Summary
Hier präsentieren wir Ihnen die Protokolle zur Nutzung von Insekten Zell- und Baculovirus Protein Expressionssystems zu produzieren große Mengen an Pflanzeneiweiß abgesondert für Protein Kristallisation. Ein Baculovirus Expressionsvektor wurde entweder mit GP67 oder Insekt Hemolin Signalpeptid für Pflanze Sekretion Proteinexpression in Insektenzellen geändert.
Abstract
Es war eine Herausforderung für die Wissenschaftler rekombinante sekretorischen eukaryotic Proteine für strukturelle und biochemische Studien zum Ausdruck bringen. Das Baculovirus-vermittelten Insekt Ausdruck Zellsystem ist eines der Systeme verwendet, um rekombinante eukaryotic sekretorische Proteine mit einigen Post-translationalen Modifikationen auszudrücken. Die sekretorischen Proteine müssen durch die sekretorischen Wege für Protein Glycosylation, Disulfid-Bindungen-Bildung und andere Post-translationalen Modifikationen weitergeleitet werden. Um die vorhandenen Insekten Zelle Ausdruck von sekretorischen Pflanzeneiweiß zu verbessern, wird ein Baculovirus Expressionsvektor durch die Zugabe von entweder ein GP67 oder ein Hemolin Signal Peptidsequenz zwischen dem Veranstalter und Klonen von mehreren Seiten geändert. Dieses neu gestaltete modifizierte vektorsystem produziert erfolgreich eine hohe Ausbeute an löslichen recombinant sekretierten Pflanze Rezeptorproteine von Arabidopsis Thaliana. Zwei der zum Ausdruck gebrachten pflanzlichen Proteinen, die extrazellulären Domänen von Arabidopsis TDR und PRK3 Plasma Membranrezeptoren, wurden für x-ray kristallographische Untersuchungen kristallisiert. Das modifizierte vektorsystem ist ein verbessertes Werkzeug, das potentiell für die Expression rekombinanter sekretorische Proteine im Tierreich als auch verwendet werden kann.
Introduction
Es ist unerlässlich für ein Forschungslabor in der Lage, große Mengen an homogene rekombinante Proteine für Biochemische und biophysikalische Charakterisierungen, speziell für x-ray kristallographischen Studien sein. Es gibt viele etablierte heterologen Expressionssysteme wie Escherichia coli, Hefe, Insektenzellen, Säugerzellen, Pflanzenzellen, etc. unter ihnen, das Baculovirus-vermittelten Insekt Ausdruck Zellsystem ist eines der wichtigsten häufig verwendeten Techniken, große Mengen von strukturell gefalteten großformatigen rekombinante eukaryotic Proteine für Protein Kristallisation1produzieren.
Expressionsvektoren des Expressionssystems Baculovirus wurden entwickelt, um eine starke Polyhedrin oder P10-Promoter zu produzieren eine hohe Ausbeute an rekombinanten intrazelluläre Proteine2,3enthalten. Um eine rekombinante Baculovirus zu machen, ist das Gen des Interesses in ein Insekt Vektor mit den Polyhedrin (Polh) Locus des Genoms Autographa Californica Multi-Nucleopolyhedroviral geklont. Das entstehende Konstrukt dann sequenziert und seine korrekte offenen Leserahmen (ORF) überprüft. Das richtige Konstrukt wird dann in die Wirtszelle Insekt durch den Prozess der Transfektion eingeführt. Das Gen des Interesses wird durch homologe Rekombination in das virale Genom eingefügt. Dieses Ereignis führt zu die Produktion von das rekombinante virale Genom, welche dann repliziert, rekombinante produzieren Virus Partikel1treibt.
Die Insekten, die am häufigsten in Expressionssystems dienen Sf9 und hoch fünf (Hi5) Zellen sind. Sf9 Zellen eine klonale Isolat Sf21, abgeleitet aus den pupal Eierstockkrebs Zellen von Spodoptera Frugiperda, und Hi5 Zellen eine klonale isolieren die elterliche Trichoplusia ni Eierstock Zelle Zeile TN-3684,5abgeleitet. Co Transfektionen, Virus-Verstärkung und Plaque-Assays sind auf Sf9 Zellen durchgeführt, während Hi5 Zellen in der Regel ausgewählt werden, um größere Mengen von rekombinanten Proteinen6zu produzieren. Es ist erwähnenswert, dass die Hi5-Zellen nicht geeignet für die Erzeugung und Verstärkung des Virus Stammarten wegen ihrer Tendenz, mutierte Viren zu produzieren. Traditionell gilt ein Temperaturbereich von 25-30 ° C gut für den Anbau von Insektenzellen. Allerdings wurde berichtet, dass 27-28 ° C die optimale Temperatur für die Insekten Zelle Wachstum und Infektion7,8 ist.
