عزل خلايا الكبد الماوس الأساسي لتحليل توليف البروتين الوليدة بأسلوب العلامات غير مشعة L-أزيدوهوموالانيني
Summary
نقدم هنا، بروتوكولا لعزل خلايا الكبد الماوس الأساسي صحية ووظيفية. وقدمت إرشادات للكشف عن البروتين الوليدة كبدي من الركازة التوسيم غير المشعة للمساعدة في فهم الآليات الأساسية تخليق البروتين في سياق التوازن الطاقة الأيض في الكبد.
Abstract
خلايا الكبد خلايا الكبد متني وممارسة وظائف ايضية متعددة، بما في ذلك تجميع وإفراز البروتينات ضروري للتوازن الطاقة الشاملة. خلايا الكبد الأولية المعزولة من الكبد مورين تشكل أداة بيولوجية قيمة لفهم الخصائص الوظيفية أو التغييرات التي تحدث في الكبد. هنا يمكننا وصف أسلوب للعزلة والثقافة من خلايا الكبد الماوس الأساسي قبل تنفيذ أسلوب نضح كولاجيناز خطوتين ومناقشة الاستفادة منها للتحقيق في استقلاب البروتين. هو perfused الكبد من الماوس الكبار التتابع مع حمض tetraacetic جليكول-مكررا (اجتا) وكولاجيناز، متبوعاً بعزل خلايا الكبد مع كثافة المخزن المؤقت التدرج. خلايا الكبد معزولة هذه قابلة للتطبيق على ألواح الثقافة والحفاظ على معظم الخصائص هبت لخلايا الكبد. يمكن استخدام خلايا الكبد هذه التقييمات استقلاب البروتين، بما في ذلك البروتين الوليدة مع الكواشف غير مشعة. ونحن تبين أن خلايا الكبد معزولة يتم التحكم فيها بسهولة وتشمل استقرار أعلى جودة وحجم تخليق البروتين مرتبطة باستقلاب الطاقة عن طريق استخدام رد فعل ربط الكيماوي انتقائية مع بروتين تيتراميثيلرهوداميني (طمره) طريقة الكشف والتحليلات الغربية النشاف. ولذلك، هذا الأسلوب قيمة للتحقيق في تخليق البروتين الوليدة الكبدية مرتبطة بالتوازن الطاقة. يحدد البروتوكول التالي المواد والأساليب لعزل خلايا الكبد الماوس الأساسية عالية الجودة، والكشف عن تخليق البروتين الوليدة.
Introduction
البروتين عنصر هام في تغذية، وحوالي 50% الوزن الجاف لجسم الإنسان يتكون من البروتينات التي لها العديد من الصفات البيولوجية ووظائف1. ونتيجة لذلك، تخليق البروتين أحد الأحداث التي تستهلك معظم الطاقة وتغيير في التمثيل الغذائي البروتين يرتبط جداً مع تطور الأمراض، بما في ذلك الأمراض الأيضية2،،من34. في الكبد، وحسابات تخليق البروتين الحيوي لحوالي 20-30 في المائة من الاستهلاك الإجمالي للطاقة5،6. وباﻹضافة إلى ذلك، وظيفة البروتينات ليس فقط سلبية أو بناء كتل من الكبد، ولكن عوامل نشطة أيضا التوسط في إشارة إينتراسيلولارلي أو اكستراسيلولارلي لتنظيم الأيض الجهازية7. على سبيل المثال، انخفاض مستويات الزلال، الذي يتم تصنيعه ويفرزها الكبد والبروتين الأكثر وفرة في بلازما8، يزيد من خطر النوع 2 السكري التنمية9،10، 11، في حين أن أعلى تركيز ألبومين المصل الحماية ضد تطوير المتلازمة الأيضية12. وعلاوة على ذلك، تشعر بانزعاج أو اضطراب البروتينات الكبدية الافرازية أو الغشاء زمنياً، والتي تعدل التوازن نسبة الكولسترول في الدم، بما في ذلك البروتينات الدهنية، ولدلر، و LRP1، يمكن أن يؤدي إلى تطوير مقاومة الأنسولين، والدهون، أو تصلب الشرايين 13-ولذلك، تحديد الآليات الفيزيولوجية المرضية الجزيئية التي تشارك في اضطرابات التمثيل الغذائي البروتين في الكبد ومضاعفاته الأيضية المرتبطة بها قد تكون مفيدة لاكتشاف رواية الدوائية نهج تؤخر ظهور أو علاج الأمراض الأيضية مثل مقاومة الأنسولين وداء السكري والكبد الدهني غير الكحولية.
