JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Médecine

Birincil fare tetkikine yalıtım doğmakta olan Protein sentez analiz radyoaktif L-azidohomoalanine etiketleme yöntemi tarafından için

Published: October 23, 2018
doi:
10.3791/58323
, , , , , ,
1Department of Pharmacology and Systems Physiology, College of Medicine,University of Cincinnati, 2Division of Endocrinology,Cincinnati Children’s Hospital Medical Center, 3Division of Developmental Biology,Cincinnati Children’s Hospital Medical Center, 4Department of Pediatrics, College of Medicine,University of Cincinnati

Summary

Burada, sağlıklı ve fonksiyonel birincil fare tetkikine yalıtım için bir iletişim kuralı mevcut. Hepatik doğmakta olan protein sentezi tarafından radyoaktif olmayan etiketleme substrat algılamak için yönergeler protein sentezi karaciğer homeostazı enerji metabolizması bağlamında temel mekanizmaları anlamanıza yardımcı olmak için sağlanmıştır.

Abstract

Hepatosit karaciğer parenkima hücrelerdir ve sentez ve sistemik enerji homeostazı için gerekli proteinlerin salgılanmasını da dahil olmak üzere birden fazla metabolik işlevleri meşgul. Birincil tetkikine fare karaciğer izole fonksiyonel özellikleri veya karaciğerde meydana gelen değişiklikleri anlamak için değerli bir biyolojik araç oluşturmaktadır. Burada bir iki adım collagenase perfüzyon teknik gerçekleştirerek yalıtım ve birincil fare tetkikine kültürü için bir yöntem tanımlamak ve protein metabolizması soruşturma için onların kullanımı tartışmak. Yetişkin bir fare karaciğer sırayla etilen glikol bis tetraacetic asit (EGTA) ve collagenase, hepatositlerin yoğunluk gradient arabelleği ile yalıtım ardından derin. Bu izole tetkikine kültür tabaklarda uygun ve donatılmış tetkikine özelliklerinin çoğunluğu korumak. Bu tetkikine doğmakta olan protein sentezi radyoaktif olmayan reaktifleri ile de dahil olmak üzere protein metabolizmasının değerlendirmeler için kullanılabilir. Biz izole tetkikine kolayca kontrol edilir ve daha yüksek bir kalite ve hacim istikrar enerji metabolizması için kemoterapi-seçici ligasyonu tepki Tetramethylrhodamine (TAMRA) protein ile kullanarak bağlı protein sentezi oluşturan göstermek algılama Yöntem ve western Blot analizi. Bu nedenle, bu yöntem hepatik doğmakta olan protein sentezi için enerji homeostazı bağlantılı soruşturma için değerlidir. Aşağıdaki iletişim kuralı malzeme ve Yöntemler yüksek kaliteli birincil fare tetkikine yalıtım ve algılama doğmakta olan protein sentezi için özetliyor.

Introduction

Protein önemli bir besin öğesidir ve insan vücudu kuru ağırlığının yaklaşık % 50 birkaç biyolojik özellikleri ve işlevleri1olan proteinlerin oluşmaktadır. Sonuç olarak, protein sentezi en enerji tüketen olaylardan biri ve bir değişiklik protein metabolizması hastalıkları, metabolik hastalıklar2,3,4de dahil olmak üzere gelişimi ile son derece ilişkilidir. Karaciğerde, protein sentezi için toplam enerji tüketimi5,6yaklaşık % 20-30 hesapları. Buna ek olarak, proteinlerin işlevi sadece pasif veya yapı taşları da etkin sinyal arabuluculuk faktörler ama karaciğer intracellularly veya extracellularly sistemik metabolizma7düzenleyecek. Örneğin, sentezlenmiş ve karaciğer ve plazma8en bol protein tarafından salgılanan, serum albümin düşük düzeyde artar tip 2 diyabet gelişimi9,10, riskini 11, oysa serum albümin daha yüksek bir konsantrasyon metabolik sendrom12geliştirme karşı koruyucudur. Ayrıca, rahatsız veya kesintileri kolesterol homeostazı, lipoproteinler, LDLR ve LRP1, gibi modüle salgı veya membran bağlı hepatik proteinler insülin direnci, hiperlipidemi veya ateroskleroz gelişimi için yol açabilir 13. bu nedenle, protein metabolizması bozukluğu karaciğer ve onun ilişkili metabolik komplikasyonlar katılmaktadırlar moleküler patofizyolojik mekanizmaları kimliği roman farmakolojik keşfetmek için yararlı olabilir başlangıçlı geciktirir veya insülin direnci, diyabet ve non alkolik yağlı karaciğer gibi metabolik hastalıkları tedavi etmek için yaklaşıyor.