Die Einführung einer starken Signal-Sequenz vor das Gen ist für die hohe Expression von die sekretierten Proteine erforderlich. Die Signalsequenz würde effizient übersetzten rekombinanten Proteins in das endoplasmatische Retikulum für Protein Sekretion und Post-translationalen Modifikationen notwendig für die korrekte Faltung und Stabilisierung3führen. Signal-Peptid-Sequenzen, wurden wie z. B. das Baculovirus Protein GP64/67, Honigbiene Melittin, und andere, umhüllen ausgewählt, um den Ausdruck des sekretorischen rekombinante Proteine in das Baculovirus-vermittelten Expression Systeme3zu erleichtern. Die Einführung der Signalpeptid des GP67 hat sich gezeigt, um den Ausdruck Ertrag eines sekretierten rekombinanten Proteins, im Vergleich mit der intrinsischen Signalpeptid des Ziel-gen9zu verbessern. Hemolin ist ein Hämolymphe Protein der riesigen Seide Motte Hyalophora Cecropia, Bakterien-Infektion10induziert. Die Signal-Peptid-Sequenz des Gens ist aufgrund der relativ hohen induzierten Ausdruck lässt sich Sekretion Expression rekombinanter Proteine in das Baculovirus-Insekt Zellsystem zu vermitteln.
Die A. Thaliana Tracheary Elements Differenzierung hemmenden Faktor-Rezeptor (TDR) und Pollen Rezeptor-Kinase 3 (PRK3) beide zu der Leucin-reiche Wiederholung Rezeptor-wie Kinase (LRR-RLK) Pflanzenfamilie der Proteine11,12 gehören . Um die Struktur und Funktion dieser Familie der Pflanze die Rezeptor-Proteine, sowie die strukturelle und biochemische Charakterisierung von anderen abgesondert Pflanzeneiweiß zu erleichtern zu studieren, hat das Baculovirus-Insekt Zelle Ausdruck System, modifiziert Protein-Qualität und Ertrag zu verbessern. Die extrazellulären Domänen der TDR und PRK3 wurden erfolgreich mit zwei modifizierte Expressionsvektoren in dem Ausdruck Baculovirus-Insekt Zellsystem geäußert. Sowohl die extrazellulären Domänen der TDR und PRK3 Proteine haben kristallisiert. Dieser Artikel berichtet der Ausdruck und die Reinigung von großen Mengen von rekombinanten sekretierten Pflanzeneiweiß mit zwei modifizierte Baculovirus Expressionsvektoren durch den Einbau eines GP67 oder einer Hemolin Signalsequenz zwischen dem Projektträger und mehreren Klonen Seiten.
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Protocol
Hinweis: Eine Insekt Zelle/Baculovirus-System mit veränderten Expressionsvektoren sekretorischen Pflanze Proteinexpression und Kristallisation wird verwendet.
1. Änderung eines Baculovirus Ausdruck Vektors mit der GP67-Signalpeptid für Pflanze Proteinexpression Sekretion
- Ein DNA-Fragment mit einer 5' BglII schneiden Seite13, die GP67 Sekretion Signalsequenz und eine Multi-Klonen Website mit NotI, BamHI EcoRI, StuI, SalI, SpeI, XbaI, PstI und XhoI (Abbildung 1A) zu synthetisieren.
Hinweis: Da BglII und BamHI verdaut DNA führte in den gleichen Klebstoffen enden, der linearisierte Vektor kann auf das verdaute DNA-Fragment verbinden, während die BglII und BamHI Seiten nacheinander geglühten Ligatur zu einer Sequenz mutiert werden werden, die nicht von spaltbaren entweder BglII oder BamHI14. - Digest 4 µg DNA mit BglII und XhoI und 4 µg ein Ausdruck Vektor-DNA mit BamHI und XhoI14. Mischen Sie 10 Einheiten jedes Restriktionsenzym mit der DNA in einem 1 x Konzentration Reaktion Puffer (50 mM Kalium Acetat, 20 mM Tris-Acetat, 10 mM Magnesium-Acetat und 100 µg/mL BSA, pH 7,9 bei 25 ° C) und inkubieren Sie die Mischung bei 37 ° C für 4 h.
- Reinigen Sie die ausgeschnittenen DNA-Fragment und den linearisierten Vektor-DNA durch eine DNA-Gel Extraction Kit15.
- Mix 100 ng der linearisierten Vektor-DNA mit 400 ng der verdauten DNA fragment in einem 10-µL Ligatur Reaktionsgemisch mit 1 x T4 DNA-Ligase Reaktion Puffer (50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 1 mM ATP, und 10 mM DTT, pH 7,5 bei 25 ° C) und 5 Einheiten der T4-DNA Ligase. Inkubieren Sie die Reaktionsmischung bei 16 ° C 16 h.
- Verwandeln Sie 5 µL der Ligatur Mischung in 100 µL DH5α kompetente Zellen nach einem standard Umwandlung Protokoll und wählen Sie die daraus resultierenden Kolonien auf eine Ampicillin-LB-Agar-Platte-16. Nehmen Sie 5-10 Kolonien und wachsen Sie jede Kolonie in 2 mL LB-Medium mit 100 µg/mL Ampicillin bei 220 u/min und 37 ° C in einem schütteln Inkubator für 16 h.
