Упругое окрашивание на параффиновые слайды ткани рака желудка pT3N0M0
Summary
Здесь мы представляем протокол эластичного окрашивания для выявления эластичных волокон в тканях рака желудка pT3N0M0 на формалино-фиксированных, парафин-встроенных разделах. Впоследствии мы описываем метод, чтобы определить, являются ли опухолевые клетки вторгаются за эластичный ламина.
Abstract
Упругая ламина, которая обычно находится в субмезотелиальном слое, примыкающем к мезотелиальным клеткам, является амфифилическим на гематоксилине и эозине (Н и Е) окрашиванием, но может быть визуализирована через эластичное окрашивание. Одним из важных преимуществ эластичного окрашивания является то, что это позволяет легко определить, являются ли опухолевые клетки вторглись за эластичный ламина. Это помогает в изучении степени вторжения брюнейшей поверхности, тем самым различая pT3 и pT4 этапов рака желудочно-кишечного тракта. В этом исследовании мы представляем протокол для выявления эластичных волокон в формино-фиксированных, парафин-встроенных pT3N0M0 рака желудка разделов ткани. Мы готовим 5-мм парафинов разделы фиксированной на слайдах, а затем все слайды deparaffinated и регидратированных во время процедуры окрашивания. Впоследствии все секции окисляются перманганата калия, отбеливаются щавелевой кислотой, окрашиваются эластичным окрашиванием и counterstained Van Gieson’s. Наконец, мы исследуем эффект окрашивания; эластичный ламина окрашенные сине-черные и коллагеновые волокна окрашены красным цветом, в то время как раковые клетки окрашены в различных оттенках желтого. Мы также подробно описываем методы, используемые для определения позиционной связи между раковыми клетками и эластичной ламиной. Этот метод прост, недорогой, и широко применяется в выявлении вторжения брюшной поверхности в желудочно-кишечного тракта рака из-за его выдающейся избирательности для эластичных волокон и подлинные результаты.
Introduction
В рамках опухолевой, узловой и метастазной (TNM) системы постановки рака, прогноз рака желудка на патологической стадии pT4 значительно хуже, чем у pT3 (8-й UICC / AJCC)1. При раке желудка классификация первичной опухоли (ПТ) обычно зависит от глубины опухоли вторжения2. Патологическая стадия pT3 рака желудка определяется как рак вторжения через muscularis propria в подсерозальные ткани, в то время как pT4 рака желудка определяется как рак проникает на поверхность висцеральной перитонеум. Наличие инвазивности перитонеальной поверхности являетсяключом к различению двух стадий 2. Однако, поскольку перитонеальный мезотелиальный слой клетки очень тонкий, он может быть поврежден во время операции, послеоперационного лечения и фиксации3. Кроме того, связанные с опухолью воспалительные изменения и фиброз может повредить нормальную анатомию перитонеума, что делает его очень трудно точно судить о вторжением перитонеальной поверхности, используя только Н И E окрашивания4. Современные вспомогательные методы диагностики, такие как цитологияи иммуногистохимия, имеют ограниченное диагностическое значение 5,6, поскольку они являются ложноположительными или имеют низкую рентабельность.
Серозная мембрана включает в себя перитонеум, плевру и перикард, и состоит из мезотелия, мембраны подвала, и суб-мезотелиального слоя7. Одной из распространенных гистологических особенностей серосальной мембраны является наличие эластичного ламина в субмезотелиальном слое, примыкающем к мезотелиальным клеткам8,9. Упругая ламина имеет сильную анти-повреждение способности и может служить в качестве альтернативного прогностирика, если мезотелиальные клетки разрушаются тяжелым воспалением опухоли или фиброз3. Упругая ламина в основном состоит из эластина и микрофибрила10,который может быть визуализирован эластичным окрашиванием. Основной причиной использования эластичного окрашивания является то, что эластин образует водородную связь с феноличной группой резоринола в растворе эластина, в результате чего эластичные волокна окрашены в сине-черный цвет. После Ван Гисон (VG) контрастные окрашивания, коллагеновые волокна могут быть окрашены в красный цвет и мышечные волокна и красные кровяные тельца могут быть окрашены желтый8,11,12,13.
Восьмое издание TNM постановка рака легких определяет висцерального плеврального вторжения (T2) как вторжение опухоли за упругой ламиной или вторжения на поверхности висцеральной плевры2. Исследования колоректального рака показали, что упругий ламина вторжения в pT3 колоректального рака может быть причиной плохих прогнозов. 5-летний без болезней и общая выживаемость колоректального рака также было доказано, как pT4a13,14,15. На основе наших предыдущих исследований по эластичной окрашивания, эластичная ламина вторжения было установлено, что значительное негативное влияние на прогноз рака желудка pT3 и должны рассматриваться так же, как pT4a рака желудка12. Таким образом, этот простой и экономически эффективный метод может помочь устранить неопределенность в результатах, полученных с помощью н и e окрашивания, и другие общие ограничения, связанные с другими вспомогательными методами диагностики, в том числе цитологии и иммуногистохимии, среди Другие. Этот метод может быть эффективно использован для диагностики перитонеальной поверхности вторжений рака желудочно-кишечного тракта, особенно в некоторых неоднозначных случаях. Это удобно, так как н и E пятна и другие пятна, как правило, затрудняет выявление таких вторжений. Этот метод также обеспечивает надежность результатов, так как он очень избирательный, особенно для эластичных волокон. Здесь мы проводим эластичное окрашивание, чтобы определить, вторглись ли опухолевые клетки в упругую ламину в рак желудка pT3N0M012.