Protein sentezi sıkıca bağlı hücresel enerji durumuna (Örneğin, bir peptit bağı oluşumu sırasında protein sentezi uzama adım gerektirir 4 fosfodiester bağları14) ve hissediyorum moleküler yolları tarafından düzenlenmiştir Inter – ve Intra-net – cellular besin durumu15,16. AMP-aktive protein kinaz (AMPK) enerji homeostazı17korumak hücre içi enerji sensörler biridir. Hücresel enerji düzeyleri daha düşük olunca AMPK etkinleştirildiğinde, AMPK ve onun hedeflenen yüzeylerde katabolik yolları teşvik etmek ve protein sentezi18,19gibi anabolik işlemlere inhibe işlev. Protein sentezi düzenlenmesi, birden fazla çeviri faktörleri ve ribozomal proteinler20fosforilasyon tarafından aracılık ettiği. Belirtmek gerekirse memeli rapamycin karmaşık 1 (mTORC1), protein sentezi, büyük bir sürücü AMPK21ana hedeflerinden biri hedeftir. MTORC1 aktivasyonu hücre büyümesi ve nükleer silahların yayılmasına karşı uyarıcı protein çeviri autophagy20,ve21tarafından artırır. Bu nedenle, harekete geçirmek-in AMPK mTORC1-aracılı protein sentezi22inhibe olabilir mantıklı olur. Nitekim, AMPK aktivasyonu çözdüğünü ve doğrudan mTORC1 inactivation23 ve protein biyosentezi24bastırılması için önde gelen treonin kalıntı 2446 (Thr2446) üzerinde phosphorylates. Ayrıca, AMPK dolaylı olarak mTORC1 işlev fosforilasyon ve mTORC1 sinyal art arda sıralı akış yukarı regülatör olan Tüberöz skleroz karmaşık 2 (TSC2)25 aktivasyonu tarafından inhibe olabilir. Kısacası, bu yollar karaciğerde bozukluk genellikle metabolik hastalıklar gelişimine bağlı ve bu nedenle çok enerji tür ile bu yollar rolünü araştırmak için etkili deneysel araçları kurmak için kritik bir ihtiyaç ve protein metabolizmasında tetkikine.