تخليق البروتين محكم مرتبط بمركز الطاقة الخلوية (مثلاً، تشكيل واحد ببتيد السندات خلال الخطوة استطالة تخليق البروتين يتطلب سندات phosphodiester 414) وينظم مسارات الجزيئية التي بمعنى جملة بين الخلايا وداخلها توافر المغذيات15،16. أمبير-تنشيط بروتين كيناز (أمبك) هو واحد من أجهزة استشعار الطاقة داخل الخلايا التي تحافظ على التوازن الطاقة17. حالما يتم تنشيط أمبك عندما تصبح أقل مستويات الطاقة الخلوية، تعمل أمبك ولها ركائز المستهدفة لتحفيز مسارات تقويضي وتمنع الابتنائية العمليات بما في ذلك البروتين التوليف18،19. تنظيم تخليق البروتين هو توسط الفسفرة متعددة العوامل الترجمة والبروتينات ريبوسومال20. من المذكرة، الهدف الثدييات من ربمسن 1 معقدة (mTORC1)، محرك رئيسي تخليق البروتين، أحد الأهداف الرئيسية من أمبك21. تنشيط المسار mTORC1 يعزز نمو الخلايا وانتشارها بالبروتين تنشيط الترجمة وأوتوفاجي،من2021. ولذلك، فمن المنطقي أن تنشيط أمبك يمكن أن تمنع mTORC1 بوساطة البروتين التوليف22. وفي الواقع، تفعيل AMPK يصد ومباشرة فوسفوريلاتيس mTORC1 على بقايا ثريونين 2446 (Thr2446) مما أدى إلى المنظمة23 وقمع من البروتين الحيوي24. وعلاوة على ذلك، أمبك يمكن أن تمنع غير مباشر وظيفة mTORC1 الفسفرة والتنشيط من التصلب درني المعقدة 2 (TSC2)25 وهي الجهة المنظمة للمراحل الأولى من تتالي الإشارات mTORC1. وباختصار، التقلبات من هذه المسارات في الكبد وكثيراً ما يرتبط بتطور الأمراض الأيضية ولذلك هناك حاجة ماسة لإنشاء أدوات تجريبية فعالة التحقيق في دور هذه المسارات في تنظيم الطاقة و استقلاب البروتين في خلايا الكبد.
