تلطيخ مطاطي على الشرائح جزءا لا يتجزأ من البارافين من أنسجة سرطان المعدة pT3N0M0
Summary
هنا، نقدم بروتوكول تلطيخ مرنة لتحديد الألياف المرنة في أنسجة سرطان المعدة pT3N0M0 على أقسام رسمية ثابتة، البارافين جزءا لا يتجزأ. في وقت لاحق، ونحن نصف طريقة لتحديد ما إذا كانت الخلايا السرطانية تغزو وراء لامينا مرنة.
Abstract
اللامينا المرنة، التي تقع عادة في طبقة شبه mesothelial، المتاخمة للخلايا الوسطى العبية، هو amphiphilic على الهيماتوإكسلين وeosin (H & E) تلطيخ ولكن يمكن تصورها من خلال تلطيخ مرنة. واحدة من الفوائد الهامة للتلطيخ المرن هو أنه يجعل من السهل تحديد ما إذا كانت الخلايا السرطانية قد غزت وراء لامينا مرنة. وهذا يساعد في دراسة مدى الغزو السطحي البريكوني، وبالتالي التمييز بين مراحل pT3 و pT4 في سرطان الجهاز الهضمي. في هذه الدراسة، نقدم بروتوكول لتحديد الألياف المرنة في أقسام الأنسجة السرطانية المعدية المثبتة رسميا، البارافين جزءا لا يتجزأ من pT3N0M0. نحن إعداد أقسام البارافين 5-μm ثابتة على الشرائح، ومن ثم يتم إزالة جميع الشرائح وإعادة ترطيبها أثناء إجراء تلطيخ. في وقت لاحق، يتم أكسدة جميع الأقسام من قبل برمنغنات البوتاسيوم، مبيض بحمض الأكساليك، ملطخة بتلطيخ مرن، وملطخة من قبل فان غيسون. وأخيرا، فإننا ندرس تأثير تلطيخ؛ لامينا مرنة ملطخة الأزرق والأسود وألياف الكولاجين ملطخة الأحمر، في حين أن الخلايا السرطانية ملطخة في ظلال متفاوتة من الأصفر. كما أننا نصف بالتفصيل الأساليب المستخدمة لتحديد العلاقة الموضعية بين الخلايا السرطانية واللامينا المرنة. هذه الطريقة بسيطة، منخفضة التكلفة، وقابلة للتطبيق على نطاق واسع في تحديد غزو سطح البريكوني في سرطان الجهاز الهضمي بسبب انتقائيته المعلقة للألياف المرنة والنتائج الحقيقية.
Introduction
وفقا للورم، عقدة، وورم (TNM) نظام تنظيم السرطان، وتشخيص سرطان المعدة في المرحلة المرضية pT4 هو أسوأ بكثير من ذلك في pT3 (UICC 8/ AJCC)1. مع سرطان المعدة ، عادة ما يعتمد تصنيف الورم الأولي (pT) على عمق غزو الورم2. يتم تعريف سرطان المعدة pT3 المرحلة المرضية على أنه سرطان يغزو من خلال بروبريا العضلات في الأنسجة تحت الجلد، في حين يتم تعريف سرطان المعدة pT4 كسرطان اختراق إلى سطح البريطونالحشوي. وجود الغازية السطحية البريكونية هو المفتاح للتمييزبين المرحلتين 2. ومع ذلك، لأن طبقة الخلايا الوسطى العبية هي رقيقة جدا، يمكن أن تتلف خلال الجراحة، والعلاج بعد الجراحة، وتثبيت3. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تؤدي التغيرات الالتهابية المرتبطة بالورم والتليف إلى تلف التشريح الطبيعي للحيط، مما يجعل من الصعب جداً الحكم بدقة على غزو سطح البريطون باستخدام H&E تلطيخفقط 4. طرق التشخيص المساعدة الحالية مثل علم الخلايا والكيمياء المناعية هي ذات قيمة تشخيصية محدودة5،6 لأنها إيجابية كاذبة أو لديها فعالية منخفضة من حيث التكلفة.
