Microbioreactor 시스템에 다양 한 조건에서 48 병렬 세포 배양의 동시 작업에 대 한 자세한 프로토콜 제공 됩니다. 셀 문화 과정, 수확 및 후속 항 체 titer 분석을 설명 합니다.
자동된 눈금 bioreactors (15 mL) 세포 문화 엔지니어를 위한 유용한 도구 수 있습니다. 그들은 잠재적인 프로세스 변화를 최소화 하면서 다양 한 실험 조건의 동시 실행을 촉진 한다. 이 방법의 응용: 심사, 온도 및 pH 변화, 미디어 및 보충 최적화 복제. 또한, 작은 원자로 볼륨에 큰 디자인의 실험 조건의 넓은 범위를 조사에 도움이 되는. 이로써 업스트림 프로세스가 크게 확장 하기 전에 최적화 실험 범위 시간과 경제적인 제약 때문에 더 제한 됩니다. 자동된 미 생물 시스템 전통적인 작은 규모에 비해 다양 한 장점을 쉐이크 플라스 크 또는 회전자 플라스 크 등의 셀 문화 단위를 제공합니다. 그러나, 파일럿 규모 중 프로세스 개발 중요 한 배려는 이러한 이점을 실현 되도록가지고 한다. 관리와 실행, 시스템 높은 수준의 자동화를 사용할 수 있습니다 변수의 높은 숫자 미상의 실행 프로그램 될 수 있다, 샘플링 시간을 줄일 수 있습니다 영양소 분석기 또는 셀 카운터와 통합 될 때. 여기, 현재 자동화 된 미 생물 실험으로 제시 하는 전문가 파생 휴리스틱의 통합 의미 있는 결과 방해 하는 일반적인 함정을 최소화할 수 있습니다. 극단, 여기 배치 원칙을 준수 하는 실패는 비싼 수리를 필요로 하는 장비 손상 발생할 수 있습니다. 또한, microbioreactor 시스템 작은 문화 볼륨 셀 문화 조건의 특성을 어렵게 만들고 있다. 샘플 프로세스에서 일괄 처리 모드 문화에서의 양과 수 운영 볼륨 10 mL가 수로 제한 됩니다. 이 메서드는 혜택 및 미 생물 시스템의 단점을 논의할 예정 이다.
단일 클론 항 체 (mAbs) 19751마우스 hybridoma 세포에서 처음 생산 되었다. 이후로, 재조합 단백질 생산의 증가 증가 vivo에서 안전 및 효능2,,34mAbs 인간적으로 자리를 차지 했다. 재조합 형 단백질 생산 프로세스의 대부분 고용 된 그들은 혈 청 자유로운 미디어, 그들의 생산 능력을 타고 난 인간의 비슷한 포스트 번역 상 수정 단백질을 적용할 수 있습니다 용이성에 대 한 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포 단백질 그리고 호스트 셀5,6으로 그들의 신뢰성.
수요가, 빠르고 일관 된 품질을 가진 큰 환자 인구에 대 한 제품을 제공 하 성장 하고있다. 경제 혜택 이외 mAbs에 의해 치료 하는 질병의 레 퍼 토리 증가, 면역 질환, 이식 후 합병증, 관절염, 그리고 암7이제 포함. 현대 상업 mAb 생산 라인에 대 한 평균 수율은 일반적으로 5-6 g/L의 범위에서 고5상승 하는. 부분적으로,이 조 세포 공학 및 높은 처리량 bioreactors8를 사용 하 여 향상 된 생산 라인 심사를 통해 성취 되었습니다. 그러나, 단백질 생산에 대부분 증가 처리 개선, 발전을 포함 하 여 미디어 최적화, 셀 문화 조건에에서 고 먹이 전략7,,910기인 되었습니다. 영양 보충 뿐만 아니라 고품질 단백질의 효율적 생산을 위한 뿐만 아니라 적절 한 세포의 성장을 위해 필수적 이다. 또한, 셀 전략 최적화6,11을 먹이 대 한 추가 이해를 필요로 특정 영양소의 화학 량 론 추가 필요 합니다. 전통적인 최적화 방법에는 개별 미디어 구성 요소 적정 및 혼합 디자인 혼합 미디어 포함 됩니다. 그러나, 이러한 방법은 시간이 걸리고, 노동 집약 되며 인간의 오류12,13와 관련 된 위험을 포함.