İzole birincil tetkikine fonksiyonel özelliklerini ve daha vivo hepatosit karaciğer kaynaklı vitro hücre hatları26,27,28ile arasında daha güçlü bir benzerlik yoktur. İyi farklılaşmış hepatik kanserli hücreleri ve karaciğer fonksiyonlarını araştırmak için yaygın olarak kullanılan, HepG2 hücreler daha az % 48 bağlamında görüntüler, ancak bu birincil insan hepatositlerin % 77 benzerlik Bu karaciğer biyopsi ile paylaşmak gösterilmiştir Gen ifadesinin29Tercihler. Bu nedenle, ölümsüzleştirdi kültür hücreleri, yerine birincil tetkikine kullanımı araştırma hepatik fonksiyon ve Fizyoloji içinde hayati önem taşımaktadır ve yalıtım ve birincil tetkikine kültürünün çeşitli protokolleri mevcuttur özellikle30,31sıçanlar. Sıçan tetkikine hücreleri nispeten daha yüksek bir verim ile yararlı olmakla birlikte, fare tetkikine genetik olarak modüle fareler geniş durumu nedeniyle birçok bilimsel açıdan büyük bir potansiyele sahiptir. Her nasıl, var birkaç teknik sorunlar üzerinden fareler hücresel ve moleküler-temelli değerlendirmeler için sağlıklı ve bol birincil tetkikine yalıtmaya: ilk olarak, kanül ekleme arabellek reaktifleri ile karaciğer sıvı işlemek çok zordur küçük ve ince fare portal ven veya inferior vena kava nedeniyle; İkinci olarak, daha uzun bir manipülasyon zaman hücre izolasyon sırasında azaltma hücre miktar ve kalite olarak neden olabilir; Üçüncüsü, enzimatik olmayan Mekanik ayırma yöntemleri ciddi zarar görmesine neden ve düşük verim uygun izole birincil tetkikine32,33üretmek. 1980’lerde, collagenase perfüzyon tekniği tetkikine hayvanlar34karaciğerleri üzerinden yalıtmak için kullanılmaya başlandı. Bu yöntem collagenase perfüzyon karaciğer35,36,37, infüzyon ile kalsiyum şelatör çözüm38,39, enzimatik sindirim karaciğer dayanır ve Mekanik ayrışma karaciğer parankimi35. İlk adımda, bir fare karaciğer [Ca2 +] şelatör (ethylenediamine tetraacetic asit, EDTA) içeren kalsiyum [Ca2 +] boş bir arabellek ile derin. İkinci adımda, fare karaciğer cep-hücre dışı matriks etkileşimleri hidrolize için collagenase içeren arabellek ile derin. Bir adımda kullanılan arabellek [Ca2 +] İkinci adım arabellek iyonu varlığı etkili collagenase etkinlik, sonra sindirilir karaciğer vardır daha fazla yavaşça ve mekanik arasında forseps kullanarak ayrı kalmak için gereklidir Hepatik kapsül ve parenchymatous doku. Son olarak, bağ dokusu süzerek kaldırılır ve sonraki Santrifüjü hem parenkima olmayan hücrelerden uygun tetkikine ve olmayan yaşam hepatosit ayıran yoğunluk gradient arabellek40,41 kullanımı ile ,42. Bu da çalışmanın, protein sentezi analizi için bir fare karaciğer üzerinden birincil tetkikine yalıtmak için değiştirilmiş iki adım collagenase perfüzyon tekniği gösteriyoruz.

Proteinlerin radiolabeling yaygın ifade düzeyleri, ciro oranları, ölçmek ve proteinler43 radyoaktivite44tespiti yüksek duyarlılık nedeniyle biyolojik dağılımını belirlemek için kullanılır. Ancak, radyoaktif izotoplar kullanımı son derece kontrollü araştırma45şartlar ve yordamlar gerektirir. Alternatif radyoaktif olmayan yöntemler geliştirilmiştir ve giderek popülerlik kazanmıştır. Bir Tetramethylrhodamine (TAMRA) protein algılama yöntemi ile kemoterapi-seçici ligasyonu reaksiyon onlardan biri ve hücresel olaylar gibi analiz etmek için kullanılan bir azid ve alkin grupları46arasında kemoterapi seçmeli reaksiyon temel alır yeni doğmakta olan protein sentezi ve bir azid grubuyla değiştiren glikoproteinlerin alt sınıflarını tespit. Yeni doğmakta olan protein sentezi için L-Azidohomoalanine (L-AHA, bir azid-modified amino asit) olabilir metabolik olarak proteinler dahil ve TAMRA protein algılama yöntemi47kullanarak algılandı. Bu tahlil birincil fare tetkikine kullanarak, biz yeni doğmakta olan protein sentez hızı sıkıca ATP kullanılabilirliğini üzerinden mitokondrial bağlantılı olduğunu göstermek ve AMPK harekete geçirmek (Şekil 1).

Özet olarak, birincil fare tetkikine kullanımı protein ve enerji metabolizması soruşturma için çok önemli ve doğmakta olan protein sentezi miktarının yolları geliştirme için ilgili fizyolojik rolü anlayışlar kazanmak için değerli ve hepatosit ile ilgili hastalıkların tedavisi.

