Summary
在这里, 我们提出了一个方法, 以产生组织特定的二进制转录系统的果蝇, 取代第一编码外显子的基因与转录驱动。CRISPR/Cas9-based 方法在被替换的基因的内生调控下放置一个 transactivator 序列, 从而促进 transctivator 表达专门在基因特定的时空模式。
Abstract
二进制转录系统是强大的遗传工具, 广泛用于可视化和操作细胞的命运和基因表达在特定群体的细胞或组织的模型有机体。这些系统包含两个组分作为分开的转基因线。一条驱动线在组织特异的促进剂/促增强剂的控制下表达转录激活物, 一个报告/效应线将一个目标基因放置在转录激活器的结合部位。饲养两个组分的动物诱导了靶基因表达的组织特异转录激活。精确的时空表达基因在靶向组织是至关重要的无偏见的解释细胞/基因活动。因此, 开发一种生成专属细胞/组织特定驱动程序线的方法是必不可少的。在这里, 我们提出了一个方法来产生高度组织特定的目标表达系统, 采用 "聚集定期 Interspaced 短回文重复/CRISPR 相关" (CRISPR/Cas) 的基因组编辑技术。在这种方法中, 限制性 Cas9 的目标是两个嵌合导向 rna (gRNA) 到特定地点的第一编码外显子的基因在果蝇基因组, 以创建双链断裂 (争端)。随后, 使用含有 transactivator 序列的外源性捐赠质粒, 细胞自主修复机械能够实现争端处理机构的同源定向修复 (HDR), 从而精确删除和替换外显子与 transactivator序列。被敲入的 transactivator 是完全地表达在被替换的基因的cis调控元素起作用的细胞。在这里提出的详细的分步协议, 以产生一个二进制转录驱动程序表达在果蝇/branchless产生的上皮/神经细胞细胞可以采取任何基因或组织特定的表达。
Introduction
基因工具箱的目标基因表达已经在果蝇中得到了很好的发展, 这使得它成为一个最好的模型系统, 以调查有关基因的功能, 涉及多种细胞过程。二进制表达系统, 如酵母Gal4/UAS (上游活化序列), 首次采用的组织特异性增强诱捕和基因 misexpression 在果蝇遗传模型1 (图 1)。该系统促进了许多技术的发展, 如基因过度表达的时空调控, misexpression, 在选定的细胞组的挖空, 以及细胞消融, 细胞标记, 细胞和分子的实时追踪在发育过程中的胚胎和组织, 沿袭追踪和马赛克分析。一些二进制转录系统, 如细菌莱克萨/莱克萨操作系统 (图 1) 和粗糙Q 系统, 是强大的基因工具, 现在广泛用于果蝇,除了原 Gal4/UAS 系统的目标基因表达1,2,3。
在这里, 我们提出了一个方法来生成高可靠的组织特定的二进制表达系统, 采用基因组编辑技术。最近在 CRISPR/Cas9 基因组编辑技术方面的进步, 使得在广泛的生物体中进行定向基因组改变的机会空前。与其他可用的基因组编辑技术相比, CRISPR/Cas9 系统成本低廉、效率高、可靠。这项技术利用细菌适应性免疫系统的组成部分:化脓链球菌的 Cas9 限制性, 创建双链断裂 (争端), 和嵌合体指南 RNA (gRNA), 它引导 Cas9 到一个特定的基因组站点目标争端4。这些细胞包含用不同途径修复争端的机器。非同源端连接 (NHEJ) 导致小的插入或删除, 以扰乱基因功能, 而同源定向修复 (hdr) 引入一个定义的定向/理想的基因组敲/敲出使用外源 HDR 捐赠者作为模板。基于 HDR 的替换策略可以有效地用于生成一个高度可靠的组织特定的二进制表达式系统, 它可以克服传统增强器陷阱方法的所有局限性。我们描述了一个循序渐进的过程, 利用 CRISPR/Cas9-based HDR 修复生成一个二进制转录驱动程序线的控制下表达的内源转录和转录后调节的果蝇基因。在本协议中, 我们演示了一个特定于branchless (bnl) 基因编码的驱动程序线的生成, 用于调节气管道上皮5的分支形态发生。在这个例子中, bnl基因的第一个编码外显子被细菌莱克萨transactivator 序列的序列所取代, 而不改变bnl基因的任何内源cis调节序列。我们表明, 该策略产生了一个bnl 莱克萨驱动程序线, spatiotemporally 控制在LexAoperator (LexAop或LexO) 下游的记者基因的表达, 完全在bnl-表达上皮细胞/间充质/神经细胞。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. gRNA 表达载体的设计与构造
- 要精确替换外显子的长定义区域, 请使用双 gRNA 方法6, 其中每个 gRNA 可以专门针对所选区域的两端。为了获得一个精确的基因特定的时空表达的驱动程序, 选择两个 gRNA 目标网站内的第一编码外显子的基因。
-
对于果蝇, 使用 flyCRISPR 最佳目标查找工具 (http://tools.flycrispr.molbio.wisc.edu/targetFinder/) 选择 gRNA 目标站点。其他可用的 CRISPR 设计工具也可以使用 , 包括优化的 CRISPR 设计工具 ( http : / / crispr . mit . edu ) , FlyCas9 ( https : / / shigen . . ac . jp / fly / nigfly / cas9 ) 和电子脆 ( www . e - crisp . org / E - CRISP ) 。
