pT3N0M0 위암 조직의 파라핀 내장 슬라이드에 탄성 염색
Summary
여기에서, 우리는 포르말린 고정, 파라핀 내장 절편에 pT3N0M0 위암 조직에서 탄성 섬유를 확인하기 위하여 탄성 염색의 프로토콜을 제시합니다. 이어서, 우리는 종양 세포가 탄성 라미나 너머로 침입하는지 여부를 결정하는 방법을 기술한다.
Abstract
탄성 층은 일반적으로 복막 중피 세포에 인접한 중피 하부 층에 위치하며, 헤마톡실린 및 호신 (H&E) 염색에 양과성이지만 탄성 염색을 통해 시각화 할 수 있습니다. 탄성 염색의 중요한 이점 중 하나는 종양 세포가 탄성 라미나 너머로 침입했는지 여부를 쉽게 확인할 수 있다는 것입니다. 이것은 복부 표면 침략의 넓이를 검토하는 것을 돕고, 이로서 위장암에 있는 pT3 그리고 pT4 단계를 구별합니다. 본 연구에서, 우리는 포르말린 고정, 파라핀 내장 pT3N0M0 위암 조직 섹션에서 탄성 섬유를 식별하는 프로토콜을 제시한다. 우리는 슬라이드에 고정 된 5-μm 파라핀 섹션을 준비하고 모든 슬라이드는 염색 절차 중에 분리되고 재수화됩니다. 그 후, 모든 섹션은 과망간산 칼륨에 의해 산화되고, 옥살산에 의해 표백되고, 탄성 염색으로 염색되고, 반 기슨에 의해 반염색됩니다. 마지막으로, 우리는 염색의 효과를 검토; 탄성 라미나는 청색-블랙염색되고 콜라겐 섬유는 빨간색으로 염색되고 암세포는 다양한 노란색 음영으로 염색됩니다. 우리는 또한 암세포와 탄성 라미나 사이의 위치 관계를 결정하는 데 사용되는 방법을 자세히 설명합니다. 이 방법은 탄성 섬유에 대한 탁월한 선택성 및 본격적인 결과로 인해 위장암에서 후막 표면 침습의 식별에 간단하고, 저렴하며, 널리 적용 가능하다.
Introduction
종양, 노드 및 전이(TNM) 암 발판 시스템에 따라, 병리학 단계 pT4에서 위암의 예후는 pT3(제8UICC/AJCC)에서보다 훨씬더 나쁘다 1. 위암으로, 1 차적인 종양 (pT)의 분류는 일반적으로종양 침략의 깊이에 달려 있습니다 2. 병리학적인 단계 pT3 위암은 근위 세포증을 통해 서체 조직으로 침입하는 암으로 정의되는 반면, pT4 위암은 내장 복막의 표면에 관통하는 암으로 정의됩니다. 침막 표면의 존재 침략은 두 단계2를구별하는 열쇠입니다. 그러나, 후막 중피 세포층이 매우 얇기 때문에, 수술, 수술 후 치료 및 고정 시 손상될 수있다3. 더욱이, 종양 관련 염증성 변화와 섬유증은 후막의 정상적인 해부학을 손상시킬 수 있으며, 이는 H&E 염색 4를 사용하여 후막표면 침입을 정확하게 판단하기가 매우 어렵다. 세포학 및 면역조직화학과 같은 현재의 보조 진단 방법은가양성이거나 비용 효율성이 낮기 때문에 진단값 5,6이 제한된다.
상기 혈청막은 복막, 흉막 및 심낭을 포함하며, 중피, 지하막 및 중피하 부층7로구성된다. 혈청 막의 한 가지 일반적인 조직학적 특징은 중피 세포8,9에인접한 하부 중피 층에 탄성 층의 존재이다. 탄성 라미나는 강한 항손상 능력을 가지며 중피 세포가 심한 종양 관련 염증 또는 섬유증에 의해 파괴되는 경우 대체 예후 마커로서 작용할 수있다3. 탄성 라미나는 주로 탄성 염색에 의해 시각화 될 수있는 엘라스틴과 마이크로 피브릴(10)로구성된다. 탄성 염색의 사용 뒤에 주된 이유는 엘라스틴이 엘라스틴 용액에 있는 레소시놀의 페놀 그룹과 수소 결합을 형성하고, 탄성 섬유가 청색 – 검은 색으로 염색되는 원인이되기 때문입니다. 반 기손(VG)이 대조되는 염색 후, 콜라겐 섬유는 적색 및 근육 섬유및 적혈구를염색할 수 있으며 황색 8,11,12,13.