Protocol

Bu iletişim kuralı laboratuvar fareler kullanımını içerir. Hayvan bakımı ve deneysel prosedürler Cincinnati Çocuk Hastanesi Tıp Merkezi hayvan bakımı komiteleri tarafından onaylanmış yordamlara göre yapıldı. 1. birincil fare tetkikine yalıtım Öncesi yalıtım ürünleri 450 mL % 40 yoğunluk gradient arabelleği Tablo 1 ve tutun 4 ° c (15 mL/fare) açıklandığı şekilde hazırlayın. Williams ın orta 500 mL Tablo …

Representative Results

Birincil fare tetkikine yalıtım yaklaşık 20 x 106 toplam hücreleri/fare bir verim içinde sonuçlanır. Histolojik olarak, canlı ve iliştirilmiş birincil tetkikine poligonal görünür veya tipik altıgen şeklinde ile açıkça membranöz sınır 24 h kuluçka (Şekil 2) sonra belirtildiği. İzole hücrelerdir birincil tetkikine olup olmadığını doğrulamak için albumin prot…

Discussion

Her ne kadar birden fazla ölümsüzleştirdi karaciğer hücre satır önerilen ve karaciğer fonksiyonları49,50,51,52araştırmak için kullanılan, bu hücreler genellikle önemli ve temel eksikliği Albümin (Şekil 3) ifadesi gibi normal tetkikine fonksiyonları. Bu yaygın, bu nedenle, birincil tetkikine kullanan karaciğer fizyolojisi ve metabolizma kültü…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Biz Drs. Joonbae Seo ve Vivian Hwa onların bilimsel girdi ve tartışma için teşekkür ederiz. Bu eser Ulusal Sağlık Enstitüsü tarafından (NIH) (R01DK107530) destek verdi. T.N. PRESTO Japonya bilim ve teknoloji ajansı tarafından desteklenmiştir. Bu çalışmanın bir parçası NIH (P30DK078392) sindirim hastalığı araştırma çekirdek merkezi Cincinnati için bir hibe tarafından desteklenmiştir.