注意: gRNA 设计和克隆的以下协议是从先前描述的6、7的方法中采用的。- 将实际序列复制到联机工具中提供的框中。选择最近发布的果蝇基因组注释版本 "r_6", 在 "选择基因组" 下拉菜单中。在 "选择指南长度 (nt)" 字段中, 输入 "20"。选择以查找 "所有 CRISPR 目标", 然后单击 "查找 CRISPR 目标"。
- 通过为 "PAM" 设置 "严格" 和 "仅 NGG" 的 "最大值" 来评估所有候选 gRNA 目标。尝试选择没有任何潜在的非目标的 gRNA 站点, 或尽可能少的离目标数。使用 Doench等2014 8中描述的 web 工具选择具有潜在 "良好" 活动分数的 gRNAs。
- 同时, 确保选择注射的父飞线基因组中的 gRNA 目标中没有单核苷酸多态性 (如 X 染色体上的nos-Cas9 , BL 54591)。按照尤金·格拉茨等20157中描述的协议, 从母飞线提取基因组 DNA。PCR 放大, 大约, 500–1,000 nt 地区使用引物, 侧面的利益序列和高保真 DNA 聚合酶;序列-验证 PCR 放大产品。
-
为了生成串联 gRNA 表达式向量, 请遵循结扎无关的克隆协议6将两个 protospacer 序列引入 pCFD4 RNA 表达式向量中。请注意, 现在可以使用改进的多 gRNA 表达式向量 (pCFD5), 在这两种 sgRNAs 都是由强 U6:3 启动子9 (https://www.crisprflydesign.org) 表示的。使用 DNA 组装方法将 gRNAs 克隆到 pCFD4 向量中。
- 设计并订购用于将两个 protospacer 序列引入 RNA 表达式向量 pCFD4 (表 1A) 的正向和反向引物。如前所述6, 正向底漆包含在 pCFD4 中对应于 U6-1 启动子和 gRNA 芯的区域两侧的第一 protospacer 序列;反向底漆包含在 pCDF4 中对应于 gRNA 核和 U6-3 启动子的区域两侧的第二 protospacer 的反向补充序列。
- 并用重悬底漆到100微米与 DNase 和 RNase 无二蒸馏水 (ddH2O)。制作10微米工作浓度底漆。使用 pCFD4 质粒作为模板, 并建立 pcr 反应使用高保真聚合酶和推荐设置 pcr 反应6。
- 将放大后的产品复制到 pCFD4 中, 通过建立 BbsI 酶 pCFD4 质粒, 通过以下反应: pCFD4 质粒2–5微克, 5 ul 10x 消化缓冲液, BbsI 酶 1 ul, ddH2O 使最终体积达到 50 ul。通过轻轻地敲击管子, 将管子壁上的所有分散的水滴收集到底部, 通过简单的旋转来混合反应内容。在37摄氏度的2小时内孵化反应混合物。
- 在1% 琼脂糖凝胶上, 从步骤2和消化后的产品中运行 PCR 产品。进行电泳有足够的时间完全分离的 DNA 带。在 UV 反辐射灯下切割正确尺寸的 DNA 带, 然后使用制造商的指示 (见材料表), 用凝胶洗脱柱纯化预期的产品。PCR 产物应为 600 bp, 线性化 pCFD4 质粒应为 6.4 kb 6。
- 根据制造商的指示, 在 PCR 管中设置 DNA 组装反应 (见材料表)。
- 将组装产品的 2 ul 转换成合格的细菌 (DH5α或类似的菌株与δrecA1, δendA1), 在氨苄西林 (100 微克/毫升) 板上含有 lb (磅/安培) 琼脂板, 并孵化在37°c 过夜。请注意, DNA 组合组合可能对某些细菌菌株有毒, 但稀释组装组合可降低毒性。
- 从隔夜孵化的盘子中挑选3–4氨苄西林抗性的菌落, 在3毫升磅含有100微克/毫升氨苄西林的蚁群中接种疫苗, 并在一夜之间在37摄氏度的振动筛中生长接种细菌。在制造商的指导下, 用质粒迷你预备试剂盒从夜间培养的细菌中提取质粒 (见材料表)。
- 序列的质粒与 T3 普遍底漆, 以筛选正确的克隆包含串联 gRNA 插入。建立一个甘油库存的细菌转化为经过序列验证的 pCFD4-gRNA 在20% 甘油和存储在一个-80 °c 冷藏库供将来使用。
2. 设计和建造 HDR 捐助者
-
对于Gal4或莱克萨序列的基因组撞击, 设计一个双绞合的 HDR 供体, 其中包含 transactivator 序列, 两侧有两个同源臂。
- 使用 > 1.5 kb 左右同源臂侧翼的 gRNA 目标站点。扩展同源武器在修复过程中提高了 HDR 的效率10。
- PCR 放大从选择注射的母飞线提取的基因组 DNA (gDNA) 的同源臂 (例如, nos-Cas9 (X 染色体), BL 54591)。使用证明阅读热启动 Taq DNA 聚合酶酵素适合长时间 PCR 延长 (参见材料表)。序列验证。
- 为了避免重定向的 gRNA 到工程的轨迹, 设计的替代捐赠者, 这样的方式, gRNA 识别网站被引入外源序列中断。
注意: 为了避免改变假定的 cis 管理元素, 请始终选择编码外显子区域内的 gRNA 识别站点。 -