- Extrahieren Sie jedes Plasmid DNA mit einem DNA-Miniprep Kit17 und bestätigen Sie die Klone durch DNA-Sequenzierung mit einem Primer AGTATTTTACTGTTTTCGTAACAG.
- PCR-verstärken das A. Thaliana TDR gen fragment Codierung Rückstände 30-642 von einem synthetischen TDR-gen zu konstruieren (Grundierung weiterleiten: CATG GCGGCCGC CTCAAGTTTTCACCTCAACTCTTGTC, rückwärts-Primer: GC GGATCC CTA GTG GTG ATG GTG GTG GTG ACCGTCTATATCTGCATTTCCGGC). Verstärken Sie die DNA für 30 Zyklen in einem DNA-Polymerase-Reaktion-Puffer mit einem 0,5 mM dNTP-Mix, 0,2 µM Primer, 0,1 µg der Schablone DNA, 0,4 mM MgCl2und 1 Reaktionseinheit der DNA-Polymerase.
- Für die PCR-Zyklus-Schritte festlegen der anfänglichen Denaturierung bei 95 ° C für 30 s und dann 30 Zyklen der Denaturierung bei 95 ° C für 30 s, bei 55 ° C für 30 s und Erweiterung bei 72 ° C für 1 min, mit der letzten Erweiterung bei 72 ° C für 5 min glühen.
- Die PCR-Fragment und den modifizierten Vektor mit NotI und BamHI Einschränkung Endonuklease Enzyme zu verdauen. Verbinden Sie das Gen-Fragment mit der linearisierten Vektor. Mix 100 ng der linearisierten Vektor-DNA mit 400 ng der verdauten DNA fragment in einem 10-µL Ligatur Reaktionsgemisch mit T4 DNA-Ligase Reaktion Puffer und 5 Einheiten des T4 DNA-Ligase. Inkubieren Sie die Reaktionsmischung bei 16 ° C 16 h.
- Verwandeln Sie 5 µL der Ligatur Mischung in 100 µL DH5α kompetente Zellen nach einem standard Umwandlung Protokoll und wählen Sie die daraus resultierenden Kolonien auf eine Ampicillin-LB-Agar-Platte-16. Bestätigen Sie die korrekte Klone durch DNA-Sequenzierung.
(2) Änderung des Baculovirus Ausdruck Vektor mit der Insekten Hemolin Signalpeptid für Pflanze Proteinexpression Sekretion
- Ein DNA-Fragment mit einer 5' BglII schneiden Seite13, das Insekt Hemolin Sekretion Signalsequenz und eine Multi-Klonen Website mit NotI, BamHI EcoRI, StuI, SalI, SpeI, XbaI, PstI und XhoI (Abbildung 1 b) zu synthetisieren.
- Digest 4 µg DNA mit BglII und XhoI und 4 µg ein Ausdruck Vektor-DNA mit BamHI und XhoI14. Mischen Sie 10 Einheiten jedes Restriktionsenzym mit der DNA in einem 1 x Konzentration Reaktion Puffer (50 mM Kalium Acetat, 20 mM Tris-Acetat, 10 mM Magnesium-Acetat und 100 µg/mL BSA, pH 7,9 bei 25 ° C) und inkubieren Sie die Mischung bei 37 ° C für 4 h.
- Reinigen Sie die ausgeschnittenen DNA-Fragment und den linearisierten Vektor-DNA durch eine DNA-Gel Extraction Kit15.
- Mix 100 ng der linearisierten Vektor-DNA mit 400 ng der verdauten DNA fragment in einem 10-µL Ligatur Reaktionsgemisch mit 1 x T4 DNA-Ligase Reaktion Puffer (50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 1 mM ATP, und 10 mM DTT, pH 7,5 bei 25 ° C) und 5 Einheiten der T4-DNA Ligase. Inkubieren Sie die Reaktionsmischung bei 16 ° C 16 h.
- Verwandeln Sie 5 µL der Ligatur Mischung in 100 µL kompetente Zellen DH5α, und wählen Sie die Kolonien auf eine Ampicillin-LB-Agar-Platte. Nehmen Sie 5-10 Kolonien und wachsen Sie jede Kolonie in einem 2-mL LB-Medium mit 100 µg/mL Ampicillin bei 220 u/min und 37 ° C in einem schütteln Inkubator für 16 h.
- Plasmid-DNA mit einem DNA-Miniprep Kit17 extrahieren und die Klone durch DNA-Sequenzierung mit einem Primer AGTATTTTACTGTTTTCGTAACAG bestätigen.