وهناك تشابه أقوى بين الخصائص الوظيفية لخلايا الكبد الأولية المعزولة و في فيفو خلايا الكبد من27،،من26 في المختبر المستمدة من الكبد الخلية خطوط28. وقد ثبت أن خلايا الكبد البشرية الأولية مشاركة 77% التشابه مع خزعات الكبد، بينما تعرض الخلايا HepG2، وهي خلايا سرطانية كبدية المتمايزة جيدا وتستخدم على نطاق واسع للتحقيق في وظائف الكبد، أقل من 48% في سياق ملامح التعبير الجيني29. ولذلك، استعمال خلايا الكبد الأولية، بدلاً من خلايا الثقافة مخلدة، له أهمية حيوية في التحقيق في وظيفة الكبد وعلم وظائف الأعضاء، وتتوفر العديد من البروتوكولات للعزلة والثقافة من خلايا الكبد الأولية خاصة من الفئران30،31. بينما خلايا الكبد في الفئران مفيدة مع عائد أعلى نسبيا من الخلايا، خلايا الكبد الماوس على إمكانيات أكبر في العديد من الجوانب العلمية بسبب توافر واسعة من الفئران المعدلة وراثيا. ومع ذلك، هناك العديد من التحديات التقنية في عزل خلايا صحية ووفيرة من الكبد الأولية من الفئران الخلوية والجزيئية-التقييمات المستندة إلى: أولاً، الإدراج القنية نتخلل في الكبد مع الكواشف المخزن المؤقت من الصعب جداً التعامل مع بسبب الوريد البابي الماوس صغيرة ورقيقة أو أدنى الوريد الأجوف؛ ثانيا، يمكن أن يسبب وقتاً أطول من تلاعب بالخلايا من خلال العزل الحد في الخلية الكمية والنوعية؛ أساليب الفصل الثالث، غير الانزيمية الميكانيكية يمكن أن تسفر عن أضرار جسيمة وإنتاج منخفضة عائد من خلايا الكبد الأولية المعزولة قابلة للتطبيق32،33. في الثمانينات، بدأ كولاجيناز نضح تقنية لعزل خلايا الكبد من الكبد من الحيوانات34. ويستند هذا الأسلوب على نضح كولاجيناز الكبد35،،من3637، ضخ الكبد مع الكالسيوم تشيلاتور حل38،39، الهضم الأنزيمي و الميكانيكية تفكك لحمه الكبد35. في الخطوة الأولى، هو perfused كبد ماوس مع المخزن مؤقت حرة كالسيوم [Ca2 +] يتضمن [Ca2 +] تشيلاتور (حمض tetraacetic الإيثيلنديامين، يدتا). في الخطوة الثانية، هو perfused في الكبد الماوس مع عازلة التي تحتوي على كولاجيناز يتحلل التفاعلات المصفوفة خارج الخلية الخلوية. خلافا للمخزن المؤقت المستخدم في خطوة واحدة، الوجود [Ca2 +] الأيونات في المخزن المؤقت للخطوة الثانية المطلوبة لنشاط كولاجيناز فعالة، قد الكبد هضمها بعد ذلك كذلك بلطف وميكانيكيا فصل استخدام الملقط بين كبسولة الكبد والأنسجة بارينتشيماتوس. أخيرا، تتم إزالة النسيج الضام بالتصفية والطرد المركزي اللاحقة يفصل بين خلايا الكبد سليمة من خلايا غير متني على حد سواء، وتتمثل غير الحية باستخدام الكثافة العازلة التدرج40،41 ،42. في هذه الدراسة، نعرض تقنية التروية كولاجيناز خطوتين معدلة لعزل خلايا الكبد الأولية من كبد ماوس للتحليل تخليق البروتين.
راديولابيلينج البروتينات يستخدم على نطاق واسع قياس مستويات التعبير، معدلات دوران الموظفين، وتحديد التوزيع البيولوجي ل البروتينات43 نظراً لحساسية عالية للكشف عن النشاط الإشعاعي44. ومع ذلك، يتطلب استخدام النظائر المشعة البحوث العالية التي تسيطر عليها ظروف وإجراءات45. تم تطوير طرق بديلة غير المشعة واكتسبت شعبية متزايدة. أن رد الفعل ربط الكيماوي انتقائية مع طريقة الكشف عن بروتين تيتراميثيلرهوداميني (طمره) هو واحد منهم ويقوم على رد الفعل الكيماوي الانتقائي بين أزيد وإضافة مجموعات46، التي يمكن أن تستخدم لتحليل الأحداث الخلوية مثل الكشف عن البروتين الوليدة والفئات الفرعية ل glycoproteins تعديل مع جماعة أزيد. تخليق البروتين الوليدة، يمكن أيضي دمج البروتينات L-أزيدوهوموالانيني (L-اها، هو تعديل لأزيد من الأحماض الأمينية) والكشف عنها بواسطة استخدام الأسلوب الكشف عن البروتين طمره47. باستخدام هذا الإنزيم في خلايا الكبد الماوس الأساسي، نحن تظهر أن معدل توليف البروتين الوليدة مشددة مرتبطة بتوافر ATP من الميتوكوندريا وتفعيل أمبك (الشكل 1).