미디어 최적화 연구 이전 쉐이크 플라스 크와 원료 및 인적 자본 prohibitively 비싼 될 수 있는 1-2 L bioreactors에 의존. Microplates는 또한 사용 하지만이 메서드는 제한 된 확장성을 제공. 또한,이 여전히 미디어 구성 및 먹이 전략14,,1516기인 CQA 가변성을 가린다는 일괄 배치 변화를 소개 하는 여러 시간이 걸리는 실행 해야 합니다. 따라서, 높은 처리량 및 높게 일관 된 병렬 생물 시스템 등장된17,18,,1920에 대 한 필요 합니다.
전통적인 벤치 스케일 bioreactors의 작동과 관련 된 중요 한 경비 (0.5-5 L), microbioreactors는 마약을 파생 된의 생산을 생물학적으로 평가 대 한 비용 절감 대안을 제공. 21 벤치 규모 흔들 탱크 bioreactors 신뢰할 수 있는 고 감각 배열을 통해 조밀한 데이터를 제공 한다. 피드백 제어 시스템의 쉬운 감시에 대 한 수 있습니다. 그러나, 어셈블리, 교정, 청소, 노동 비용, 기판 비용, 및 살 균 요구 사항을 벤치 규모 흔들 탱크 bioreactors 비싼 및 노동 집약 작동을 확인 합니다. 쉐이크 플라스 크 및 결정 접시 비용의 일부를 제거 하 고 큰 규모 bioreactors와 관련 된 문제를 노동 하지만 이러한 대안 약한 제어 조건 처리를 제공 하 고 낮은 밀도 데이터, 종종 끝점 측정을 생산. 22
또는, microbioreactors 셀 라인 및 업스트림 공정 개발에 대 한 스케일-다운 접근을 제공 하는 작은 작업 볼륨을 사용 합니다. Microbioreactor 실험의 규모 크게 전력, 기판, 노동, 공간, 및 유틸리티의 낮은 활용을 통해 운영 비용을 줄일 수 있습니다. 23 Microbioreactors는 쉐이크 플라스 크 그들은 그들의 크기 때문에 처리 하기 위해 쉽게 하지만 그들은 pH, 온도의 그들의 온라인 피드백 제어를 통해 전통적인 벤치 규모 bioreactors의 장점을 유지 용 존 산소, 및 산/염기 처럼 소비 뿐 아니라 품질 매개 변수 가스 조성에서 포함의 그들의 실시간 데이터 출력. Microbioreactor 규모 높은 처리량 검열 기능, 클론 선택 및 공정 개발에 유용할 수 있습니다. 24
고급 미 생물 조 셀 문화 과정 특성화 및 개발18에 대 한 효과적인 도구가 될 표시 되었습니다. 여기, 자동화 된 ambr15 시스템, 병렬, 클래식 비교할 수 표시 되어 48 microbioreactors 구성 된 연구 최대 규모에서 탱크 원자로 흔들,25 미디어에 최적화 된 사전 작업을 유사한 방식으로 사용 되었다 생산 모델 공상 IgG16조 DG44 셀 라인에 대 한 구성. 성장과 titer에 다양 한 미디어 조건의 효과 비교, 되었고 분석. 이 논문에서는 microbioreactor 시스템 및 원유 미디어 샘플의 분석을 실행 하는 일반적인 지침 제시 하고있다.
자동화 된 마이크로 생물 시스템을 제대로 실행 하 고 효율적으로 여러 자동화 단계의 적시 실행을 포함 한다. 실행 하는 시스템의 가장 중요 한 부분 중 하나는 소프트웨어를 프로그래밍입니다. 프로그램을 작성 하는 동안 어떤 오류가 있는 경우에 전략, 샘플링 전략, 또는 최종 제품의 품질 연구의 결과 무효화할 수 있는 먹이 과정에서 예기치 않게 변경 될 수 있습니다 실험에서 심각한 오류가 있을. 배치 하 고 적절 한 할 제어 되도록 클램프 플레이트를 제대로 강화 시스템을 실행의 또 다른 중요 한 측면이입니다. 가장 일반적인 표시는 클램프 플레이트는 강화 하지 균등 하 게 할 측정 대, 1, 6, 7, 12 (코너 원자로 용기)에 예기치 않은 변화입니다. 전반적인 할 불안정 클램프 플레이트에 가스 입구 라인에 가스 켓을 완화 하는 나타냅니다. 이 시나리오는 할 세트 포인트에 도달 방해 수 있습니다. 셀 시키는 실험을 시작 하는 경우를 피하기 위해 또 다른 일반적인 함정이 그들 침전을 일으키는 접종 단계 동안 너무 오래 앉아. 셀 앉아, 지출 적은 시간 점차적으로 낮은 inoculum 셀 카운트는 무의식적으로 중요 한 바이어스를 일으킬 수 있는 반응 기 배를 시간순으로 추가 적은 기회 연구 결과 harms. 그것은 여러 단계에서 접종을 더 나은, 즉, 접종 한 다른 일시 중지 단계와 각 문화 역 사이 셀은 15 분 이상 접종 플레이트에 앉아 하지.