Этот метод используется для выявления эластичных волокон в тканях на формалино-фиксированных, парафин-встроенных разделов, а также может быть использован для замороженных разделов, а также. Здесь мы выбираем парафин-встроенные разделы для лучшего обслуживания клеточной и тканевой морфологии. Все этапы в этом протоколе происходят при комнатной температуре. В представленном исследовании используется коммерческий комплект для окрашивания, включающий в себя раствор перманганата калия, раствор щавелевой кислоты, раствор эластина и раствор Ван Гисона.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот предложенный здесь метод обеспечивает точный подход для определения субсерозаля эластичной ламина. Метод может быть использован для оценки ли опухолевые клетки вторглись упругой ламина в pT3N0M0 рака желудка12. Упругая ламина является красноватой в H и E-окрашенных разде…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы частично благодарят поддержку со стороны Национального фонда естественных наук (NO.81401902 и NO.81501992) и Фонда естествознания Хунань (NO.2017SK2134, NO.2018JJ2238). Рукопись написана Гуан Лэем. Весь эксперимент проводят Сяочан Лэй и Хайян Ян. Авторы благодарят помощь патологоанатомов и стипендиатов, которые следят за данными пациентов.
Materials
| Elastin-Van Gieson staining kit | Baso | BA4083B | Used for staining of elastic fibers, collagen fibers and myofibers |
| Permount TM Mounting Medium | MXB Biotechnologies | DAB-0033 | Used for mounting |
| Ethanol | LMAI Bio | LM64-17-5 | 100% |
| Xylene | LMAI Bio | LX820585 |
References
- Jiang, C. G., et al. Clinicopathologic characteristics and prognosis of gastric cancer invading the subserosa. Journal of Surgical Oncology. 102 (7), 737-741 (2010).
- Amin, M. B., et al. . AJCC Cancer Staging Manual. 8th ed. , (2017).
- Kojima, M., et al. Elastic laminal invasion in colon cancer: diagnostic utility and histological features. Frontiers in Oncology. 2, 179 (2012).
- Ludeman, L., Shepherd, N. A. Serosal involvement7 in gastrointestinal cancer: its assessment and significance. Histopathology. 47 (2), 123-131 (2005).
- Shepherd, N. A., Baxter, K. J., Love, S. B. The prognostic importance of peritoneal involvement in colonic cancer: a prospective evaluation. Gastroenterology. 112 (4), 1096-1102 (1997).
- Liang, W. Y. Retrospective evaluation of elastic stain in the assessment of serosal invasion of pT3N0 colorectal cancers. American Journal of Surgical Pathology. 37 (10), 1565-1570 (2013).
- Carter, D., True, L., Otis, C. N., Mills, S. E. Serosal membranes. Histology for Pathologists. 3rd ed. , 547-562 (2007).
- Knudsen, P. J. The peritoneal elastic lamina. Journal of Anatomy. 177, 41-46 (1991).
- Shepherd, N. A., Baxter, K. J., Love, S. B. Influence of local peritoneal involvement on pelvic recurrence and prognosis in rectal cancer. Journal of Clinical Pathology. 48 (9), 849-855 (1995).
- Uitto, J., Li, Q., Urban, Z. The complexity of elastic fibre biogenesis in the skin–a perspective to the clinical heterogeneity of cutis laxa. Experimental Dermatology. 22 (2), 88-92 (2013).
- Kazlouskaya, V., et al. The utility of elastic Verhoeff-Van Gieson staining in dermatopathology. Journal of Cutaneous Pathology. 40 (2), 211-225 (2013).
- Lei, G., et al. Elastic staining-a rejuvenated method to reassess prognosis and serosal invasion in patients with pT3N0M0 gastric cancer. Human Pathology. 65, 79-84 (2017).
- Hernández-Morera, P., Travieso-González, C. M., Castaño-González, I., Mompeó-Corredera, B., Ortega-Santana, F. Segmentation of elastic fibres in images of vessel wall sections stained with Weigert’s resorcin-fuchsin. Computer Methods and Programs in Biomedicine. 142, 43-54 (2017).
- Kojima, M., Nakajima, K., Ishii, G., Saito, N., Ochiai, A. Peritoneal elastic laminal invasion of colorectal cancer: the diagnostic utility and clinicopathologic relationship. American Journal of Surgical Pathology. 34 (9), 1351-1360 (2010).
- Nakanishi, Y., et al. Reappraisal of Serosal Invasion in Patients With T3 Colorectal Cancer by Elastic Stain. ARCHIVES OF PATHOLOGY & LABORATORY MEDICINE. 140 (1), 81-85 (2016).
- Grin, A., et al. Peritoneal elastic lamina invasion: limitations in its use as a prognostic marker in stage II colorectal cancer. Human Pathology. 44 (12), 2696-2705 (2013).
- Stewart, C. J., Brennan, B. A., Crook, M. L., Russell, P. Value of elastin staining in the assessment of peritoneal implants associated with ovarian serous borderline tumours. Histopathology. 51 (3), 313-321 (2007).
- Kojima, M., et al. Pathological diagnostic criterion of blood and lymphatic vessel invasion in colorectal cancer: a framework for developing an objective pathological diagnostic system using the Delphi method, from the Pathology Working Group of the Japanese Society for Cancer of the Colon and Rectum. Journal of Clinical Pathology. 66 (7), 551-558 (2013).
- Elston, C. A., Kazlouskaya, V., Elston, D. M. Elastic staining versus. fluorescent and polarized microscopy in the diagnosis of alopecia. Journal of the American Academy of Dermatology. 69 (2), 288-293 (2013).
- Vos, A., et al. Predominance of Nonatherosclerotic Internal Elastic Lamina Calcification in the Intracranial Internal Carotid Artery. Stroke. 47 (1), 221-223 (2016).