- PCR-verstärken A. Thaliana Pollen Rezeptor-Kinase 3 (PRK3) Gen Fragment Codierung Rückstände 20-237 aus einem synthetischen PRK3 genkonstrukt (Grundierung weiterleiten: CATG GCGGCCGC CTACAAAACGTTAGTGAATCGGAACC, rückwärts-Primer: CGC GGATCC CTA GTG GTG ATG GTG GTG GTG TGAAGGTTTCTCATCGCATTCTATATTC). Verstärken Sie die DNA für 30 Zyklen in einem DNA-Polymerase-Reaktion-Puffer mit einem 0,5 mM dNTP-Mix, 0,2 µM Primer, 0,1 µg der Schablone DNA, 0,4 mM MgCl2und 1 Reaktionseinheit der DNA-Polymerase.
- Für die PCR-Zyklus-Schritte festlegen der anfänglichen Denaturierung bei 95 ° C für 30 s und dann 30 Zyklen der Denaturierung bei 95 ° C für 30 s, Glühen bei 55 ° C für 30 s und Erweiterung bei 72 ° C für 30 s in jedem Zyklus, und die letzte Erweiterung bei 72 ° C für 5 Minuten.
- Die PCR-Fragment und den modifizierten Vektor mit NotI und BamHI Einschränkung Endonuklease Enzyme zu verdauen. Verbinden Sie das Gen-Fragment mit der linearisierten Vektor. Mix 100 ng der linearisierten Vektor-DNA mit 400 ng der verdauten DNA fragment in einem 10-µL Ligatur Reaktionsgemisch mit T4 DNA-Ligase Reaktion Puffer und 5 Einheiten des T4 DNA-Ligase. Inkubieren Sie die Reaktionsmischung bei 16 ° C 16 h.
- Verwandeln Sie 5 µL der Ligatur Mischung in 100 µL DH5α kompetente Zellen nach einem standard Umwandlung Protokoll und wählen Sie die daraus resultierenden Kolonien auf eine Ampicillin-LB-Agar-Platte-16. Bestätigen Sie die korrekte Klone durch DNA-Sequenzierung.
3. Produktion und Verstärkung des Baculovirus baut das rekombinante Protein Expressionskassette beherbergen
- Einsatz 100 ng des Plasmids Konstrukt, 40 µL kompetente Zellen DH10Bac nach dem Protokoll des Baculovirus Ausdruck System1zu verwandeln. Inkubieren Sie die Verwandlung-Platten bei 37 ° C für 48 h.
- Zwei weiße Kolonien von jeder Transformation Platte abholen, jede Kolonie in 2 mL LB-Medium mit 50 µg/mL Kanamycin, 7 µg/mL Gentamicin und 10 µg/mL Tetracyclin zu impfen. Folgen Sie das Protokoll des Baculovirus Ausdruck System1 zu extrahieren und die Bacmid DNA zu überprüfen. Aliquoten jedes DNA in zwei Röhren mit jeweils 20 µL und speichern Sie die Rohre bei-20 ° C.
Hinweis: Die folgenden Schritte erfordern eine aseptische Operation. - Wachsen einer Monoschicht Sf9 Zellen in der Kultur Medien mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS) und 100 µg/mL (oder 100 I.U./mL) Penicillin-Streptomycin Antibiotika bei 27 ° C bis 80 % Zusammenfluss in einem 6-Well-Platte. Schätzen Sie den Prozentsatz der Mündung ausgehend vom prozentualen Anteil der überdachte Fläche auf der Gewebekultur-Platte.
- Bereiten Sie die folgenden Lösungen in zwei sterile 1,5 mL Zentrifuge Röhren.
- Röhre 1: Für jede Transfektion verdünnen Sie 20 µL Bacmid DNA in 100 µL unsupplemented Sf9 Zellkulturmedium ohne Antibiotika. Mischen Sie die Verdünnung von flicking die Seite des Röhrchens vorsichtig.
- Rohr 2: Für jede Transfektion verdünnen Sie 8 µL Lipid Transfection Reagens in 100 µL unsupplemented Sf9 Zellkulturmedium ohne Antibiotika. Mischen Sie die Verdünnung von oben und unten für 6 X pipettieren gründlich.
- Kombinieren Sie die beiden Lösungen, mischen Sie sie sanft durch pipettieren langsam rauf und runter für 3 X und inkubieren sie 20-40 min bei Raumtemperatur.
- Waschen jede Vertiefung der Monolage Sf9 Zellen 2 X mit 3 mL unsupplemented Sf9 Zellkulturmedium ohne Antibiotika. Fügen Sie für jede Transfektion 0,8 mL unsupplemented Sf9 Zellkulturmedium ohne Antibiotika zu jedes Röhrchen enthält die Lipid-DNA-Mischung hinzu. Mischen Sie der Inhalt der Röhren durch pipettieren langsam rauf und runter für 3 X vorsichtig. Aspirieren Sie waschen Medien von den Platten und überlagern Sie die Proben mit der Transfektion Mischung zu.
