Isolamento degli epatociti primari del topo per l'analisi di sintesi della proteina nascente dal metodo di etichettatura Non radioattivo L-azidohomoalanine
Summary
Qui, presentiamo un protocollo per l’isolamento degli epatociti primari del topo sano e funzionale. Istruzioni per la rilevazione sintesi epatica delle proteine nascenti dal substrato di etichettatura non radioattivo erano fornite per aiutarvi a comprendere i meccanismi alla base della sintesi proteica nel contesto dell’omeostasi del metabolismo energetico nel fegato.
Abstract
Gli epatociti sono cellule parenchimatiche del fegato e coinvolgere più funzioni metaboliche, tra cui la sintesi e la secrezione di proteine essenziali per l’omeostasi energetica sistemica. Epatociti primari isolati dal fegato murino costituiscono un prezioso strumento biologico per comprendere le proprietà funzionali o le alterazioni che si verificano nel fegato. Qui descriviamo un metodo per l’isolamento e la coltura di epatociti primari del topo eseguendo una tecnica di perfusione in due fasi della collagenosi ed discutere la loro utilizzazione per indagare il metabolismo delle proteine. Il fegato di un topo adulto in sequenza è irrorato con acido tetraacetico di glicole etilenico-bis (EGTA) e la collagenosi, seguita dall’isolamento degli epatociti con il buffer di gradienti di densità. Questi epatociti isolati sono vitali su piastre di coltura e mantengono la maggior parte delle caratteristiche dotate degli epatociti. Questi epatociti possono essere utilizzati per le valutazioni del metabolismo delle proteine tra cui sintesi proteica nascente con reagenti non radioattivo. Indichiamo che gli epatociti isolati sono facilmente controllati e comprendono una maggiore stabilità di qualità e volume di sintesi delle proteine legata al metabolismo energetico utilizzando la reazione di legatura chemo-selettive con una proteina di tetrametilrodamina (TAMRA) Metodo di rilevazione e analisi macchiantesi occidentali. Pertanto, questo metodo è prezioso per lo studio di sintesi epatica della proteina nascente collegata all’omeostasi energetica. Il seguente protocollo descrive i metodi per il rilevamento della sintesi proteica nascente e l’isolamento degli epatociti primari del topo di alta qualità e materiali.
Introduction
La proteina è un elemento nutritivo importante e circa il 50% del peso secco del corpo umano è composto di proteine che hanno diversi tratti biologici e funzioni1. Di conseguenza, la sintesi delle proteine è uno della maggior parte degli eventi che richiede energia e un’alterazione nel metabolismo delle proteine altamente è associata con lo sviluppo di malattie, tra cui malattie metaboliche2,3,4. Nel fegato, biosintesi della proteina rappresenta circa 20 – 30% del consumo totale di energia5,6. Inoltre, la funzione di proteine come non solo passivo o blocchi del fegato, ma attivi anche fattori che mediano segnale intracellulare o extracellularly a regolare il metabolismo sistemico7. Per esempio, la riduzione dei livelli di albumina di siero, che viene sintetizzata e secreta dal fegato e la proteina più abbondante nel plasma8, aumenta il rischio di tipo 2 diabete sviluppo9,10, 11, mentre una maggiore concentrazione di albumina è protettiva contro lo sviluppo di sindrome metabolica12. Inoltre, disturbi o interruzioni delle proteine epatiche secretive o membrana-limita, che modulano l’omeostasi del colesterolo, incluse le lipoproteine e LDLR LRP1, possono portare allo sviluppo di insulino-resistenza, iperlipidemia o aterosclerosi 13. Pertanto, l’identificazione dei meccanismi molecolari patofisiologici che sono coinvolti nella dispersione del metabolismo della proteina nel fegato e delle complicanze metaboliche associate potrebbe essere utile per scoprire romanzo farmacologico si avvicina per ritardare l’insorgenza o trattare malattie metaboliche come l’insulino-resistenza, diabete e steatosi epatica non alcolica.