Materials

HEPES buffer Fisher Scientific BP310-500
D-glucose Fisher Scientific D16-500
Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-tetraacetic acid AmericanBio AB00505-00025
Antibiotic-Antimycotic (100X) Gibco 15240-062
HBSS (10X) no calcium, magnesium, phenol red Gibco 14185-052
Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2.2H2O) Fisher Scientific C79-500
Density gradient buffer GE Healthcare 17-0891-02
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) low glucose, pyruvate Gibco 11885-084
Fetal Bovine Serum Hyclone SH30910.03
Phosphate Buffered Saline (PBS) (1X) Gibco 1897141
Williams medium E, no glutamine Gibco 12551-032
L-alanyl-L-glutamine dipeptide supplement Gibco 35050-061
Collagenase Type X Wako Pure Chemical Industries 039-17864
Perfusion pump Cole-Parmer Masterflex L/S Equipment
IV administration set EXELINT 29081 Equipment
A water bath REVSCI RS-PB-200 Equipment
Tube heater Fisher Scientific Isotemp Equipment
Ethanol Decon Lab, Inc 0-39613
Isoflurane PHOENIX 10250
Autoclaved Cotton Tips Fisherbrand 23-400-124
100 mm Petri Dish TPP 93100
Connector (Male Luer Lock Ring) Cole-Parmer instrument EW-4551807
24G catheters TERUMO Surflo 24Gx3/4'
100 μm Filter (CELL STRAINERS) VWR 10199-658
15 ml conical-bottom centrifuge tubes VWR 89039-666
50 ml conical-bottom centrifuge tubes VWR 89039-658
Chemoselective ligation reaction PROTEIN ANALYSIS DETECTION KIT, TAMRA ALKYNE Invitrogen C33370
AHA (L-azidohomoalanine) Invitrogen C10102
DMEM (methionine free) Gibco 21013024
L-Cystine Dihydrochloride SIGMA C2526
Laemmli sample buffer BioRad 161-0737
Protease Inhibitor Cocktail SIGMA P9599
SDS solution (20%) BioRad 161-0418
Tris-HCL (1M) American Bioanalytical AB14044-01000
Phosphatase Inhibitor Cocktail SIGMA P5726
Protein concentration measuring Kit (Bovin Serum Albumin-BSA) BioRad 500-0207
6-well tissue culture plate TPP 92006
Digital Heatblock VWR 12621-092 Equipment
Multi-Rotator Grant-bio PTR-60 Equipment
Ultrasonic Sonicator Cole-Parmer GE130PB Equipment
Standard Heavy-Duty Vortex Mixer VWR 97043-566 Equipment
A variable mode laser scanner GE Healthcare Life Science FLA 9500 Equipment
Coomassie-dye reagent Thermo Scientific 24594
Inverted microscope Olympus CKX53 Equipment
Western Blotting apparatus BioRad 1658004 Equipment
Centrifuge Eppendorf 5424R Equipment
Automated cell counter BioRad TC20 Equipment
FluorChem R system proteinsimple – Equipment
p-Ampka (T172) antibody Cell signaling 2535
Total-AMPK antibody Cell signaling 5832
Albumin antibody Cell signaling 4929
beta actin antibody Santa Cruz sc-130656
Fine scissors and forceps
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Forbes, R. M., Cooper, A. R., Mitchell, H. H. The composition of the adult human body as determined by chemical analysis. Journal of Biological Chemistry. 203, 359-366 (1953).
  2. Charlton, M. R. Protein metabolism and liver disease. Baillieres Clinical Endocrinology and Metabolism. 10, 617-635 (1996).
  3. De, F. P., Lucidi, P. Liver protein synthesis in physiology and in disease states. Current Opinion in Clinical Nutrition and Metabolic Care. 5, 47-50 (2002).
  4. Stoll, B., Gerok, W., Lang, F., Haussinger, D. Liver cell volume and protein synthesis. Biochemical Journal. 287 (Pt 1), 217-222 (1992).
  5. Brown, G. C. Control of respiration and ATP synthesis in mammalian mitochondria and cells. Biochemical Journal. 284 (Pt 1), 1-13 (1992).
  6. Buttgereit, F., Brand, M. D. A hierarchy of ATP-consuming processes in mammalian cells. Biochemical Journal. 312 (Pt 1), 163-167 (1995).
  7. Morrison, C. D., Laeger, T. Protein-dependent regulation of feeding and metabolism. Trends in Endocrinology and Metabolism. 26, 256-262 (2015).
  8. Bernardi, M., Ricci, C. S., Zaccherini, G. Role of human albumin in the management of complications of liver cirrhosis. Journal of Clinical and Experimental Hepatology. 4, 302-311 (2014).
  9. Abbasi, A., et al. Liver function tests and risk prediction of incident type 2 diabetes: evaluation in two independent cohorts. PLoS. One. 7, e51496 (2012).
  10. Schmidt, M. I., et al. Markers of inflammation and prediction of diabetes mellitus in adults (Atherosclerosis Risk in Communities study): a cohort study. Lancet. 353, 1649-1652 (1999).
  11. Stranges, S., et al. Additional contribution of emerging risk factors to the prediction of the risk of type 2 diabetes: evidence from the Western New York Study. Obesity (Silver Spring). 16, 1370-1376 (2008).