- Nach der Zugabe der Transfektion Mischung inkubieren der transfizierten Platte für 5 h bei 27 ° C. Ersetzen Sie die Transfektion Medien mit der kompletten Sf9 Zellkulturmedium mit 10 % FBS und 100 µg/mL (oder 100 I.U./mL) Penicillin-Streptomycin Antibiotika. Inkubieren Sie die transfizierte Platte bei 27 ° C für 4D.
- Ernte und verstärken die rekombinante Baculovirus.
- Den überstand der infizierten Platte in ein steriles 15 mL konische Röhrchen nach 4D Inkubation abholen. Drehen Sie den Überstand bei 1010 X g für 5 min, die Zelle Ablagerungen zu entfernen. Verwerfen Sie das Pellet zu und Dekantieren Sie den überstand in ein sauberes Röhrchen und bewahren sie bei 4 ° C für bis zu 1 Jahr.
Hinweis: Dies ist der P0-Virus. Es kann für einen längeren Zeitraum hinweg regelmäñig und bei-80 ° C gelagert werden. - Um jede rekombinanten Virus zu verstärken, wird eine Monolage Sf9 Zellen auf eine 150-mm-Platte 80 % Zusammenfluss. Aspirieren Sie die Medien von der Platte, der Zellen-Anhänger auf die Platte 2 mL des P0 Virus hinzu und inkubieren Sie die Platte für 1 h in einem Inkubator 27 ° C. Rocken Sie die Platte alle 15 min um das Medium mit den Zellen zu mischen.
- Fügen Sie 25 mL des kompletten Graces Medium mit 10 % FBS und 100 µg/mL (oder 100 I.U./mL) Penicillin-Streptomycin Antibiotika. Inkubieren Sie die Platte für 3-d in einem Inkubator 27 ° C, die P1-Passage-Virus zu erhalten.
- Sammeln des Überstands der infizierten Platte in ein steriles 50 mL konische Röhrchen und Spin 1010 X g für 5 min, die Zelle Ablagerungen zu entfernen. Den überstand in ein sauberes Röhrchen dekantieren und bis zu 1 Jahr bei 4 ° C lagern.
Hinweis: Das P1-Virus kann regelmäñig und bei-80 ° C gelagert für einen längeren Zeitraum hinweg sein. - Um den Virus von P1 auf P2 Passage zu verstärken, wachsen Sie einem monomolekularen Film Sf9 Zellen auf eine 150-mm-Platte zu 90 % Zusammenfluss, Aspirieren Sie die Medien der Platte, Platte 2 mL des P1-Virus hinzu, und 1 h in einem Inkubator 27 ° C inkubieren.
- Wiederholen Sie die Schritte 3.8.2 und 3.8.3, P2 und P3 Passagen der Viren zu erhalten. Lagern Sie die P3-Virus nicht mehr als 2 Monate.
- Den überstand der infizierten Platte in ein steriles 15 mL konische Röhrchen nach 4D Inkubation abholen. Drehen Sie den Überstand bei 1010 X g für 5 min, die Zelle Ablagerungen zu entfernen. Verwerfen Sie das Pellet zu und Dekantieren Sie den überstand in ein sauberes Röhrchen und bewahren sie bei 4 ° C für bis zu 1 Jahr.
(4) Protein-Expression, Reinigung mit NiNTA und Kristallisation
- Kultur 1 L Hi5 Insektenzellen in der Nährmedien mit 100 µg/mL (oder 100 I.U./mL) Penicillin-Streptomycin Antibiotika zu einer Dichte von 2 x 106 bei 100 u/min in einem Inkubator Shaker 27 ° C. Spin-down der Zellen bei 570 X g für 5 min, Dekantieren des Überstandes, Aufschwemmen der Zellen in 20 mL des frisch hergestellten P3-Virus und bei Zimmertemperatur aufbewahren, denn 1 h. sanft schütteln Spin auf die Zellen 1 x alle 15 min aufzuwirbeln.
- Übertragen Sie die Zellen auf 1 L von Nährmedien mit 100 µg/mL (oder 100 I.U./mL) Penicillin-Streptomycin Antibiotika, Kulturzellen bei 100 u/min in einem 27 ° C Inkubator Shaker für 72 h Spin die Zellen bei 1.010 X g für 5 min und den überstand zu sammeln.
- Einsatz-pH-Indikator Streifen passen den pH-Wert des Überstands bis 8,0 durch Zugabe von 0,1 M HCl oder 0,1 M NaOH und Bindung Puffer auf eine Endkonzentration, mit 20 mM Tris-Puffer bei pH 8.0, 100 mM NaCl, und 5 mM Imidazol hinzufügen. Fügen Sie ein gewisses Maß an NiNTA Harz (10-40 mL) basierend auf den geschätzten Ertrag des His-Tags rekombinanten Proteins ausgedrückt.
- Mischen Sie die Lösung auf eine magnetische rühren bei niedriger Drehzahl bei 4 ° C für 1 h waschen das Harz und eluieren Sie gebundenen Proteins nach dem standard NiNTA Reinigung Protokoll18.
