks | Corning Life Sciences Glass | 4500-125 | |
250 mL PP Conical Centrifuge Tubes (Sterile) | Nalgene (Thermo Scientific) | 376814 | |
TC20 Automated Cell Counter | BioRad Laboratories, Inc. | 1450103 | |
Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
10x PBS | Corning | 46-013-CM | |
BioProfile FLEX Analyzer | Nova Biomedical | 49418 | Nutrient Analyzer |
Octet Red 96 | Pall FortéBio | 99-0042 | Protein A Biosensor |
Protein A Dip and Read Biosensors | Pall FortéBio | 18-5010 | |
Polypropylene 96-well Microplate, F-bottom, Chimney-style, Black | Greiner Bio-One | 655209 |