  12. Jin, S. M., et al. Change in serum albumin concentration is inversely and independently associated with risk of incident metabolic syndrome. Metabolism. 65, 1629-1635 (2016).
  13. Sluis, B., Wijers, M., Herz, J. News on the molecular regulation and function of hepatic low-density lipoprotein receptor and LDLR-related protein 1. Current Opinion in Lipidology. 28, 241-247 (2017).
  14. Viollet, B., et al. Activation of AMP-activated protein kinase in the liver: a new strategy for the management of metabolic hepatic disorders. Journal of Physiology. 574, 41-53 (2006).
  15. Li, H., Lee, J., He, C., Zou, M. H., Xie, Z. Suppression of the mTORC1/STAT3/Notch1 pathway by activated AMPK prevents hepatic insulin resistance induced by excess amino acids. Amerian Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 306, E197-E209 (2014).
  16. Qian, S. B., et al. mTORC1 links protein quality and quantity control by sensing chaperone availability. The Journal of Biological Chemistry. 285, 27385-27395 (2010).
  17. Carling, D. The AMP-activated protein kinase cascade–a unifying system for energy control. Trends in Biochemical Sciences. 29, 18-24 (2004).
  18. Hardie, D. G., Scott, J. W., Pan, D. A., Hudson, E. R. Management of cellular energy by the AMP-activated protein kinase system. FEBS Letters. 546, 113-120 (2003).
  19. Li, H., et al. AMPK activation prevents excess nutrient-induced hepatic lipid accumulation by inhibiting mTORC1 signaling and endoplasmic reticulum stress response. Biochimica et Biophysica Acta. 1842, 1844-1854 (2014).
  20. Proud, C. G. Role of mTOR signalling in the control of translation initiation and elongation by nutrients. Current Topics in Microbiology and Immunology. 279, 215-244 (2004).
  21. Sarbassov, D. D., Ali, S. M., Sabatini, D. M. Growing roles for the mTOR pathway. Current Opinion in Cell Biology. 17, 596-603 (2005).
  22. Reiter, A. K., Bolster, D. R., Crozier, S. J., Kimball, S. R., Jefferson, L. S. Repression of protein synthesis and mTOR signaling in rat liver mediated by the AMPK activator aminoimidazole carboxamide ribonucleoside. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 288, E980-E988 (2005).
  23. Cheng, S. W., Fryer, L. G., Carling, D., Shepherd, P. R. Thr2446 is a novel mammalian target of rapamycin (mTOR) phosphorylation site regulated by nutrient status. Journal of Biological Chemistry. 279, 15719-15722 (2004).
  24. Howell, J. J., et al. Metformin Inhibits Hepatic mTORC1 Signaling via Dose-Dependent Mechanisms Involving AMPK and the TSC Complex. Cell Metabolism. 25, 463-471 (2017).
  25. Inoki, K., Zhu, T., Guan, K. L. TSC2 mediates cellular energy response to control cell growth and survival. Cell. 115, 577-590 (2003).
  26. Wilkening, S., Stahl, F., Bader, A. Comparison of primary human hepatocytes and hepatoma cell line Hepg2 with regard to their biotransformation properties. Drug Metabolism Disposition. 31, 1035-1042 (2003).
  27. Li, A. P., et al. Present status of the application of cryopreserved hepatocytes in the evaluation of xenobiotics: consensus of an international expert panel. Chemico-Biology Interactaction. 121, 117-123 (1999).
  28. Hengstler, J. G., et al. Cryopreserved primary hepatocytes as a constantly available in vitro model for the evaluation of human and animal drug metabolism and enzyme induction. Drug Metabolism and Reviews. 32, 81-118 (2000).
  29. Olsavsky, K. M., et al. Gene expression profiling and differentiation assessment in primary human hepatocyte cultures, established hepatoma cell lines, and human liver tissues. Toxicology and Applied Pharmacology. 222, 42-56 (2007).
  30. Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q., Liu, M. Isolation and primary culture of rat hepatic cells. Journal of Visualized Experiments. , (2012).
  31. Li, Y., Cai, S., Zhang, L., Li, X. Simultaneous isolation and primary culture of rat hepatocytes, hepatic stellate cells, Kupffer’s cells and hepatic sinus endothelial cells. Nan. Fang Yi. Ke. Da. Xue. Xue. Bao. 34, 532-537 (2014).
  32. Edwards, M., Houseman, L., Phillips, I. R., Shephard, E. A. Isolation of mouse hepatocytes. Methods in Molecular Biology. 987, 283-293 (2013).
  33. Schreiber, G., Schreiber, M. The preparation of single cell suspensions from liver and their use for the study of protein synthesis. Subcellular Biochemistry. 2, 307-353 (1973).