وباختصار، الاستفادة من خلايا الكبد الماوس الأساسي أمر حاسم للتحقيق في استقلاب البروتين والطاقة والتحديد الكمي تخليق البروتين الوليدة قيمة لاكتساب رؤى في دور الفيزيولوجية من المسارات ذات الصلة بتنمية و علاج للأمراض التي تتمثل.
Protocol
Representative Results
Discussion
على الرغم من أن تم اقتراح العديد من خطوط الخلية الكبدية مخلدة واستخدامها للتحقيق في وظائف الكبد49،50،،من5152، تفتقر عموما إلى هذه الخلايا الهامة والأساسية وظائف خلايا الكبد طبيعية، مثل التعبير عن الزلال (الشك?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونشكر الدكتور جونباي كبار المسئولين الاقتصاديين وهوا فيفيان للمدخلات العلمية والمناقشة. وأيد هذا العمل “المعهد الوطني للصحة” (NIH) (R01DK107530). وأيد T.N. المعزوفة من اليابان وكالة العلوم والتكنولوجيا. وأيد بمنحه من المعاهد الوطنية للصحة (P30DK078392) لمركز الجهاز الهضمي الأمراض البحوث الأساسية في سينسيناتي جزءا من هذه الدراسة.
Materials
| HEPES buffer | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| D-glucose | Fisher Scientific | D16-500 | |
| Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-tetraacetic acid | AmericanBio | AB00505-00025 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240-062 | |
| HBSS (10X) no calcium, magnesium, phenol red | Gibco | 14185-052 | |
| Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2.2H2O) | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Density gradient buffer | GE Healthcare | 17-0891-02 | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) low glucose, pyruvate | Gibco | 11885-084 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30910.03 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) (1X) | Gibco | 1897141 | |
| Williams medium E, no glutamine | Gibco | 12551-032 | |
| L-alanyl-L-glutamine dipeptide supplement | Gibco | 35050-061 | |
| Collagenase Type X | Wako Pure Chemical Industries | 039-17864 | |
| Perfusion pump | Cole-Parmer | Masterflex L/S | Equipment |
| IV administration set | EXELINT | 29081 | Equipment |
| A water bath | REVSCI | RS-PB-200 | Equipment |
| Tube heater | Fisher Scientific | Isotemp | Equipment |
| Ethanol | Decon Lab, Inc | 0-39613 | |
| Isoflurane | PHOENIX | 10250 | |
| Autoclaved Cotton Tips | Fisherbrand | 23-400-124 | |
| 100 mm Petri Dish | TPP | 93100 | |
| Connector (Male Luer Lock Ring) | Cole-Parmer instrument | EW-4551807 | |
| 24G catheters | TERUMO | Surflo 24Gx3/4' | |
| 100 μm Filter (CELL STRAINERS) | VWR | 10199-658 | |
| 15 ml conical-bottom centrifuge tubes | VWR | 89039-666 | |
| 50 ml conical-bottom centrifuge tubes | VWR | 89039-658 | |
| Chemoselective ligation reaction PROTEIN ANALYSIS DETECTION KIT, TAMRA ALKYNE | Invitrogen | C33370 | |
| AHA (L-azidohomoalanine) | Invitrogen | C10102 | |
| DMEM (methionine free) | Gibco | 21013024 | |
| L-Cystine Dihydrochloride | SIGMA | C2526 | |
| Laemmli sample buffer | BioRad | 161-0737 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | SIGMA | P9599 | |
| SDS solution (20%) | BioRad | 161-0418 | |
| Tris-HCL (1M) | American Bioanalytical | AB14044-01000 | |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail | SIGMA | P5726 | |
| Protein concentration measuring Kit (Bovin Serum Albumin-BSA) | BioRad | 500-0207 | |
| 6-well tissue culture plate | TPP | 92006 | |
| Digital Heatblock | VWR | 12621-092 | Equipment |
| Multi-Rotator | Grant-bio | PTR-60 | Equipment |
| Ultrasonic Sonicator | Cole-Parmer | GE130PB | Equipment |