폐암의 TNM 발판의 제8판은 내장 흉막 침막(T2)을 내장 흉막의 표면에서탄성 라미나 또는 침윤을넘어서는 종양 침입으로 정의한다 2. 대장암에 대한 연구는 pT3 대장암의 탄성 라미나 침입이 예후 가 불량한 이유일 수 있음을 보여주었습니다. 대장암의 5년 질병 없는 전반적인 생존율은 또한 pT4a13,14,15와같은 것으로 입증되었다. 탄성 염색에 대한 우리의 이전 연구에 기초하여, 탄성 층상 침수는 pT3 위암의 예후에 상당한 부정적인 영향을 미치고 pT4a 위암(12)과 동일한 방식으로 치료되어야 한다는 것이 밝혀졌다. 따라서, 이 간단하고 비용 효과적인 방법은 H&E 염색을 통해 얻은 결과의 불확실성을 제거하는 데 도움이 될 수 있으며, 세포학 및 면역 조직 화학을 포함한 다른 보조 진단 방법과 관련된 기타 일반적인 한계를 제거하는 데 도움이 될 수 있습니다. 다른. 이 방법은 위장관암의 후막 표면 침입을 진단하기 위해 효율적으로 사용할 수 있습니다, 특히 일부 모호한 경우에. H&E 얼룩 및 기타 얼룩은 일반적으로 이러한 침입을 식별하기 어렵기 때문에 편리합니다. 이 방법은 또한 특히 탄성 섬유에 매우 선택적이기 때문에 결과의 신뢰성을 보장합니다. 여기서, 우리는 종양 세포가 pT3N0M0 위암(12)에서 탄성 라미나에침입했는지 여부를 확인하기 위해 탄성 염색을 실시한다.
이 방법은 포르말린 고정, 파라핀 내장 섹션에 조직에서 탄성 섬유를 식별하는 데 사용되며, 냉동 섹션에도 사용될 수있다. 여기에서, 우리는 세포와 조직 형태학의 제일 정비를 위한 파라핀 내장 된 단면도를 선택합니다. 이 프로토콜의 모든 단계는 실온에서 수행됩니다. 제시된 연구에서는 과망간산 칼륨, 옥산 용액, 엘라스틴 용액 및 Van Gieson 용액을 포함하는 상업용 염색 키트가 사용됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기서 제안된 이 방법은 서브세로살 탄성 라미나 를 식별하기 위한 정확한 접근법을 제공한다. 상기 방법은 종양 세포가 pT3N0M0 위암(12)에서 탄성 라미나에 침입했는지 여부를 평가하는데 사용될 수 있다. 탄성 라미나는 콜라겐 섬유와 쉽게 구별 할 수없는 H & E 염색 섹션에서 적색이며 세포학 및 면역 조직 화학과 같은 다른 기존 보조 진단 방법도 제한된 진단 값을 발휘했습니?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 국립 자연 과학 재단 (NO.81401902 및 NO.81501992)과 후난 자연 과학 재단 (NO.2017SK2134, NO.2018JJ2238)의 지원에 감사드립니다. 원고는 광레이에 의해 작성되었습니다. 전체 실험은 광레이와 하이옌 양에 의해 수행된다. 저자는 병리학자와 환자의 데이터를 추적 동료의 도움에 감사드립니다.
Materials
| Elastin-Van Gieson staining kit | Baso | BA4083B | Used for staining of elastic fibers, collagen fibers and myofibers |
| Permount TM Mounting Medium | MXB Biotechnologies | DAB-0033 | Used for mounting |
| Ethanol | LMAI Bio | LM64-17-5 | 100% |
| Xylene | LMAI Bio | LX820585 |
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