- Vorbehaltlich der gereinigten Proteins Ionenaustausch und gel Filtration Chromatographie sowie andere Protein Reinigungsmethoden, um eine homogene Probe zu erzielen.
Hinweis: Für die TDR ektodomäne, 20 mM Tris, pH 8, 100 mM NaCl dienten als Gel Filtration Puffer. Für die PRK3 ektodomäne, 20 mM Bis-Tris, pH 6, 100 mM NaCl dienten als bevorzugte Gel Filtration Puffer.
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Representative Results
Wie in Abbildung 1dargestellt, wurden zwei modifizierte pFastBac1 Baculovirus Expressionsvektoren verwendet, um auszudrücken die sekretierten Proteine mit der GP67 oder der Hemolin Signalsequenz, die intrinsische Signalsequenz des Zielgens zu ersetzen. Die virale GP67 haben Insekt Hemolin Gene nachgewiesen und zu hohen Sekretion Ausdruck Niveaus in den Zellen haben. Fusionsproteine mit einem dieser beiden Signalsequenzen sollen Sekretion Ausdruck Ebenen verbessert haben. Gleich mehrere Klonen Standorte (MCS) in diesen zwei modifizierte Vektoren entwickelt wurden. Eine NotI-Website wurde bewusst auf die 5'-Seite des MCS, platziert, weil NotI eine acht-Nukleotid-Sequenz, anstatt die häufigste sechs-Nukleotidsequenz in vielen anderen Restriktionsschnittstellen vorhanden ist. Als solche ist eine NotI-Website in der Zielgene weniger präsent als die meisten anderen Restriktionsschnittstellen, Beschränkungsverdauung und das Klonen von den meisten Zielgene im Vergleich mit anderen Restriktionsschnittstellen praktikabler machen. Das Zielgen zwischen den NotI und einer nachgeschalteten Einschränkung Website Klonen werden nur drei Aminosäureresten, GGR, vor das Zielgen vorstellen.
Die pBac1-GP67 und pBac1-Hem haben bzw. auszudrücken, die extrazellulären Domänen von A. Thaliana -Rezeptoren TDR und PRK3, erfolgreich verwendet worden (Abbildung 2). Nachdem die rekombinante Proteine durch NiNTA mit einem engineering C-terminale 6-Histidin Tag gereinigt wurden, entsprach der durchschnittliche Eiweiß-Ertrag um 20 mg/L von Hi5 Zellen. Die Reinheit der jedes Protein ist in der Nähe oder höher als 50 %, mit SDS-PAGE und Coomassie-Färbung untersucht.
Die rekombinante Proteine der extrazellulären Domänen des TDR und PRK3 wurden weiter durch Größe Ausgrenzung Chromatographie (Abbildung 2) gereinigt. Gereinigte Protein wurde auf 5 mg/mL konzentriert und dann eine Kristallisation Screening unterzogen. Die Bedingungen, die vorläufige Kristalle jedes Proteins ergab, wurden optimiert, bis Proteinkristallen mit eine Größe größer als 20 µm (Abbildung 3) beobachtet wurden. Die Kristallstrukturen der beiden Proteine wurden gemeldeten11,12.
Abbildung 1: Karten der modifizierten pFastBac1 Vektoren. Die DNA-Sequenzen in diesen Bedienfeldern angezeigt wurden eingefügt, stromabwärts der Polyhedrin Förderer der pFastBac1 Vektor, die Signalsequenz Peptid und mehreren Klonen Standorten (MCS) für Zielgene zu besitzen. Beide Vektoren enthalten die gleichen MCS. (A) dieses Panel zeigt eine Abfolge von den Klonen Seiten flussabwärts des Veranstalters Polyhedrin in der pBac1-GP67-Vektor. Übersetzte GP67 Signal-Peptid Aminosäure-Sequenz ist rot gefärbt. Jede eindeutige Einschränkung-Website in der MCS wird mit dem Namen des Standortes mit der Bezeichnung über unterstrichen. (B) dieses Panel zeigt eine Abfolge von den Klonen Seiten flussabwärts des Veranstalters Polyhedrin in der pBac1-Hem-Vektor. Die übersetzten Hemolin Signal-Peptid Aminosäure-Sequenz ist rot gefärbt. Jede eindeutige Einschränkung-Website in der MCS wird mit dem Namen des Standortes mit der Bezeichnung über unterstrichen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Protein-Expression mit der modifizierten pFastBac1 Vektoren in das Baculovirus-Insekt Zellsystem. (A) die ektodomäne TDR wurde in Hi5 Insektenzellen, ausgedrückt durch Nickel-Affinität und Größe Ausgrenzung Chromatographie (S), gereinigt und auf SDS-PAGE Gel gelöst. Das Nickel-Harz wurde einmal mit einem Puffer mit 5 mM Imidazol (Wash 1) und ein zweites Mal mit 20 mM Imidazol (Wäsche 2) gewaschen. (B) ist dies eine SDS-PAGE-Analyse zeigt den Ausdruck und die Nickel-Affinitätsreinigung (NiNTA), sowie die Größe Ausgrenzung Chromatographie von PRK3 ektodomäne. Molekulargewicht (MW) Markierungen mit den entsprechenden Größen sind beschriftet. Die roten Pfeile in jedes Panel bezeichnen die Ausdrücke und die erwarteten Größen von rekombinanten TDR und PRK3 ektodomäne Proteine. Die Multiband-Naturen der exprimierten Proteine sind wahrscheinlich auf heterogenen Glycosylation. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Proteinkristallen der extrazellulären Domänen von Arabidopsis Thaliana TDR und PRK3. (A) dieses Panel zeigt die Proteinkristallen der extrazellulären Domänen von A. Thaliana TDR. (B) diese Tafel zeigt die Proteinkristallen der extrazellulären Domänen von A. Thaliana PRK3. Eine Maßstabsleiste wird unter jedem Bild angezeigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Angesichts der Vielfalt in Größe und Stabilität von den Tausenden der Proteine in den biologischen Systemen vorhanden, ist es oft für eine Forschung empirische Labor zu entscheiden, welche heterologen Expressionssystem muss für den Ausdruck eines spezifischen Proteins gewählt werden. E. Coli Expressionssystems ist oft die erste Wahl für Protein-Expression durch die kurze Lebensdauer der Bakterien, low-cost der Nährmedien und relativer Leichtigkeit Scale-up19. Für den Ausdruck der großen eukaryontischen Proteine mit Größen von mehr als 60 kDa, jedoch mit E. Coli führt System oft zu unlöslichen Proteine in der Aufnahme oder Aggregation20. Für den Ausdruck dieser schwierigen Proteine und anderen sekretierten Proteine möglicherweise das Baculovirus-Insekt Zellsystem Ausdruck günstiger als die E-coli. Besonders wenn sekretierten eukaryotic Proteine zum Ausdruck zu bringen, könnte diese modifizierte Baculovirus-Insekt-Zelle Expressionssystems eine bevorzugte Wahl sein.
Viele sekretierten eukaryotic Proteine, einschließlich Pflanzenproteine abgesondert brauchen komplexe Glykosylierung, Disulfid-Bildung und andere Post-translationalen Modifikationen während Protein Falten und Sekretion21. E. Coli -Systeme müssen nicht die zelluläre Maschinerie, die komplexe Modifikationen für viele der eukaryotic Proteine22zu verarbeiten. Hefe ist eine relativ fortgeschrittene Glykosylierung System als E. Coli23. Für den Ausdruck der sekretierten Proteine in höheren Eukaryoten Arten und Pflanzen stellt das Baculovirus-Insekt Zellsystem jedoch einen erheblichen Vorteil. Da Glykosylierung Proteinfaltung betrifft und Stabilität24, viele der sekretierten rekombinanter Proteine in E. Coli und Hefen Systeme haben einen niedrigen Ertrag und neigen zu aggregieren, vermutlich durch falsche Proteinfaltung. Das Baculovirus-Insekt-System wurde modifiziert, um Protein Glycosylation, wodurch es ein ideales System für den Ausdruck der sekretierten eukaryotic Proteine25zu verbessern. In dieser Studie signalisieren die GP67 und die Hemolin, dass Peptide erfolgreich eingesetzt wurden, um die Sekretion Ausdruck von zwei Pflanze Rezeptorproteine für Protein Kristallisation zu führen. Mit diesen Studien beachten Sie jedoch die Wahl der beiden Signalpeptid ist ein entscheidender Schritt, und es braucht eine systematischere vergleichende Studien mit einer Reihe von Zielgene von verschiedenen Organismen.
Die Idee der Verwendung von GP67 und Hemolin Signal-Peptide zur Sekretion Proteinexpression Verbesserung wurde durch die hohe Expression Erträge der beiden Gene getragen. Jedoch, wenn das Protein Sekretion und posttranslationale Modifikation Maschinen der Ausdruck Host mit den exprimierten rekombinanten Proteinen überlastet sind, möglicherweise die sekretierten rekombinante Proteine nicht angemessene Änderungen, vor allem Glycosylation. Beide veränderten Vektoren wurden erfolgreich zahlreiche Pflanze sekretorische Proteine11,12,26, zum Ausdruck bringen, von denen viele zu aggregieren, neigen dazu, das ist wahrscheinlich wegen der falschen oder unzureichenden Glykosylierung verwendet. Daher für den Ausdruck dieser schwierigen Proteine, sowohl starke als auch schwache Signal-Peptid-Sequenzen müssen getestet werden und die Qualität der exprimierten rekombinanten Proteine verglichen werden soll. Denken Sie daran, dass ein schwaches Signal Peptidsequenz den Gesamtertrag des Proteins senken; jedoch gebe es der Sekretion Maschinerie der Ausdruck Host genügend Kapazität, um die Protein Sekretion und Änderungen verarbeiten.