일상적인 사용, 무 균 유지에 관여 하는 것은 중요 합니다. 시스템 생물학 안전 장은 비록 불 임 후드와 자주 운동으로 인해 보장 되지 않습니다. 따라서, 후드에서 일어나는 모든 70 %IPA 살포 해야 합니다. 둘째, 그것을 최소한의 거품 발생 합니다 문화; 위해 필수적입니다. 미디어는 가스 덩어리 하 고 배기 라인, 클램프 플레이트와 아래도 핵심 부품의 손상으로 이어지는 수 있습니다. 예방 방지 거품 추가 단계는 어떤 마이크로 생물 프로그램 설계에 중요 합니다. 밖으로 “거품”의 경우 그것은 프로토콜 청소 제조 업체에 따라 도움이 될 것 이라고 하 고 클램프 플레이트의 영구적인 손상을 방지할 수 있습니다. 또는 비 sparged 선박의 사용 볼륨 비율에 더 높은 표면은 sparger의 부족으로도 효율적인 산소 수로 일괄 처리 모드에서 실행할 때 또는 낮은 세포 밀도 대 한 도움이 될 수 있습니다. 그러나, 비 sparged 배 않을 수 있습니다 높은 세포 밀도 또는 관류 문화에 대 한 유용한 머리 공간 성장 하는 산소의 소비 문화 유지 하기에 충분 하지 않습니다.
여러 제어 문화 제어 플라스 크를 흔들어 보다 작은 규모에서 병렬로 실행 되도록 하면 microbioreactor 시스템에서 제공 하는 수많은 이점이 있다. 17 그러므로 시스템 연구, 않는, 높은 처리량 복제 연구와 transfection 연구 심사의 실행을 촉진 한다. 자동된 액체 처리 또한 동시에 훈련 된 인원에 대 한 지루한과 시간 집중적인 노동 최소화 하면서 애 널 리스트 분석 가변성을 감소 시킨다. 시스템에 여러 이점이 있다, 하는 동안 고려해 야 하는 몇 가지 주요 단점이 있다. 첫째, 15 mL의 문화 볼륨 크게 제한 프로세스에서 샘플링 및 최종 수확 소재, 그리고 여러 다른 작은 규모 bioreactors (최대 500 mL) 최근에 제공 되. 시스템에 한 최근 전진은 자동된 미 생물 세포 밀도 및 영양소 분석에 대 한 샘플 볼륨을 줄여에 프로세스 샘플링 문제를 완화 하는 노바 생물에서 BioProfile 플렉스 2 분석기와의 통합 . 혜택 포함할 수 빠른 설치 및 운영 비용 절감, 아니 거의 청소 선도 costlier 재사용 가능한 기존의 시스템 보다 단위를 구입 하는 것으로 긴 기간 프로젝트에 대 한 일회용 단위 비용을 고려 한다.