الغشاء المصلي يشمل البريتوم، الجنبة، والتاميرة، ويتكون من الميسوثيوم، غشاء الطابق السفلي، وطبقة شبهميثيرية 7. إحدى السمات النسيجية الشائعة للغشاء المصلي هي وجود لامينا مرنة في الطبقة شبه الوسطى، بجوار الخلايا الوسطى8،9. لامينا مرنة لديها قدرة قوية مضادة للضرر ويمكن أن تكون بمثابة علامة التكهن البديل إذا تم تدمير الخلايا الوسطى من قبل التهاب شديد ذات الصلة بالورم أو التليف3. لامينا مرنة تتألف أساسا من الإيلاستين وميكروفيبريل10، والتي يمكن تصورها عن طريق تلطيخ مرنة. السبب الرئيسي وراء استخدام تلطيخ مرنة هو أن الإيلاستين يشكل رابطة الهيدروجين مع مجموعة الفينول من ريسورسينول في محلول الإيلاستين، مما تسبب في الألياف المرنة لتكون ملطخة الأزرق والأسود. بعد فان غيسون (VG) تلطيخ المتناقضة، ألياف الكولاجين يمكن أن تكون ملطخة الأحمروألياف العضلات وخلايا الدم الحمراء يمكن أن تكون ملطخة الأصفر 8،11،12،13.
الطبعة الثامنة من تنظيم TNM من سرطان الرئة يعرف الغزو الجنبي الحشوي (T2) بأنه غزو الورم وراء لامينا مرنة أو غزو على سطح الجنبة الحشوية2. وقد أظهرت الدراسات على سرطان القولون والمستقيم أن غزو لامينا مرنة في سرطان القولون والمستقيم pT3 قد يكون السبب في ضعف التنبؤات. كما ثبت أن معدل البقاء على قيد الحياة الشامل لسرطان القولون والمستقيم لمدة 5 سنوات والعام يشبه pT4a13و14و15. استنادا إلى دراساتنا السابقة على تلطيخ مرنة، وقد وجد غزو لامينا مرنة أن يكون لها تأثير سلبي كبير على التكهن بسرطان المعدة pT3 وينبغي أن تعامل بنفس الطريقة التي pT4a سرطان المعدة12. وبالتالي، فإن هذه الطريقة البسيطة والفعالة من حيث التكلفة يمكن أن تساعد في القضاء على عدم اليقين في النتائج التي تم الحصول عليها من خلال تلطيخ H&E، وغيرها من القيود الشائعة المرتبطة بطرق التشخيص المساعدة الأخرى، بما في ذلك علم الخلايا والكيمياء المناعية، من بين الاخرين. يمكن استخدام هذه الطريقة بكفاءة لتشخيص غزوات سطح البريكوني لسرطان الجهاز الهضمي، وخاصة في بعض الحالات الغامضة. انها مريحة منذ H & E وصمة عار وغيرها من البقع عادة ما تجعل من الصعب تحديد مثل هذه الغزوات. كما تضمن هذه الطريقة موثوقية النتائج لأنها انتقائية للغاية، لا سيما للألياف المرنة. هنا، نقوم بإجراء تلطيخ مرن لتحديد ما إذا كانت الخلايا السرطانية قد غزت لامينا مرنة في سرطان المعدة pT3N0M012.
يتم استخدام هذه الطريقة لتحديد الألياف المرنة في الأنسجة على المواد الرسمية الثابتة، والبارافين جزءا لا يتجزأ، ويمكن استخدامها للأقسام المجمدة كذلك. هنا، نختار أقسام جزءا لا يتجزأ من البارافين للحصول على أفضل صيانة للمورفولوجيا الخلوية والأنسجة. جميع الخطوات في هذا البروتوكول تجري في درجة حرارة الغرفة. يتم استخدام مجموعة تلطيخ التجارية التي تشمل محلول برمنغنات البوتاسيوم، حل حمض الأكساليك، محلول الإيلاستين، ومحلول فان غيسون في الدراسة المقدمة.
Protocol
Representative Results
Discussion
توفر هذه الطريقة المقترحة هنا نهجاً دقيقاً لتحديد لامينا مطاطية تحت الجلد. ويمكن استخدام هذه الطريقة لتقييم ما إذا كانت الخلايا السرطانية قد غزت لامينا مرنة في سرطان المعدة pT3N0M012. لامينا مرنة هو المحمر في H & E-الملون المقاطع، والتي لا يمكن تمييزها بسهولة من ألياف الكولاجين، وغ…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويشكر المؤلفون الدعم المقدم جزئياً من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية (NO.81401902 وNO.81501992) ومؤسسة هونان للعلوم الطبيعية (NO.2017SK2134, NO.2018JJ2238). المخطوطة من تأليف غوانغ لي. يتم تنفيذ التجربة بأكملها من قبل قوانغ لي وهايان يانغ. ويشكر أصحاب البلاغ مساعدة أخصائيي الأمراض والزملاء الذين يتابعون بيانات المرضى.