为生成替换卡带, 计划将 DNA 组装策略加入四段: 5 ' 和 3 ' 同源臂, 中间外源 transactivator DNA 序列, 以及线性化克隆载体主干 (例如, pUC19 或其他通常使用的克隆载体)。按照制造商的 DNA 组装指南 (见材料表), 设计合适的引物进行 PCR 扩增和组装的每个环节。并用重悬底漆到100微米与 ddH2o 制造一个10微米工作浓度底漆。使用高保真聚合酶的所有 PCR 反应。遵循以下协议:
- PCR 放大一个Gal4或莱克萨表达盒从一个可用的载体 (如, nls-LexA:p65; 理想的Gal4/LexA/QF2表达质粒可以找到, 并获得从 Addgene 等公共资源) 使用引物列于表 1B。
- 为了保留被替换的外显子的所有原始的转录和后转录章程在 transactivator 脱氧核糖核酸序列的表示, 设计盒式磁带用被编辑的基因组等位基因将表达的嵌合体 mRNAtransactivator 和基因。保留目标外显子的 5 ' 和 3 ' 末端, 以保留任何拼接信号。
- 在剩余 5 ' 编码外显子和 transactivator 序列之间加入一个 T2A 自裂解肽序列, 以防止翻译成嵌合蛋白。添加一个翻译停止密码子后, 外源 transactivator 序列 (图 5)。
- PCR 放大从选择注射的母飞线 (例如, nos-Cas9 (X 染色体), 54591 号 gDNA) 提取的基因组 DNA 中的同源臂, 使用表 1B中列出的引物。使用高保真聚合酶的所有 PCR 反应使用的系统如下: 5 ul 5x 反应缓冲器, 0.5 ul 10 毫米 dNTPs, 1.25 ul 的10微米前底漆, 1.25 微米的反向底漆, 10 ul 的模板 DNA, 0.5 ul 高保真 DNA 聚合酶, 16.25 ul ddH2O。
- 使用线性化克隆向量, 如 pUC19。现在有许多捐助者的载体。请参阅以下网站的综合列表-http://flycrispr.molbio.wisc.edu。
- 在1% 琼脂糖凝胶上运行 PCR 产品。进行电泳有足够的时间, 以确保明确分离所需的带与不希望的非特定频段 (如果有)。凝胶-净化预期的 DNA 片段。使用分光光度计测量每个纯化 DNA 片段的浓度。
- 根据制造商的指示建立 DNA 装配反应。将线性克隆向量和目标片段从步骤3和步骤4混合在下面的反应中: 1 个 ul 的线性克隆向量 (50 ng/ul), 2–3折叠超过每个目标片段, 10 ul 2x DNA 组装主混合, 带来最终反应体积到 20 ul 与 ddHc21>2o 在50摄氏度孵育1小时的反应混合物。
- 将组装产品的 2 ul 转换成合格的细菌, 在含有100微克/毫升氨苄西林的 LB/安培琼脂板上板。另外, 在板上添加 X-Gal + IPTG 以进行蓝/白筛选。
- 从隔夜孵化的盘子中摘下3–4白色的菌落, 在3毫升磅的100微克/毫升氨苄西林中接种蚁群, 并在一整夜的振动筛中生长37摄氏度。根据制造商手册 (见材料表), 用质粒迷你预备试剂盒从夜间培养的细菌中提取质粒。
- 通过 PCR 或限制消化筛选阳性菌落。
- 序列验证最终质粒的 HDR 捐赠区域。保存与正确的克隆在20% 甘油在-80 °c 转化为未来接种的细菌存量。
- PCR 放大一个Gal4或莱克萨表达盒从一个可用的载体 (如, nls-LexA:p65; 理想的Gal4/LexA/QF2表达质粒可以找到, 并获得从 Addgene 等公共资源) 使用引物列于表 1B。
3. 胚胎注射、飞行遗传学和基因组编辑的筛选
- 用质粒 maxiprep 试剂盒制备高纯度无内毒素 gRNA 表达载体以及 HDR 供体质粒 (见材料表)。
- 共注入 gRNA 表达质粒 (100 ng/ul) 和替代捐助者 (500 ng/ul) 到nos-Cas9胚胎的生殖6。注: 我们使用的是一个商业服务的注射, 但这个程序可以在实验室进行。
-
飞行遗传学和筛选 (图 2和图 3):
- 当注入的胚胎发育成成人, 交叉每一个 G0飞到平衡器苍蝇。为含有目标等位基因的染色体选择合适的平衡器。
- 麻醉 F1 的后代从每个 G0 十字在一个 CO2垫和随机挑选10-20 男性在显微镜下。将它们单独交叉到平衡器雌性, 如图 3所示。
- 当 F2 幼虫孵化时, 从每一个十字架上挑选一个 F1 的父亲, 用单飞基因组 DNA 准备协议提取 gDNA:
- 制备 gDNA 萃取缓冲器:10 毫米三氯 pH 8.2, 1 毫米 EDTA, 25 毫米氯化钠, 常温贮存。准备20毫克/毫升蛋白酶 K 库存解决方案, 并储存在冰箱。
- 将每只苍蝇放入一个1.5 毫升的微离心管中, 并给管子贴上标签。在-80 摄氏度冷藏库过夜。
- gDNA 提取缓冲液的新工作容积, 含200µg/毫升的蛋白酶 K 的最终浓度。
注意: 不要为此步骤使用旧缓冲区。 - 每飞行 10–15 s 与一个吸管尖端含有 50 ul 的挤压缓冲器不配药的液体。把剩余的缓冲器放进管子里, 混合好。孵育在37°c 为20–30分钟。
- 把管子放在95摄氏度的热量块中, 以使其不灭蛋白酶 K。