| Standard Heavy-Duty Vortex Mixer | VWR | 97043-566 | Equipment |
| A variable mode laser scanner | GE Healthcare Life Science | FLA 9500 | Equipment |
| Coomassie-dye reagent | Thermo Scientific | 24594 | |
| Inverted microscope | Olympus | CKX53 | Equipment |
| Western Blotting apparatus | BioRad | 1658004 | Equipment |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | Equipment |
| Automated cell counter | BioRad | TC20 | Equipment |
| FluorChem R system | proteinsimple | – | Equipment |
| p-Ampka (T172) antibody | Cell signaling | 2535 | |
| Total-AMPK antibody | Cell signaling | 5832 | |
| Albumin antibody | Cell signaling | 4929 | |
| beta actin antibody | Santa Cruz | sc-130656 | |
| Fine scissors and forceps |
References
- Forbes, R. M., Cooper, A. R., Mitchell, H. H. The composition of the adult human body as determined by chemical analysis. Journal of Biological Chemistry. 203, 359-366 (1953).
- Charlton, M. R. Protein metabolism and liver disease. Baillieres Clinical Endocrinology and Metabolism. 10, 617-635 (1996).
- De, F. P., Lucidi, P. Liver protein synthesis in physiology and in disease states. Current Opinion in Clinical Nutrition and Metabolic Care. 5, 47-50 (2002).
- Stoll, B., Gerok, W., Lang, F., Haussinger, D. Liver cell volume and protein synthesis. Biochemical Journal. 287 (Pt 1), 217-222 (1992).
- Brown, G. C. Control of respiration and ATP synthesis in mammalian mitochondria and cells. Biochemical Journal. 284 (Pt 1), 1-13 (1992).
- Buttgereit, F., Brand, M. D. A hierarchy of ATP-consuming processes in mammalian cells. Biochemical Journal. 312 (Pt 1), 163-167 (1995).
- Morrison, C. D., Laeger, T. Protein-dependent regulation of feeding and metabolism. Trends in Endocrinology and Metabolism. 26, 256-262 (2015).
- Bernardi, M., Ricci, C. S., Zaccherini, G. Role of human albumin in the management of complications of liver cirrhosis. Journal of Clinical and Experimental Hepatology. 4, 302-311 (2014).
- Abbasi, A., et al. Liver function tests and risk prediction of incident type 2 diabetes: evaluation in two independent cohorts. PLoS. One. 7, e51496 (2012).
- Schmidt, M. I., et al. Markers of inflammation and prediction of diabetes mellitus in adults (Atherosclerosis Risk in Communities study): a cohort study. Lancet. 353, 1649-1652 (1999).
- Stranges, S., et al. Additional contribution of emerging risk factors to the prediction of the risk of type 2 diabetes: evidence from the Western New York Study. Obesity (Silver Spring). 16, 1370-1376 (2008).
- Jin, S. M., et al. Change in serum albumin concentration is inversely and independently associated with risk of incident metabolic syndrome. Metabolism. 65, 1629-1635 (2016).
- Sluis, B., Wijers, M., Herz, J. News on the molecular regulation and function of hepatic low-density lipoprotein receptor and LDLR-related protein 1. Current Opinion in Lipidology. 28, 241-247 (2017).
- Viollet, B., et al. Activation of AMP-activated protein kinase in the liver: a new strategy for the management of metabolic hepatic disorders. Journal of Physiology. 574, 41-53 (2006).
- Li, H., Lee, J., He, C., Zou, M. H., Xie, Z. Suppression of the mTORC1/STAT3/Notch1 pathway by activated AMPK prevents hepatic insulin resistance induced by excess amino acids. Amerian Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 306, E197-E209 (2014).
