Ein detailliertes Protokoll für den gleichzeitigen Betrieb von 48 parallel Zellkulturen unter unterschiedlichen Bedingungen in einem Microbioreactor-System wird vorgestellt. Zellprozess Kultur, Ernte und anschließende Antikörper-Titer Analyse werden beschrieben.
Automatisierte Microscale Bioreaktoren (15 mL) können ein nützliches Werkzeug für Zelle Kultur Ingenieure sein. Sie ermöglichen die gleichzeitige Ausführung von eine Vielzahl von experimentellen Bedingungen bei gleichzeitiger Minimierung der möglichen prozessvariabilität. Anwendungen dieses Ansatzes sind: Screening, Temperatur- und pH-Verschiebungen, Medien und Ergänzung Optimierung zu klonen. Darüber hinaus eignen sich die kleinen Reaktor Bände für große Design of Experiments, das eine Vielzahl von Bedingungen zu untersuchen. Dies ermöglicht vorgelagerten Prozesse deutlich vor Skalierung optimiert werden wo Experimente mehr Umfang ist durch Zeit und wirtschaftlichen Zwängen begrenzt. Automatisierte Microscale bioreaktorsystem bieten verschiedene Vorteile gegenüber traditionellen kleinen Kultur Zelleneinheiten, wie Fläschchen schütteln oder Spinner Fläschchen. Allerdings muss im Pilotmaßstab Prozess Entwicklung erhebliche darauf geachtet werden, um sicherzustellen, dass diese Vorteile realisiert werden. Wenn mit Sorgfalt ausführen, das System kann Ebene hochautomatisierung ermöglichen, Damhirschkuh mit einer höheren Anzahl von Variablen ausführen programmiert werden und können Abtastzeit reduzieren wenn mit einem Nährstoff Analyzer oder Zelle Zähler integriert. Integration der hier vorgestellten, mit aktuellen automatisierten Microscale Bioreaktor Experimente Experte abgeleitet Heuristiken kann häufige Fehlerquellen minimieren, die aussagekräftige Ergebnisse zu behindern. Im Extremfall führt die Nichtbeachtung der Grundsätze, die hier gelegt zu Geräteschäden, die teure Reparaturen erfordert. Darüber hinaus haben die Microbioreactor Systeme kleinen Kultur-Bände, die Charakterisierung der Zelle Kulturbedingungen erschwert. Anzahl und Höhe der entnommenen Proben in-Prozess im Batch-Modus Kultur beschränkt sich wie operative Volumen unterhalb von 10 mL nicht herunterfallen können. Diese Methode wird die vor- und Nachteile von Microscale bioreaktorsystem diskutieren.
Monoklonale Antikörper (mAbs) wurden erstmals im Hybridom Mauszellen in 19751produziert. Seitdem hat eine Zunahme der Entwicklung der Produktion rekombinanter Proteine zu vermenschlichen mAbs in Vivo erhöhen die Sicherheit und Wirksamkeit2,3,4stattgefunden. Die meisten der rekombinanten Proteins Produktionsprozesse beschäftigen chinesische Hamster Eierstock (CHO) Zellen für die Leichtigkeit, mit der sie an Serum freie Medien, ihre Fähigkeit, Proteine mit ähnlichen Post-translationalen Modifikationen derjenigen eines angeborenen Menschen produzieren angepasst werden kann Protein und ihre Zuverlässigkeit als Host Zellen5,6.
Nachfrage steigt, Produkt schneller und für größere Patientengruppen in gleichbleibender Qualität zu liefern. Neben den wirtschaftlichen Vorteilen steigt das Repertoire von mAbs behandelte Krankheiten, worunter nun Autoimmunerkrankungen, Komplikationen nach Transplantation, Arthritis und Krebserkrankungen7. Durchschnittserlöse für moderne kommerzielle mAb Produktionslinien sind in der Regel im Bereich von 5-6 g/L und5steigen weiter. Dies wurde teilweise durch CHO Zelle Engineering und verbesserte Produktionslinie Screening mit hohem Durchsatz Bioreaktoren8erreicht. Jedoch sind die meisten Erhöhungen der Proteinproduktion zugeschrieben worden, um Prozessverbesserungen, einschließlich Zuführungen in Media Optimierung, Zelle Kulturbedingungen und verbesserte Fütterung Strategien7,9,10. Nährstoff-Supplementierung ist wichtig nicht nur für richtige Zellwachstum, sondern auch für die effiziente Produktion von hochwertigem Eiweiß. Darüber hinaus benötigen die Zellen den stöchiometrischen Zusatz von bestimmten Nährstoffen, erfordern zusätzliche Verständnis für die Fütterung Strategie Optimierung6,11. Traditionellen Optimierungsmethoden gehören einzelne Medien Komponente Titration und Medien mischen mit mischungsversuchspläne. Diese Methoden sind jedoch zeitaufwendig, arbeitsintensiv intensiv, und beinhalten Risiken, die mit menschlichem Versagen12,13.