  34. Klaunig, J. E., Goldblatt, P. J., Hinton, D. E., Lipsky, M. M., Trump, B. F. Mouse liver cell culture. II. Primary culture. In Vitro. 17, 926-934 (1981).
  35. Puviani, A. C., Ottolenghi, C., Tassinari, B., Pazzi, P., Morsiani, E. An update on high-yield hepatocyte isolation methods and on the potential clinical use of isolated liver cells. Comparative Biochemistry and Physiology A Molecular and Integrative Physiology. 121, 99-109 (1998).
  36. Park, K. H., Song, S. C. Morphology of spheroidal hepatocytes within injectable, biodegradable, and thermosensitive poly(organophosphazene) hydrogel as cell delivery vehicle. Journal of Biosciences and Bioengineering. 101, 238-242 (2006).
  37. Li, K., et al. Improved performance of primary rat hepatocytes on blended natural polymers. Journal of Biomedicine and Material Research Part A. 75, 268-274 (2005).
  38. Battle, T., Stacey, G. Cell culture models for hepatotoxicology. Cell Biology Toxicology. 17, 287-299 (2001).
  39. Kravchenko, L., Petrenko, A., Shanina, I., Fuller, B. A simple non-enzymatic method for the isolation of high yields of functional rat hepatocytes. Cell Biology International. 26, 1003-1006 (2002).
  40. Berry, M. N., Grivell, A. R., Grivell, M. B., Phillips, J. W. Isolated hepatocytes–past, present and future. Cell Biology and Toxicology. 13, 223-233 (1997).
  41. Jiang, Q. D., et al. Isolation and identification of bovine primary hepatocytes. Genetics and Molecular Research. 12, 5186-5194 (2013).
  42. Pertoft, H., Laurent, T. C., Laas, T., Kagedal, L. Density gradients prepared from colloidal silica particles coated by polyvinylpyrrolidone (Percoll). Analytical Biochemistry. 88, 271-282 (1978).
  43. Lipford, G. B., Feng, Q., Wright, G. L. A method for separating bound versus unbound label during radioiodination. Analytical Biochemistry. 187, 133-135 (1990).
  44. Mukai, T., et al. In-vivo evaluation of indium-111-diethylenetriaminepentaacetic acid-labelling for determining the sites and rates of protein catabolism in mice. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 51, 15-20 (1999).
  45. Wilson, M. S. C., Saiardi, A. Importance of Radioactive Labelling to Elucidate Inositol Polyphosphate Signalling. Topics in Current Chemistry. 375, 14 (2017).
  46. Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. A stepwise huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective "ligation" of azides and terminal alkynes. Angewandte Chemie International Edition. 41, 2596-2599 (2002).
  47. Banerjee, P. S., Ostapchuk, P., Hearing, P., Carrico, I. S. Unnatural amino acid incorporation onto adenoviral (Ad) coat proteins facilitates chemoselective modification and retargeting of Ad type 5 vectors. Journal of Virology. 85, 7546-7554 (2011).
  48. Hou, W. L., et al. Inhibition of mitochondrial complex I improves glucose metabolism independently of AMPK activation. Journal of Cell Molecular Medicine. 22, 1316-1328 (2018).
  49. Davalos, A., et al. miR-33a/b contribute to the regulation of fatty acid metabolism and insulin signaling. Proceedings of the National Academy of Science. , 9232-9237 (2011).
  50. DiPersio, C. M., Jackson, D. A., Zaret, K. S. The extracellular matrix coordinately modulates liver transcription factors and hepatocyte morphology. Molecular and Cellular Biology. 11, 4405-4414 (1991).
  51. Xu, L., et al. Human hepatic stellate cell lines, LX-1 and LX-2: new tools for analysis of hepatic fibrosis. Gut. 54, 142-151 (2005).
  52. Yang, L., Li, P., Fu, S., Calay, E. S., Hotamisligil, G. S. Defective hepatic autophagy in obesity promotes ER stress and causes insulin resistance. Cell Metabolism. 11, 467-478 (2010).
  53. Heinz, S., et al. Mechanistic Investigations of the Mitochondrial Complex I Inhibitor Rotenone in the Context of Pharmacological and Safety Evaluation. Science Reports. 7, 45465 (2017).

Tags

Primary Mouse HepatocytesNascent Protein SynthesisL-azidohomoalanine LabelingNon-radioactiveLiver PerfusionCollagenaseDensity Gradient SeparationMetabolic Disease ResearchObesityNon-alcoholic Fatty LiverType Two Diabetes

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Salem, E. S., Murakami, K., Takahashi, T., Bernhard, E., Borra, V., Bethi, M., Nakamura, T. Isolation of Primary Mouse Hepatocytes for Nascent Protein Synthesis Analysis by Non-radioactive L-azidohomoalanine Labeling Method. J. Vis. Exp. (140), e58323, doi:10.3791/58323 (2018).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image