- 在 1万 x g处旋转5分钟。将制剂贮存在4摄氏度, 进行进一步的 PCR 分析。
- 使用相同的方法来准备 gDNA 从nos-Cas9飞, 这是一个负控制。执行三步 PCR 为基础的屏幕, 以确定正确的 "结束" HDR (图 2,图 5) 使用 gDNA 的每个 F1 男性作为模板5。使用 1 ul 的 DNA 准备在以下 pcr 反应系统:10 ul 的 2x pcr 大师混合染料, 1 ul 的每一个底漆 (10 微米), 1 ul 的 dna 模板, 7 ul ddH2O。
- 如图 5A所示, 使用引物 fwd1 和 rev1 进行 PCR, 以筛查是否存在插入或替换;使用 fwd2 和 rev2 引物进行 PCR, 验证 3 ' 地区的插入或替换;使用引物 M13F 和 rev3 进行 PCR 检查 "端入" HDR (表 1C)。
- 保持飞行线与确认结束的 HDR 和建立平衡的股票从 F2 一代。Outcross 的平衡器再次飞行, 以消除任何意外突变的其他染色体。
-
从已建立的股票中制备高质量的 gDNA, 用于扩增长 PCR (> 800–1,000 nt) 扩增子, 高保真 Taq 聚合酶和完全序列验证从工程基因组区域获得的 amplicons。或者, 使用先前描述的粗 gDNA 提取物放大较短的 (< 800 nt), 重叠的 PCR 产品序列验证编辑的基因组。使用以下协议准备好质量果蝇基因组 DNA:
- 在一个1.5 毫升的离心管中放置大约25只成年苍蝇, 并在-20 摄氏度或-80 °c 冷藏库中冷冻至少1小时。
- 添加 250 ul 溶液 A (pH 9.0 三盐酸0.1 米, EDTA 0.1 米, SDS 1%)。
- 用离心管中的均质杵融汇苍蝇, 把管子放在冰上。
- 孵育70°c 30 分钟。
- 添加 35 ul 的 KOAc (5 M), 摇动, 并混合好, 但不漩涡。
- 在冰上孵育30分钟。
- 旋转 1.2万 x g 15 分钟。
- 用1毫升的微, 小心地将清清上移到新管上, 留下任何沉淀或相间。
- 添加 150 ul 的异丙醇到上清。通过反转轻轻混合。
- 旋转 1万 x g 5 分钟。
- 小心取出上清液, 把球团留在管子里。
- 用1毫升70% 乙醇清洗颗粒。
- 旋转 1.2万 x g 5 分钟。
- 移除上清。空气干燥颗粒15至20分钟。不要过度干燥颗粒。
- 在 ddH2O 的 100 ul 中溶解颗粒。
- 使用高保真 DNA 聚合酶适合长扩增子 (> 800 bp) 放大完整的编辑区域。理想情况下, 将两个引物放在插入的卡带外以放大基因组区域。凝胶纯化 PCR 产品, 如前所述, 序列验证产品与多个重叠底漆。
-
验证工程飞行线解剖组织/胚胎的正确时空表达模式:
- 从总 RNA 中进行 rt-pcr 检测, 以验证杂交 mRNA 产品的表达 (表 1D)。
- 进行原位杂交的 mRNA 产品的兴趣在幼虫组织/胚胎, 以验证表达。
- 要在序列验证结束线之间筛选精确的组织特定时空表达式模式, 请将为二进制表达式驱动程序获得的每条经过编辑的行与LexOGFP 或LexO-RFP 进行交叉 (用于莱克萨驱动) 线 (从布卢明顿股票中心提供) 和观察莱克萨或Gal4驱动的报告基因在胚胎, 幼虫和成人组织在荧光显微镜下的表达。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
该协议成功地用于生成一个特定于bnl表达单元5的目标二进制表达式报告器系统。控制复杂时空bnl表达的cis调控元素 (重新审查) 没有特征。因此, 为了在内源bnl调控序列的控制下实现时空表达, 只有bnl的第一编码外显子被设计为以细菌莱克萨transactivator 序列取代。一个改进的 nls-莱克萨::p 65盒已知提供最佳的表达在果蝇被选中。
替代策略旨在在内源转录和转录后控制下生成嵌合体nls-LexA:p65-bnl mRNA。这种嵌合 mRNA 包含完整的bnl 5 ' UTR, 部分 5 ' 末端和 3 ' 结尾的编辑bnl编码外显子 (第一显子), 和完整的下游bnl内含子和外显。为了保留被替换的外显子的bnl RNA 特定剪接, 被替换的编码的外显子的小 5 ' 和 3 ' 末端保留了。然而, 为了防止合成的嵌合体 Bnl 蛋白融合到 nls-莱克萨:p 65, T2A 自裂解肽序列在剩余的 5 ' Bnl编码区和 ATG 之间加入. 此外, 在nls-LexA:p65序列之后添加了一个平移停止密码子, 以避免对截断的 Bnl 蛋白5 (图 4和图 5A) 进行共翻译。
使用了包含所有这些特征的替换捐赠者, 其中有T2Anls-LexA:p65序列和 2 kb 5 '-和 1.8 kb 3 '-同源武器。长同源臂用于高效 HDR 和在修复地点插入一个大的 DNA 片段 (T2A-nls-LexA:p65是 1.8 kb) (图 5A)。
两个 gRNAs 用于在定义的位置创建 DSBs, 以删除bnl的第一个编码外显子。与1.3 节中描述的所有标准相匹配的两个 gRNAs (带下划线的 PAM 序列) 是:
gRNA1: TGTATCTGCGATGCCCCTCATGG