- Qian, S. B., et al. mTORC1 links protein quality and quantity control by sensing chaperone availability. The Journal of Biological Chemistry. 285, 27385-27395 (2010).
- Carling, D. The AMP-activated protein kinase cascade–a unifying system for energy control. Trends in Biochemical Sciences. 29, 18-24 (2004).
- Hardie, D. G., Scott, J. W., Pan, D. A., Hudson, E. R. Management of cellular energy by the AMP-activated protein kinase system. FEBS Letters. 546, 113-120 (2003).
- Li, H., et al. AMPK activation prevents excess nutrient-induced hepatic lipid accumulation by inhibiting mTORC1 signaling and endoplasmic reticulum stress response. Biochimica et Biophysica Acta. 1842, 1844-1854 (2014).
- Proud, C. G. Role of mTOR signalling in the control of translation initiation and elongation by nutrients. Current Topics in Microbiology and Immunology. 279, 215-244 (2004).
- Sarbassov, D. D., Ali, S. M., Sabatini, D. M. Growing roles for the mTOR pathway. Current Opinion in Cell Biology. 17, 596-603 (2005).
- Reiter, A. K., Bolster, D. R., Crozier, S. J., Kimball, S. R., Jefferson, L. S. Repression of protein synthesis and mTOR signaling in rat liver mediated by the AMPK activator aminoimidazole carboxamide ribonucleoside. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 288, E980-E988 (2005).
- Cheng, S. W., Fryer, L. G., Carling, D., Shepherd, P. R. Thr2446 is a novel mammalian target of rapamycin (mTOR) phosphorylation site regulated by nutrient status. Journal of Biological Chemistry. 279, 15719-15722 (2004).
- Howell, J. J., et al. Metformin Inhibits Hepatic mTORC1 Signaling via Dose-Dependent Mechanisms Involving AMPK and the TSC Complex. Cell Metabolism. 25, 463-471 (2017).
- Inoki, K., Zhu, T., Guan, K. L. TSC2 mediates cellular energy response to control cell growth and survival. Cell. 115, 577-590 (2003).
- Wilkening, S., Stahl, F., Bader, A. Comparison of primary human hepatocytes and hepatoma cell line Hepg2 with regard to their biotransformation properties. Drug Metabolism Disposition. 31, 1035-1042 (2003).
- Li, A. P., et al. Present status of the application of cryopreserved hepatocytes in the evaluation of xenobiotics: consensus of an international expert panel. Chemico-Biology Interactaction. 121, 117-123 (1999).
- Hengstler, J. G., et al. Cryopreserved primary hepatocytes as a constantly available in vitro model for the evaluation of human and animal drug metabolism and enzyme induction. Drug Metabolism and Reviews. 32, 81-118 (2000).
- Olsavsky, K. M., et al. Gene expression profiling and differentiation assessment in primary human hepatocyte cultures, established hepatoma cell lines, and human liver tissues. Toxicology and Applied Pharmacology. 222, 42-56 (2007).
- Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q., Liu, M. Isolation and primary culture of rat hepatic cells. Journal of Visualized Experiments. , (2012).
- Li, Y., Cai, S., Zhang, L., Li, X. Simultaneous isolation and primary culture of rat hepatocytes, hepatic stellate cells, Kupffer’s cells and hepatic sinus endothelial cells. Nan. Fang Yi. Ke. Da. Xue. Xue. Bao. 34, 532-537 (2014).
- Edwards, M., Houseman, L., Phillips, I. R., Shephard, E. A. Isolation of mouse hepatocytes. Methods in Molecular Biology. 987, 283-293 (2013).
- Schreiber, G., Schreiber, M. The preparation of single cell suspensions from liver and their use for the study of protein synthesis. Subcellular Biochemistry. 2, 307-353 (1973).
- Klaunig, J. E., Goldblatt, P. J., Hinton, D. E., Lipsky, M. M., Trump, B. F. Mouse liver cell culture. II. Primary culture. In Vitro. 17, 926-934 (1981).