이 문서에서 설명 하는 방법은 주로 배치 모드 세포 배양에 적합 하지만 사용자의 요구에 따라 수정할 수 있습니다. 각 문화 역은 온도 독립적으로 제어 및 pH 개별 원자로 혈관의 수준에서 변화 될 수 있습니다. 사토리는 또한 마이크로 생물 반응 기 시스템에 대 한 맞게 될 실험 수 있도록 특별히 설계 된 소프트웨어를 계획 하는 암컷을 제공 합니다. 대규모 DoE 연구는 제조업체에서 제공 하는 새로운 DoE 소프트웨어를 사용 하 여 미디어에 도움이 하 고 최적화를 보충 수 있습니다. 여기 사용 하지, microbioreactor 시스템 또한 먹이 배치 연구 수 있습니다. 시스템은 되지 아직 최적화 되었습니다 관류 세포 배양에 대 한. 그러나, 제한 된 연구와 실험을 현재 마이크로 생물 반응 기 시스템에서 관류 셀 문화 작업을 모방 되었습니다. 26 이 메서드는 셀 정착 하 여 고밀도 관류 문화를 모방 하기 위해 수정할 수 있습니다. 높이 피펫으로 원자로 삽입 되는 변화 및 안정화 시간을 최적화 하 여, 미디어 제거 고 문화의 거울 풍부 모드를 보충 수 있습니다. 이 개발 지역 문화의 관류 모드를 원하는 경우 여기에 제시 된 시스템 보다 더 나은 작동 하지 않을 수 있는 새로운 제품 있다.
요약 하자면,이 연구는 자동화 된 마이크로-생물 반응 기의 사용 방법을 보여 줍니다와 조 셀 문화 작업을 생성 하 고 모델 IgG1 단일 클로 널 항 체의 특성에 대 한 분석 관련. 그것은 작은 규모 마이크로-생물 반응 기 재생을 역할 bioprocess 제조 및 세포 문화 개발 및 미디어 심사에 미치는 영향을 강조 한다. 자동화 된 작은 규모의 시스템을 사용 하 여 많은 이점이 있다, 그러나 완벽 하 게 실현 하기 위해 그들의 혜택 처리 이해 하 고 분석 특성은 필수적입니다. 이 연구 개발 하 고 개별 연구 요구 당 개선 될 수 있는 자동화 된 미 반응 기 시스템을 사용 하기 위한 지침을 사용자를 제공 합니다.
The authors have nothing to disclose.
저자 스콧 류 그들이 제공 하는 분석 지원에 대 한 감사 하 고 싶습니다. 일부 내부 자금 및이 작업에 대 한 지원을 CDER 중요 경로 프로그램 (CA #1-13)에 의해 제공 되었다. 이 프로젝트는 생명 공학 제품의 사무실, 미국 식품 및 의약품 안전 청, 과학을 통해 교육에 대 한 오크 리 지 연구소에 의해 관리 인턴/연구 참여 프로그램에는 약속에 의해 부분적으로 지원 한 미국 에너지 부와 FDA 간에 부처간 합의.
CHO DG44 Cell Line | Invitrogen | A1100001 | |
ambr 15 automated microbioreactor system | Sartorius | 001-2804 | automated micro bioreactor |
ambr 15 Cell Culture 24 Disposable Bioreactors – Sparged | Sartorius | 001-2B80 | |
1 mL disposable pipette tips, sterilized | Sartorius | A-0040 | |
5 mL disposable pipette tips, sterilized | Sartorius | A-0039 | |
24 Well deep well plates | Sartorius | A-0038 | |
1 Well plates | Sartorius | A-0068 | |
Vi-Cell XR cell counter | Beckman Coulter | 731050 | automated cell counter |
EX-CELL Antifoam (gamma irradiated) | Sigma-Aldrich | 59920C-1B | |
CD OptiCHO AGT Medium | Thermo Fisher Scientific | A1122205 | |
200 mM L-glutamine | Corning | 25-005-CV | |
100X Penicillin/Streptomycin | Corning | 30-001-CI | |
125 mL F-Bottom Shake Flasks (Sterile, Vented) | Fisher Scientific | PBV12-5 | |
125 mL glass Spinner Flasks | Corning Life Sciences Glass | 4500-125 | |
250 mL PP Conical Centrifuge Tubes (Sterile) | Nalgene (Thermo Scientific) | 376814 | |
TC20 Automated Cell Counter | BioRad Laboratories, Inc. | 1450103 | |
Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
10x PBS | Corning | 46-013-CM | |
BioProfile FLEX Analyzer | Nova Biomedical | 49418 | Nutrient Analyzer |
Octet Red 96 | Pall FortéBio | 99-0042 | Protein A Biosensor |
Protein A Dip and Read Biosensors | Pall FortéBio | 18-5010 | |
Polypropylene 96-well Microplate, F-bottom, Chimney-style, Black | Greiner Bio-One | 655209 |