gRNA2: ATCCTTCAGATATTGCGGGATGG
两个 gRNA 识别站点被中断了在替换的捐赠者由外在T2A-nls-LexA:p65序列, 这是避免重定向 gRNAs 到被设计的位置的最简单的方法。被中断的 gRNA 识别序列在替换的捐赠者 ( 扰的外在序列 gRNA 辨认站点用斜体 ) 是 :
gRNA1: TGTATCTGCG-GGCTCCGGCGAAGGAC..。
gRNA2:..。AAAAACTCGTTTAGA-CGGGATGG
含有这些 gRNAs 的 pCFD4 gRNA 表达载体连同替代捐献者一起注射到nos-Cas9胚胎的生殖中。随后, 此处描述的协议随后被用于预定替换的屏幕 (图 5B, C)。大约67% 的注射 G0 动物是肥沃的。56% 的肥沃 G0s 是创始人, 这导致了 HDR 阳性后代。在检查的 F1 后裔中, 约23% 对成功的 hdr 是阳性的, 73% 的阳性 hdr 是 "结束" (表 2)。由于bnl的第一个编码外显子被 "击倒", 所有 HDR 线被发现是纯合致死的, 并且存货被维护了在平衡器。
通过 rt-pcr 分析验证了细胞中嵌合体莱克萨 bnl mRNA 的生成 (图 5D)。为了验证所获得的bnl-莱克萨线是否表达在内源bnl表达式模式中, 每个 "结束" HDR 线交叉到LexO mCherryCAAX转基因蝇5, 和记者表达模式在子代胚胎和幼虫中进行了检查。42的46行显示了与先前报告的bnl模式5一致的精确时空表达式 (图 6)。四行显示的是弱或非特定表达式模式。我们预测这些线可能有累积的突变, 我们需要验证与详细的测序分析。这些结果共同证实了 HDR 介导的外显子替代策略可以成功地用于生成一个目标的二进制表达系统的基因。该工具可以成功地用于表达bnl基因时空模式中的记者或异位基因。
图 1: 针对目标基因表达的二进制转录系统的方案.transactivator (GAL4或莱克萨), 在基因的cis调控元素 (重新审查) 的控制下表达, 驱动在特定转录结合点下游放置的效应基因 (无人机用于Gal4或LexAop为莱克萨)。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: CRISPR/Cas9-mediated 基因组编辑工作流的概述, 以生成二进制转录系统.指示每个步骤所需的大约时间工期。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 建立基因组编辑的飞行线的 CRISPR 筛选和遗传交叉方案的例证.在遗传杂交中, R 代表了 3路染色体上被编辑的等位基因。MKRS(Tp (3; 3) 夫人, M (3) 76 a [1] 家 [1] (2) 某人 [1]), 是 3rd染色体标记;TM6B(在 (3 lr) TM6B, Antp [胡] e [1] Tb [1]) 是 3rd染色体平衡器。基因组编辑的飞行种群通过 pcr 放大从 F2 或 F3 生成蝇中提取的基因组 DNA 的目标区域和序列测定 pcr 产物来验证。请单击此处查看此图的较大版本.
图 4: 通过 DNA 组装生成替换卡带.用 DNA 组装方法将不同 pcr 产物 (a、b 和 c) 的 pcr 放大和组装的示意图。请单击此处查看此图的较大版本.
图 5: 由 CRISPR/Cas9-mediated 外显子替换生成bnl 莱克萨。(A)示意图描绘了 CRISPR/Cas9 介导的 HDR 在bnl轨迹中的外显子替换的策略。框-外显子;线内含子;替代捐助者 (pDonor-bnl: 莱克萨) 和两个可能结果的 HDR 显示。pDonorbnl: 莱克萨有以下特点: (1)T2A-nls-LexA:p65 (~ 1.8kb) 序列由 2 kb 和 1.8 kb 长同源臂 (虚线), (2) T2A 自裂解肽之间的残留 N 终端bnl外显子和nls-LexA:p65, (3) 在nls-LexA:p65序列之后的翻译停止密码子 (红色 *)。HDR 产品保留了bnl的所有转录和转录后控制,莱克萨:p 65 蛋白有望与内源 bnl 相同的模式产生. 黑色小箭头显示相对绑定站点 (不在比例) pcr 引物 (表 1) 用于3步筛选或 rt-pcr 验证。(B)琼脂糖凝胶图片显示3步 PCR 筛查结果。PCR 产品从基因组 DNA 中扩增四成功的最终出 HDR 线显示;阴性对照, 基因组 DNA 的Cas9 父母线;阳性对照, pDonorbnl: 莱克萨质粒;M, 标记 (SL2K DNA 阶梯)。(C)用底漆 M13F 和 rev3 为终点线显示预期的 PCR 产品的筛选凝胶的例子;M8-7 和 M9-6 是两个两端的线;阴性和阳性对照, 与 B 相同;M, 标记 (纳布 1 kb DNA 阶梯)。(D) bnl-莱克萨和nos-Cas9控制蝇总 RNA 的 RT PCR 分析。正向底漆绑定到一个莱克萨特定区域, 反向引物绑定到下游bnl外显子区域;在bnl-莱克萨mRNA 上检测到 440 bp (基对) 扩增带 (*), 但不从控制 RNA。M, 100 bp 标记 (纳布)。改编自图2和 S1 在杜等 al。20175。请单击此处查看此图的较大版本.