- Puviani, A. C., Ottolenghi, C., Tassinari, B., Pazzi, P., Morsiani, E. An update on high-yield hepatocyte isolation methods and on the potential clinical use of isolated liver cells. Comparative Biochemistry and Physiology A Molecular and Integrative Physiology. 121, 99-109 (1998).
- Park, K. H., Song, S. C. Morphology of spheroidal hepatocytes within injectable, biodegradable, and thermosensitive poly(organophosphazene) hydrogel as cell delivery vehicle. Journal of Biosciences and Bioengineering. 101, 238-242 (2006).
- Li, K., et al. Improved performance of primary rat hepatocytes on blended natural polymers. Journal of Biomedicine and Material Research Part A. 75, 268-274 (2005).
- Battle, T., Stacey, G. Cell culture models for hepatotoxicology. Cell Biology Toxicology. 17, 287-299 (2001).
- Kravchenko, L., Petrenko, A., Shanina, I., Fuller, B. A simple non-enzymatic method for the isolation of high yields of functional rat hepatocytes. Cell Biology International. 26, 1003-1006 (2002).
- Berry, M. N., Grivell, A. R., Grivell, M. B., Phillips, J. W. Isolated hepatocytes–past, present and future. Cell Biology and Toxicology. 13, 223-233 (1997).
- Jiang, Q. D., et al. Isolation and identification of bovine primary hepatocytes. Genetics and Molecular Research. 12, 5186-5194 (2013).
- Pertoft, H., Laurent, T. C., Laas, T., Kagedal, L. Density gradients prepared from colloidal silica particles coated by polyvinylpyrrolidone (Percoll). Analytical Biochemistry. 88, 271-282 (1978).
- Lipford, G. B., Feng, Q., Wright, G. L. A method for separating bound versus unbound label during radioiodination. Analytical Biochemistry. 187, 133-135 (1990).
- Mukai, T., et al. In-vivo evaluation of indium-111-diethylenetriaminepentaacetic acid-labelling for determining the sites and rates of protein catabolism in mice. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 51, 15-20 (1999).
- Wilson, M. S. C., Saiardi, A. Importance of Radioactive Labelling to Elucidate Inositol Polyphosphate Signalling. Topics in Current Chemistry. 375, 14 (2017).
- Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. A stepwise huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective "ligation" of azides and terminal alkynes. Angewandte Chemie International Edition. 41, 2596-2599 (2002).
- Banerjee, P. S., Ostapchuk, P., Hearing, P., Carrico, I. S. Unnatural amino acid incorporation onto adenoviral (Ad) coat proteins facilitates chemoselective modification and retargeting of Ad type 5 vectors. Journal of Virology. 85, 7546-7554 (2011).
- Hou, W. L., et al. Inhibition of mitochondrial complex I improves glucose metabolism independently of AMPK activation. Journal of Cell Molecular Medicine. 22, 1316-1328 (2018).
- Davalos, A., et al. miR-33a/b contribute to the regulation of fatty acid metabolism and insulin signaling. Proceedings of the National Academy of Science. , 9232-9237 (2011).
- DiPersio, C. M., Jackson, D. A., Zaret, K. S. The extracellular matrix coordinately modulates liver transcription factors and hepatocyte morphology. Molecular and Cellular Biology. 11, 4405-4414 (1991).
- Xu, L., et al. Human hepatic stellate cell lines, LX-1 and LX-2: new tools for analysis of hepatic fibrosis. Gut. 54, 142-151 (2005).
- Yang, L., Li, P., Fu, S., Calay, E. S., Hotamisligil, G. S. Defective hepatic autophagy in obesity promotes ER stress and causes insulin resistance. Cell Metabolism. 11, 467-478 (2010).
- Heinz, S., et al. Mechanistic Investigations of the Mitochondrial Complex I Inhibitor Rotenone in the Context of Pharmacological and Safety Evaluation. Science Reports. 7, 45465 (2017).