Neben dem Ausdruck der heterologen sekretierten Proteine in Insektenzellen wurden säugerzelle und Anlagensysteme Zelle Ausdruck erfolgreich in der Überexpression rekombinanter Säugetier und pflanzliche Proteine, bzw.27eingesetzt, 28,29. Im Vergleich zu der heterologen Systemen, die in der Nähe von endogenen Expression Zustand von den Säugetieren oder abgesondert Pflanzenproteine müssen die Maschinen fast native Änderung in den Wirtszellen gut gefaltete Proteine liefern. Die Einschränkung der Nutzung des Systems in der Nähe von Native Ausdruck ist, dass die exprimierten rekombinanten Proteinen können stören die physiologische Funktion der Zellen, die potenziell negative Auswirkungen auf den endgültigen Ausdruck Ertrag der Proteine haben können.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch die neue Fakultät Start Fonds an der North Carolina State University Guozhou Xu unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Incubator shaker | VWR | Model Excella E25 | 27 oC |
| Incubator | VWR | Model 2005 | 27 oC |
| Centrifuge | BECKMAN | Model J-6 | with a swing bucket rotor |
| Herculase II Fusion DNA Polymerase | Agilent | 600677-51 | For PCR amplification of DNA |
| Thermal Cycler | BIO-RAD | Model C1000 Touch | For PCR amplification of DNA |
| Incubator shaker | New Brunswick Scientific | Model I 24 | For growing baceria culture |
| Customer DNA synthesis | GENSCRIPT | ||
| BamHI (HF) | New England Biolabs | R3136S | Restriction Endonuclease |
| BglII | New England Biolabs | R0144S | Restriction Endonuclease |
| NotI (HF) | New England Biolabs | R3189S | Restriction Endonuclease |
| XhoI | New England Biolabs | R0146S | Restriction Endonuclease |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202T | DNA ligation |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | DNA purification from Agorase gel |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | Plasmid DNA purification from bacteria culture |
| Agarose | Thermo Fisher Scientific | 15510-019 | For DNA gel electropherosis |
| MAX Efficiency DH5α competen cell | Invitrogen | 18-258-012 | For transformation of DNA ligation mixture |
| Lennox L LB Broth | Research Product International Corp. | L24066-5000.0 | For making bacteria culture |
| Ampicillin sodium salt | Thermo Fisher Scientific | 11593-019 | Antibiotics |
| Kanamycin Sulfate | Thermo Fisher Scientific | 15160-054 | Antibiotics |
| Tetracycline | Thermo Fisher Scientific | 64-75-5 | Antibiotics |
| Gentamicin | Thermo Fisher Scientific | 15710-064 | Antibiotics |
| MAX Efficiency DH10Bac competent cells | Thermo Fisher Scientific | 10361-012 | For making bacmid DNA |
| S.O.C. Medium | Thermo Fisher Scientific | 15544-034 | For DNA transformation |
| CellFECTIN II Reagent | Thermo Fisher Scientific | 10362-101 | Insect cell transfection reagent |
| Bac-to-Bac Expression System | Thermo Fisher Scientific | 10359-016 | Baculovirus-insect cells expression kit |
| Bluo-gal | Thermo Fisher Scientific | 15519-028 | For isolation of recominant Bacmid DNA |
| IPTG | Thermo Fisher Scientific | 15529-019 | For isolation of recominant Bacmid DNA |
| pFastBac1 | Thermo Fisher Scientific | 10360014 | Baculorirus expression vector |
| Sf9 cells | Thermo Fisher Scientific | 11496015 | Sf9 monolayer cells |
| Hi5 cells | Thermo Fisher Scientific | B85502 | High Five insect cells |
| Grace’s insect medium, unsupplemented | Thermo Fisher Scientific | 11595030 | Sf9 cell transfection minimum medium |
| Grace’s insect medium, supplemented | Thermo Fisher Scientific | 11605102 | Sf9 monolayer cell culture complete medium |
| Sf-900 II SFM | Thermo Fisher Scientific | 10902104 | Sf9 suspension cell culture medium without FBS |
| Express Five SFM | Thermo Fisher Scientific | 10486025 | Hi5 cell culture medium |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | 100 ml (10,000 I.U./ml) |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | 100 ml |
| FBS Certified | Thermo Fisher Scientific | 16000-044 | 500 ml |
| 6-well plates | Thermo Fisher Scientific | 08-772-1B | Flat-bottom |
| 150 mm plates | Thermo Fisher Scientific | 353025 | 100/case |
| 1.5 ml Microcentrifuge Tubes | USA Scientific | 1415-2500 | 500 tubes/bag |
| 15 ml conical screw cap centrifuge tubes | USA Scientific | 1475-0511 | 25 tubes/bag |
| 50 ml conical screw cap centrifuge tubes | USA Scientific | 1500-1211 | 25 tubes/bag |
| Ni-NTA Superflow | Qiagen | 30430 | NiNTA resin |
| pH-indicator strips | EMD Millipore Corporation | 1.09535.0001 | pH 0 - 14 |
References
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