图 6: 不同组织中组织特异性和条件bnl 莱克萨表达的验证。(A D) bnl在不同幼虫组织中的表达 (红色), btl表示细胞呈绿色。(a、a)翼盘bnl源在生长的空气囊普利摩顿 (ASP) 前面。(B、C)bnl在 TR5 横结缔组织 (TC) (B) 和 TR2 背支 (DB) (C) 中的表达。(D) bnl在生殖器盘中的表达。(E J)动态bnl表达 (红) 在胚胎气管分支 (绿色) 模式;小箭头, 五bnl源周围的气管基板在阶段10。基因型: J;btl-Gal4, 无人接入-CD8GFP/+;bnl-莱克萨, LexO-CherryCAAX.(K L)缺氧诱导bnl 莱克萨表达谱在翼盘和相关的 TR2 气管 metamere (TC, DB, 背主干 DT)。基因型: bnl-莱克萨, LexO-CherryCAAX/+。(K) 未 CoCl2的体外培养器官控制盘. (l-l) 翼盘 (l、l) 和气管 (DT, l)) 从培养的体外器官与 CoCl2诱导缺氧。低氧诱导的异位表达。刻度条 = 30 µm;50µm (K L)。改编自杜等地的图 3 。20175。请单击此处查看此图的较大版本.
| gRNA 克隆和测序 | |
| bnl-莱克萨 gRNA |
TATATAGGAAAGATATCCGGGTGAACTTCgTGTATCTGCGAT GCCCCTCAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG |
| bnl-莱克萨 gRNA |
ATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAACTCCCGCAATATCTGAAGG 在cGACGTTAAATTGAAAATAGGTC |
| 用于测序的 T3 底漆 | CAATTA ACCCTCACTAAAGG-3 |
| 注: 核苷酸下划线退火到 U6 启动子或 gRNA 核心在 pCFD4 载体, 小写的 g/c 被添加到援助 U6 促进者依赖转录 | |
| B. HDR 捐助者建设 | |
| bnl N-F_pUC19 | AATTCGAGCTCGGTACtgtggtctttgaggctggaac |
| bnl-莱克萨 |
tCCGcaagtCagtAGgctgccgcgtccttcgccggaGCCCGCAGATACAAGGCCC C |
| 莱克萨-F |
CTactGacttgCGGaGAtGTcGAaGAGAACCCtGGCCCtATGCCACCCAA GAAGAAGC |
| 莱克萨河 | CTAAACGAGTTTTTAAGCAAACTCACTC |
| bnl 莱克萨 | TAAAAACTCGTTTAGACGGGATGGCGTTGTCAAC |
| bnl C-R_pUC19 | GCCAAGCTTGCATGCCtcgcataattgccgcctgg |
| 注: 资本中的核苷酸与 pUC19 向量重叠的吉布森装配, 核苷酸下划线为 T2A 肽加法的序列悬置。 | |
| C. HDR 筛选和测序 | |
| bnl-莱克萨 scr fwd1 | GTGGCGCACGCCCAATAAAC |
| bnl-莱克萨 scr rev1 | GATCCCAGCCAATCTCCGTTG |
| bnl-莱克萨 scr fwd2 | CAACGGAGATTGGCTGGGATC |
| bnl-莱克萨 scr rev2 | CTGGCCAACTGTAGGGAAGTC |
| 最终检查 rev3 | GCAATGTTATGCAATGCGTTGAC |
| bnl-莱克萨序列 fwd3 | CACTTGTCGCCCATATTGATACAATTG |
| 注: 这些引物用于 PCR 筛选和测序, fwd1-2 和 rev1-3 的图5A 显示了底漆结合点的近似位置。 | |
| D. rt-pcr 分析 | |
| RT-f | GATATGGATTTCTCCGCTTTGCTG |
| RT r | CCATGCAGAGATACAGGCAAGTG |
表 1: 本研究中使用的底漆.(A) 用于克隆 gRNA 表达载体和测序的底漆。(B) 用于克隆 HDR 捐助者模板的底漆。(C) 对 HDR 产品进行筛选和排序的底漆。(D) 用于 rt-pcr 检测嵌合体莱克萨-bnl mRNA 产品的底漆。
| 基因 | hdr 传输速率% (# hdr 产量 G0/# 肥沃的 G0) | # HDR-正 F1/# 检查总计 F1 (%) | # "结束" hdr/# 总 hdr (%) |
| bnl-莱克萨 | 56 (15/27) | 23 (60/259) | 73 (46/60) |
表 2: CRISPR/Cas9-mediated HDR 的效率.hdr 传输速率被计算为全肥沃 G0 的 hdr 产量 G0/#。成功的 HDR% 计算为全 F1 筛选的 HDR 阳性 F1/#。"结束"% 被计算为 "结束" hdr/# 的总阳性 hdr。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
传统上,果蝇增强器陷阱是由两种不同的方法产生的。其中一个方法包括随机插入一个驱动程序 (例如, Gal4) 序列在基因组中通过移位 (e., P 元素移位)1 。或者, 驱动程序序列可以放置在一个假定的增强/启动子区域的转录控制的质粒结构, 然后将集成到基因组3,11的异位点。虽然这些方法已经产生了大量的Gal4或莱克萨增强器陷阱的果蝇, 他们有几个限制。P 元素介导的随机插入基因组可能扰乱关键的cis监管序列的监管活动。由于基因组中的随机移位, transactivator 表达可能会报告多个相邻基因的模式。另一方面, 一个基因的 cis 调控序列的先验知识是一个增强-陷阱质粒结构的必要。在质粒结构中可以克隆和测试序列的长度也有限制。仅从内源基因组中分离和克隆 DNA 的部分片段可能不会重现完整的基因特定表达模式。例如, bnl-Gal4 (NP2211) 线, 这是由 P 元素插入的增强陷阱 Gal4 元素刚刚在bnl基因, 不完全再现基因特异表达模式在胚胎5.因此, 在这种情况下, 可以将现有的 Gal4 线转换为另一个莱克萨或基于 Q 系统的驱动程序行12的重用技术 (如黑客 (同源辅助 CRISPR)) 可能并不十分有用。为了克服这些局限性, 在这里, 我们描述了一个有效的和替代的方法来生成二进制表达系统的基因组编辑。在这个方法中, 基因的第一个编码外显子被交换与 transactivator (例如,莱克萨或Gal4) 序列, 以便转录驱动程序的表达完全模仿基因表达的时空模式。虽然这里描述的策略和协议对bnl表达进行了优化, 但该方法可以很容易地被其他基因所采用。