Optimierung der Medienwissenschaft stützte sich zuvor auf Fläschchen schütteln und 1-2 L-Bioreaktoren, die möglicherweise zu teuer in Bezug auf Rohstoffe und Humankapital. Mikrotiterplatten wurden auch verwendet, aber diese Methoden bieten begrenzte Skalierbarkeit. Darüber hinaus kann noch mehrere zeitaufwändige Durchläufe erforderlich sein, die Variabilität von Charge zu Charge einzuführen, die die Bonitätsbeurteilung Variabilität verursacht durch Medienkomposition und Fütterung Strategie14,15,16verdeckt. Daher die Notwendigkeit für hohen Durchsatz und sehr konsequent parallel Bioreaktor Systeme entstanden17,18,19,20.
Mit der erheblichen Aufwand für den Betrieb des traditionellen Tischwaage Bioreaktoren (0,5-5 L), Microbioreactors bieten eine kostensenkende Alternative für Beurteilung der Herstellungsprozess von biologisch Drogen abgeleitet. 21 -Tischwaage gerührt-Tank Bioreaktoren sind zuverlässig und dichten Daten über sensorische Arrays. Regelungstechnik ermöglichen für die einfache Kontrolle der Betrieb. Allerdings machen die Montage, Kalibrierung, Reinigung, Arbeitskosten, substratkosten und sterilisationsanforderungen Tischwaage gerührt-Tank Bioreaktoren teuer und arbeitsintensiv zu bedienen. Fläschchen schütteln und Mikrotiter-Platten entfernen einen Teil der Kosten und Arbeits-Probleme im Zusammenhang mit größeren Maßstab Bioreaktoren, aber diese Alternativen bieten schwach Steuerungsmöglichkeiten Verarbeitungsbedingungen und niedriger Dichte Daten, oft nur Endpunkt Messungen zu produzieren. 22
Alternativ nutzen Microbioreactors eine kleine Arbeitsvolumen um einen Herunterskalieren Ansatz für Zell-Linie und vorgelagerten Prozessentwicklung bieten. Das Ausmaß der Microbioreactor Experimente kann die laufenden Kosten durch niedrigere Auslastung der macht, Substrat, Arbeit, Raum und Dienstprogramme erheblich vermindern. 23 Microbioreactors sind, wie Fläschchen schütteln, sie einfach sind in der Handhabung wegen ihrer Größe, aber sie die Vorteile der traditionellen Tischwaage Bioreaktoren durch ihre Online-Feedback-Kontrolle von pH, Temperatur behalten, Sauerstoff und Säure/Base aufgelöst Verbrauch sowie ihre Daten in Echtzeit Ausgabe der Qualitätsparameter einschließlich Gaszusammensetzung. Microbioreactor Skala ermöglicht für Hochdurchsatz-Screening-Fähigkeit, die nützlich für Auswahl und Prozessentwicklung Klon sein kann. 24
Die erweiterte Microscale Bioreaktor hat gezeigt, ein wirksames Instrument zur CHO Zelle Kultur Prozess Charakterisierung und Entwicklung18sein. Hier eine automatisierte ambr15-System, bestehend aus 48 Microbioreactors parallel, die nachweislich vergleichbar mit klassischen gerührt Tank Reaktoren in Scale-up Studien,25 diente in gewissem Sinne analog zu früheren Arbeiten, die die Medien optimiert Komposition für eine CHO-DG44-Zell-Linie produziert ein Modell Chimären IgG16. Die Auswirkungen der unterschiedlichen Medien Bedingungen auf Wachstum und Titer wurden verglichen und analysiert. In diesem Papier wurde eine allgemeine Richtlinie, führen Sie das Microbioreactor System und die Analyse von Proben, grobe Medien vorgestellt.