Materials
| Elastin-Van Gieson staining kit | Baso | BA4083B | Used for staining of elastic fibers, collagen fibers and myofibers |
| Permount TM Mounting Medium | MXB Biotechnologies | DAB-0033 | Used for mounting |
| Ethanol | LMAI Bio | LM64-17-5 | 100% |
| Xylene | LMAI Bio | LX820585 |
References
- Jiang, C. G., et al. Clinicopathologic characteristics and prognosis of gastric cancer invading the subserosa. Journal of Surgical Oncology. 102 (7), 737-741 (2010).
- Amin, M. B., et al. . AJCC Cancer Staging Manual. 8th ed. , (2017).
- Kojima, M., et al. Elastic laminal invasion in colon cancer: diagnostic utility and histological features. Frontiers in Oncology. 2, 179 (2012).
- Ludeman, L., Shepherd, N. A. Serosal involvement7 in gastrointestinal cancer: its assessment and significance. Histopathology. 47 (2), 123-131 (2005).
- Shepherd, N. A., Baxter, K. J., Love, S. B. The prognostic importance of peritoneal involvement in colonic cancer: a prospective evaluation. Gastroenterology. 112 (4), 1096-1102 (1997).
- Liang, W. Y. Retrospective evaluation of elastic stain in the assessment of serosal invasion of pT3N0 colorectal cancers. American Journal of Surgical Pathology. 37 (10), 1565-1570 (2013).
- Carter, D., True, L., Otis, C. N., Mills, S. E. Serosal membranes. Histology for Pathologists. 3rd ed. , 547-562 (2007).
- Knudsen, P. J. The peritoneal elastic lamina. Journal of Anatomy. 177, 41-46 (1991).
- Shepherd, N. A., Baxter, K. J., Love, S. B. Influence of local peritoneal involvement on pelvic recurrence and prognosis in rectal cancer. Journal of Clinical Pathology. 48 (9), 849-855 (1995).
- Uitto, J., Li, Q., Urban, Z. The complexity of elastic fibre biogenesis in the skin–a perspective to the clinical heterogeneity of cutis laxa. Experimental Dermatology. 22 (2), 88-92 (2013).
- Kazlouskaya, V., et al. The utility of elastic Verhoeff-Van Gieson staining in dermatopathology. Journal of Cutaneous Pathology. 40 (2), 211-225 (2013).
- Lei, G., et al. Elastic staining-a rejuvenated method to reassess prognosis and serosal invasion in patients with pT3N0M0 gastric cancer. Human Pathology. 65, 79-84 (2017).
- Hernández-Morera, P., Travieso-González, C. M., Castaño-González, I., Mompeó-Corredera, B., Ortega-Santana, F. Segmentation of elastic fibres in images of vessel wall sections stained with Weigert’s resorcin-fuchsin. Computer Methods and Programs in Biomedicine. 142, 43-54 (2017).
- Kojima, M., Nakajima, K., Ishii, G., Saito, N., Ochiai, A. Peritoneal elastic laminal invasion of colorectal cancer: the diagnostic utility and clinicopathologic relationship. American Journal of Surgical Pathology. 34 (9), 1351-1360 (2010).
- Nakanishi, Y., et al. Reappraisal of Serosal Invasion in Patients With T3 Colorectal Cancer by Elastic Stain. ARCHIVES OF PATHOLOGY & LABORATORY MEDICINE. 140 (1), 81-85 (2016).
- Grin, A., et al. Peritoneal elastic lamina invasion: limitations in its use as a prognostic marker in stage II colorectal cancer. Human Pathology. 44 (12), 2696-2705 (2013).
- Stewart, C. J., Brennan, B. A., Crook, M. L., Russell, P. Value of elastin staining in the assessment of peritoneal implants associated with ovarian serous borderline tumours. Histopathology. 51 (3), 313-321 (2007).
- Kojima, M., et al. Pathological diagnostic criterion of blood and lymphatic vessel invasion in colorectal cancer: a framework for developing an objective pathological diagnostic system using the Delphi method, from the Pathology Working Group of the Japanese Society for Cancer of the Colon and Rectum. Journal of Clinical Pathology. 66 (7), 551-558 (2013).
- Elston, C. A., Kazlouskaya, V., Elston, D. M. Elastic staining versus. fluorescent and polarized microscopy in the diagnosis of alopecia. Journal of the American Academy of Dermatology. 69 (2), 288-293 (2013).
- Vos, A., et al. Predominance of Nonatherosclerotic Internal Elastic Lamina Calcification in the Intracranial Internal Carotid Artery. Stroke. 47 (1), 221-223 (2016).