在目标基因区域内确定一个插入点是这个实验策略中最关键的一步。我们提出的方法是为了保留所有的原始转录和转录后的规则bnl基因5。因此, 我们计划删除大多数的第一编码外显子的bnl基因, 并取代它与莱克萨盒。该置换计划在这样的方式, 编辑的等位基因表达一个混合莱克萨-bnl mRNA 从内源转录和翻译起始地点的bnl , 同时保留所有内含子区域。然而, 杂交 mRNA 的设计只生产莱克萨蛋白, 而不是 Bnl。我们表明, 该策略成功地生成了一个基于bnl 莱克萨/LexO的转录系统, 系统可以准确地报告动态的时空bnl表达模式 (图 5)5.这一过程的局限性是, 如果目标基因是生存的必要条件, 在果蝇线上的纯合致死性。此外, 使用双 gRNA 策略可能会增加非目标编辑的机会。可以采用另一种策略来避免这些问题。在这个策略中,莱克萨或Gal4盒可以放在被替换基因的 ATG 起始点, T2A 自裂解肽序列可以放置在LexA/Gal4盒和完整编码外显子的开始之间目标基因。该策略有望产生嵌合 mRNA, 可转化为 transctivator 和功能性基因产品。这样的设计可能会减少纯合致死的几率。在这个策略中, 一个单一的 gRNA 是足够的基因组编辑。然而, 在有两个功能基因拷贝的情况下, Gal4/LexA驱动的转基因蛋白质变体的表达 (例如, bnl-莱克萨驱动表达LexObnl: GFP 融合, 或 bnl 蛋白与删除) 将不提供有关变异蛋白功能的信息。
基因组编辑策略的局限性是一次对单个基因进行目标和编辑的费力过程。然而, CRISPR/Cas9-mediated 基因组编辑方法的简单性和有效性, 改变了靶向基因组的敲入/敲出和替换技术, 在任何标准实验室中都可以很容易地采用。在过去的几年中,果蝇研究人员为基因组编辑开发了方便的工具包, 可用于扩展用于了解基本生物过程7、13 的基因工具箱..这里描述的基因组编辑和筛选过程相对较快, 与任何其他同源的基于重组的替换相比, 需要大约两个月的时间。对于成功和高效的基因组编辑结果, 重要的是遵循几个技术上的关键步骤: 1) 每个 gRNA 是由最大的严格和活动选择, 没有潜在的目标;2) HDR 捐助者在 gRNA 目标站点的两侧有 1.5 kb 的同源武器。更长的同源臂 (1.8–2 kb) 用于提高 HDR 的效率, 当一个巨大的外源 DNA 片段需要插入;3) HDR 捐赠者的设计是免费的 gRNA 识别网站, 以避免重定向的 gRNA 到工程的轨迹;和 4) 一个万无一失的精心策划和协调的时间, 基因交叉与3步 PCR 为基础的筛选, 以选择 "结束" HDR 线。
与随机移位或克隆增强器构造不同, 我们在这里描述的策略和协议确保生成专门针对特定基因的二进制转录系统。由于驱动程序的表达取代了本机基因外显子, 驱动程序的基因特异表达也多才多艺, 预计在所有发育、代谢和生理条件下模拟基因表达模式5。基因/细胞特异表达是最可取的标准, 所有二元驱动线, 当它们被用于各种细胞和发展生物学方法。例如, 基因特异表达的报告基因的转录驱动程序有助于可靠的血统分析的细胞表达的目标基因。它还能够实时成像和跟踪细胞在发育过程中的时空表达、迁移和重组。为了研究组织形态发生过程中的细胞和分子事件, Gal4或莱克萨驱动过度表达/misexpression 的各种转基因和 rna 干扰介导的基因敲除在特定的组细胞是必不可少的。高度具体的目标表达系统提供了公正的分析和解释的结果。因此, CRISPR/Cas9-based 靶向基因外显子及其替代 transactivator 序列提供了一个更好的选择, 以产生高度特异的靶向基因表达系统。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者没有披露的利益冲突。
Acknowledgments
我们感谢 f 港博士、奥康纳博士和冯博士就 CRISPR 战略进行讨论;肺结核科恩伯格博士和布卢明顿试剂中心;UMD 成像核心设施;和从 NIH 获得的资金: R00HL114867 和 R35GM124878 到 SR。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| X-Gal/IPTG | Gentrox (Genesee Scientific) | 18-218 | cloning |
| LB-Agar | BD Difco | BD 244520 | cloning |
| Tris-HCl | Sigma Aldrich | T3253 | Molecular Biology |
| EDTA | Sigma Aldrich | E1161 | Molecular Biology |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | Molecular Biology |
| UltraPure DNase/RNase-Free Water | ThermoFisher Scientific | 10977-023 | Molecular Biology |
| 10% SDS | Sigma Aldrich | 71736 | Molecular Biology |
| KOAc | Fisher-Scientific | P1190 | Molecular Biology |
| EtOH | Fisher-Scientific | 04-355-451 | Molecular Biology |
| GeneJET Miniprep | ThermoFisher Scientific | K0503 | Miniprep |
| PureLink HiPure Plasmid Maxipep kits | ThermoFisher Scientific | K210006 | Maxiprep |
| BbsI | NEB | R0539S | Restriction enzyme |
| Primers | IDT-DNA | PCR | |
| pCFD4 | Kornberg Lab | DNA template and vector for gRNA | |
| KAPA HiFi Hot Start- (Kapa Biosystems) | Kapa biosystems | KK2601 | PCR |
| Q5-high fidelity Taq | NEB | NEB #M0491 | PCR |
| Gibson Assembly Master Mix | NEB | NEB #E2611 | DNA assembly |
| pBPnlsLexA:p65Uw | Addgene | DNA template for LexA amplification | |
| Proteinase K | ThermoFisher Scientific | 25530049 | Molecular Biology |