Die automatisierte Mikro bioreaktorsystem ordnungsgemäß ausgeführt und effizient beinhaltet die termingerechte Ausführung von mehreren automatisierten Schritten. Eines der wichtigsten Teile der Ausführung des Systems ist die Software programmieren. Wenn es ein Fehler beim Schreiben des Programms, werden schwerwiegende Fehler in das Experiment, das unerwartete Veränderungen im Prozess, Fütterung, Strategie, Probenahmestrategie oder Qualität des Endprodukts, die die Ergebnisse der Studie entkräften kann führen kann. Ein weiterer wichtiger Aspekt für den Betrieb des Systems ist es, und ziehen die Klemmplatte korrekt um ordnungsgemäße Kontrolle zu gewährleisten. Die häufigste Indikation der Klemmplatte ungleichmäßig angezogen worden ist unerwartete Variationen in Messungen für Schiffe 1, 6, 7 und 12 (Ecke Reaktordruckbehälter). Alles in allem zeigt Instabilität eine Lockerung der Dichtungen am Einlass Gasleitungen in der Klammerplatten. Dieses Szenario kann behindern die-Sollwert zu erreichen. Ein weiterer Fallstrick zu vermeiden, wenn ein Experiment starten die Zellen lässt sitzen zu lange während der Impfung Schritt, wodurch sie zu begleichen. Weniger Zeit die Zellen sitzen, schadet desto geringer die Chance gibt, dass immer niedrigere Inokulum zellenzahlen chronologisch die Reaktordruckbehälter hinzugefügt werden die deutliche Tendenz, dass unwissentlich induzieren kann Studienergebnisse. Es ist besser, in mehreren Stufen zu impfen, d.h. impfen jede Kultur-Station mit Pause Schritte dazwischen, so dass die Zellen nicht in der Impfung Platte länger als 15 Minuten sitzen.
Zum täglichen Gebrauch, die Aufrechterhaltung der Sterilität ist von entscheidender Bedeutung. Obwohl das System in einem biologischen Sicherheitsschrank ist, garantiert Sterilität nicht durch häufige Bewegung innerhalb und außerhalb der Haube. Daher muss alles, was in der Haube geht mit 70 % IPA gesprüht werden. Zweitens ist es wichtig, um sicherzustellen, dass minimal Schäumen während der Kultur auftritt; Medien können verstopfen, Vergasung und Auspuff Linien, führt zur Beschädigung der Klemmplatte und sogar Kernkomponenten unten. Präventive Anti-Schaum-Zusatz Schritte sind in jedes Mikro Bioreaktor Programmdesign entscheidend. Im Falle einer “Schaum,” es wäre von Vorteil, die Hersteller Reinigung Protokoll zu folgen und kann bleibende Schäden der Klammerplatten verhindern. Alternativ kann Einsatz nicht sparged Schiffe von Vorteil sein für geringeren Zelldichten oder wenn im Batch-Modus ausgeführt, da höhere Oberfläche zu Volumen-Verhältnis effiziente Sauerstoff auch mit Mangel eine Sparger ermöglicht. Jedoch nicht sparged Schiffe nicht nützlich für hohe Dichte oder Perfusion Zellkulturen möglicherweise der Kopfraum zu halten mit den wachsenden Verbrauch von Sauerstoff Kulturen nicht ausreicht.
Es gibt zahlreiche Vorteile des Microbioreactor-Systems, da mehrere kontrollierte Kulturen in einem kleinen Maßstab mit mehr Kontrolle als Fläschchen schütteln parallel ausgeführt werden können. 17 darum, das System erleichtert die Ausführung von screening-Studien, tut, Hochdurchsatz-Klon und Transfektion Studien. Automatisierte Handhabung von Flüssigkeiten reduziert auch Analyst-Analyst Variabilität bei gleichzeitiger Minimierung gleichzeitig mühsame und zeitintensive Arbeit für geschultes Personal. Zwar gibt es das System hat mehrere Vorteile, gibt es einige wesentliche Nachteile, die berücksichtigt werden sollten. Erstens ein kulturvolumen von 15 mL wesentlich einschränkt, Inprozess-Probenahme und Schlussernte Material und mehrere alternative kleinen Bioreaktoren (bis zu 500 mL) haben vor kurzem vorhanden geworden. Eine aktuelle Weiterentwicklung des Systems ist die Integration von automatisierten Microscale Bioreaktor mit dem BioProfile FLEX 2-Analyzer aus Nova Biomedizin, die im Prozess-Sampling-Thema mildert durch Reduzierung Probenvolumen für Dichte und Nährstoff Zellanalyse . Vorteile können schnelle Einrichtung und praktisch keine Reinigung führt zu Einsparungen, aber die Kosten für die verfügbaren Einheiten für langfristige Projekte berücksichtigt werden sollten, wie es die Einheiten als die herkömmlichen Mehrwegsystemen kaufen teurer sein kann.