| 2x PCR PreMix, with dye (red) | Sydlab | MB067-EQ2R | Molecular Biology |
| Gel elution kit | Zymo Research (Genesee Scientific) | 11-300 | Molecular Biology |
| TRI reagent | Sigma-Aldrich | Molecular Biology | |
| Direct-zol RNA purification kits | Zymo Research (Genesee Scientific) | 11-330 | Molecular Biology |
| OneTaq One-Step RT-PCR Kit | NEB | E5315S | Molecular Biology |
| lexO-CherryCAAX | Kornberg Lab | Fly line | |
| UAS-CD8:GFP | Kornberg lab | Fly line | |
| btl-Gal4 | Kornberg lab | Fly line | |
| MKRS/TB6B | Kornberg lab | Fly line | |
| Confocal Microscope SP5X | Leica | Imaging expression pattern | |
| CO2 station | Genesee Scientific | 59-122WCU | fly pushing |
| Stereo microscope | Olympus | SZ-61 | fly pushing |
| Microtube homogenizing pestles | Fisher-Scientific | 03-421-217 | genomic DNA isolation |
| NanoDrop spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-1000 | DNA quantification |
References
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Lai, S. -L., Lee, T. Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophila. Nature Neuroscience. 9 (5), 703-709 (2006).
- Potter, C. J., Tasic, B., Russler, E. V., Liang, L., Luo, L. The Q system: a repressible binary system for transgene expression, lineage tracing, and mosaic analysis. Cell. 141 (3), 536-548 (2010).
- Jinek, M., Chylinski, K., Fonfara, I., Hauer, M., Doudna, J. A., Charpentier, E. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Du, L., Zhou, A., Patel, A., Rao, M., Anderson, K., Roy, S. Generation of a targeted expression system for branchless and characterization of novel cellular expression patterns of the gene in Drosophila. Developmental Biology. 427 (1), 35-48 (2017).
- Port, F., Chen, H. -M., Lee, T., Bullock, S. L. Optimized CRISPR/Cas tools for efficient germline and somatic genome engineering in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (29), E2967-E2976 (2014).
- Gratz, S. J., Rubinstein, C. D., Harrison, M. M., Wildonger, J., O'Connor-Giles, K. M.
- Doench, J. G., Hartenian, E., et al. Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation. Nature Biotechnology. 32 (12), 1262-1267 (2014).
- Port, F., Bullock, S. L. Augmenting CRISPR applications in Drosophila with tRNA-flanked sgRNAs. Nature Methods. 13 (10), 852-854 (2016).
- Beumer, K. J., Trautman, J. K., Mukherjee, K., Carroll, D. Donor DNA Utilization During Gene Targeting with Zinc-Finger Nucleases. G3. 3 (4), Bethesda, Md. 657-664 (2013).
- Pfeiffer, B. D., Ngo, T. -T. B., et al. Refinement of tools for targeted gene expression in Drosophila. Genetics. 186 (2), 735-755 (2010).
- Lin, C. -C., Potter, C. J. Editing Transgenic DNA Components by Inducible Gene Replacement in Drosophila melanogaster. Genetics. 203 (4), 1613-1628 (2016).
- Li, W., Köster, J., et al. Quality control, modeling, and visualization of CRISPR screens with MAGeCK-VISPR. Genome Biology. 16 (1), 281 (2015).