In diesem Artikel beschriebene Methode eignet sich in erster Linie für die Zellkultur Batch-Modus, aber kann je nach den Bedürfnissen des Benutzers geändert werden. Jede Kultur Station hat unabhängige Steuerung der Temperatur, während auf der Ebene der einzelnen Reaktordruckbehälter und pH-Wert variiert werden können. Sartorius bietet auch DoE Planungssoftware speziell für die Experimente ermöglichen für die Mikro bioreaktorsystem angepasst werden. Groß angelegte DoE Studien mit der neuen DoE-Software des Herstellers können helfen in Medien und Optimierung zu ergänzen. Obwohl hier nicht verwendet, kann das Microbioreactor-System auch fed Batch Studien. Das System hat noch nicht für Zellkulturen Durchblutung optimiert. Allerdings gab es begrenzte Studien und Tests, Perfusion Zelle Kultur Betrieb im aktuellen Mikro bioreaktorsystem zu imitieren. 26 diese Methode kann geändert werden, um high-Density Perfusion Kulturen durch die Zelle, die Abrechnung zu imitieren. Durch Variation der Höhe das Pipettieren in den Reaktor eingefügt ist und durch die Optimierung der Einschwingzeit können die Medien entfernt und wieder aufgefüllt, Fülle Spiegelmodus Kultur. In diesem dritten Bereich, die möglicherweise besser als das System hier vorgestellten funktionieren Wunsch Perfusion Modus der Kultur gibt es neue Produkte.
Zusammenfassend lässt sich sagen diese Studie veranschaulicht die Verwendung von automatisierten Mikro-Bioreaktoren und verbundenen analytischen für CHO Zelle Kultur Operationen charakterisieren einen Modell IgG1 monoklonalen Antikörper zu produzieren. Er betont die Rolle kleinen Mikro-Bioreaktoren im Bioprozess Fertigungs- und ihre Auswirkungen auf die Zellentwicklung Kultur und Medien-Screening. Zwar gibt es viele Vorteile bei der Verwendung einer automatisierten kleinen Systems, um in vollem Umfang realisieren ihre Vorteile Prozessverständnis und analytische Charakterisierung ist zwingend erforderlich. Diese Studie bietet dem Benutzer eine Richtlinie für die Verwendung eines automatisierten Microscale Reaktor-System, das entwickelt und pro einzelnen Forschungsbedarf verbessert werden kann.
The authors have nothing to disclose.
Die Autoren möchten Scott Lute für die analytische Unterstützung danken, die sie zur Verfügung gestellt. Teilweise interne Finanzierung und Unterstützung für diese Arbeit wurde von dem CDER kritische Pfad Programm bereitgestellt (CA #1-13). Dieses Projekt wurde teilweise unterstützt durch einen Termin, um das Praktikum/Teilnahme Forschungsprogramm an der Biotechnologie Büroartikel, US Food and Drug Administration, verwaltet vom Oak Ridge Institut für Wissenschaft und Bildung durch eine Interinstitutionelle Vereinbarung zwischen dem U.S. Department of Energy und FDA.
CHO DG44 Cell Line | Invitrogen | A1100001 | |
ambr 15 automated microbioreactor system | Sartorius | 001-2804 | automated micro bioreactor |
ambr 15 Cell Culture 24 Disposable Bioreactors – Sparged | Sartorius | 001-2B80 | |
1 mL disposable pipette tips, sterilized | Sartorius | A-0040 | |
5 mL disposable pipette tips, sterilized | Sartorius | A-0039 | |
24 Well deep well plates | Sartorius | A-0038 | |
1 Well plates | Sartorius | A-0068 | |
Vi-Cell XR cell counter | Beckman Coulter | 731050 | automated cell counter |
EX-CELL Antifoam (gamma irradiated) | Sigma-Aldrich | 59920C-1B | |
CD OptiCHO AGT Medium | Thermo Fisher Scientific | A1122205 | |
200 mM L-glutamine | Corning | 25-005-CV | |
100X Penicillin/Streptomycin | Corning | 30-001-CI | |
125 mL F-Bottom Shake Flasks (Sterile, Vented) | Fisher Scientific | PBV12-5 | |
125 mL glass Spinner Flasks | Corning Life Sciences Glass | 4500-125 | |
250 mL PP Conical Centrifuge Tubes (Sterile) | Nalgene (Thermo Scientific) | 376814 | |
TC20 Automated Cell Counter | BioRad Laboratories, Inc. | 1450103 | |
Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
10x PBS | Corning | 46-013-CM | |
BioProfile FLEX Analyzer | Nova Biomedical | 49418 | Nutrient Analyzer |
Octet Red 96 | Pall FortéBio | 99-0042 | Protein A Biosensor |
Protein A Dip and Read Biosensors | Pall FortéBio | 18-5010 | |
Polypropylene 96-well Microplate, F-bottom, Chimney-style, Black | Greiner Bio-One | 655209 |