Sintesi proteica è strettamente legata allo stato di energia cellulare (ad es., la formazione di un legame peptidico durante la fase di allungamento della sintesi proteica richiede di legami fosfodiesterei 414) ed è regolata da meccanismi molecolari che senso Inter – e intra – cellulari disponibilità nutriente15,16. Chinasi proteica AMP-attivata (AMPK) è uno dei sensori di energia intracellulare che mantengono l’omeostasi di energia17. Una volta AMPK attivata quando i livelli energetici cellulari diventano più bassi, AMPK e suoi substrati mirate funzionano per stimolare le vie cataboliche e inibire i processi anabolici compreso proteina sintesi18,19. La regolazione della sintesi proteica è mediata dalla fosforilazione di molteplici fattori di traduzione e proteine ribosomiali20. Di nota, l’obiettivo mammifero della rapamicina complesso 1 (mTORC1), delle principali cause della sintesi proteica, è uno degli obiettivi principali di AMPK21. Attivazione del pathway di mTORC1 migliora la crescita delle cellule e la proliferazione di stimolante proteina traduzione e autofagia20,21. Pertanto, è logico che l’attivazione di AMPK può inibire la sintesi di mTORC1-mediato della proteina22. Infatti, l’attivazione di AMPK contrasta e fosforila direttamente mTORC1 il residuo di treonina 2446 (Thr2446) che conduce alla sua inattivazione23 e la soppressione della proteina biosintesi24. Inoltre, AMPK indirettamente può inibire la funzione di mTORC1 di fosforilazione e l’attivazione della sclerosi tuberosa complessa 2 (TSC2)25 che è il regolatore a Monte della cascata di segnalazione di mTORC1. In breve, disregolazione di queste vie nel fegato è spesso legata allo sviluppo di malattie metaboliche e di conseguenza c’è una necessità critica di stabilire efficaci strumenti sperimentali per studiare il ruolo di queste vie nella regolazione dell’energia e metabolismo delle proteine negli epatociti.
C’è una forte somiglianza tra le proprietà funzionali di epatociti primari isolati e in vivo gli epatociti rispetto con in vitro fegato-derivato delle cellule linee26,27,28. È stato dimostrato che epatociti umani primari condividano 77% somiglianza con quello delle biopsie del fegato, mentre le cellule HepG2, che sono cellule cancerose epatiche ben differenziate e ampiamente utilizzati per indagare le funzioni epatiche, visualizzare inferiore al 48% nel contesto della 29di profili di espressione genica. Pertanto, l’utilizzo di epatociti primari, piuttosto che le cellule immortalizzate cultura, è di vitale importanza nella ricerca di fisiologia e funzione epatica, e diversi protocolli sono disponibili per l’isolamento e la coltura di epatociti primari soprattutto da ratti30,31. Mentre gli epatociti di ratto sono utili con un rendimento relativamente più elevato di cellule, epatociti del topo hanno un potenziale maggiore in molti aspetti scientifici grazie alla vasta disponibilità di topi geneticamente modulati. Tuttavia, ci sono diverse sfide tecniche in isolamento sani e abbondanti epatociti primari dai topi per cellulare e molecolare-valutazioni basate su: in primo luogo, inserimento della cannula per irrorare il fegato con i reagenti buffer è molto difficile da gestire a causa del mouse piccolo e sottile vena portale o la vena cava inferiore; in secondo luogo, un tempo più lungo di manipolazione delle cellule durante l’isolamento può causare riduzione nella cella quantità e qualità; metodi di separazione meccanica in terzo luogo, non-enzimatica possono causare seri danni e produrre un rendimento basso di epatociti primari isolato vitali32,33. Nel 1980, tecnica di aspersione della collagenosi è stato introdotto per isolare gli epatociti dal fegato di animali34. Questo metodo si basa sulla perfusione collagenosi del fegato35,36,37, infusione del fegato con calcio chelante soluzione38,39, digestione enzimatica e dissociazione meccanica del parenchima epatico35. Nel primo passaggio, un fegato di topo è irrorato con un buffer liberi di calcio [Ca2 +] contenente un chelatore [Ca2 +] (etilenediammina acido etilendiamminotetraacetico, EDTA). Nel secondo passaggio, il fegato di topo è irrorato con un buffer contenente collagenasi per idrolizzare le interazioni cellulari-matrice extracellulare. A differenza di buffer utilizzato nella prima fase, la presenza di ioni [Ca2 +] nel buffer del secondo passaggio è necessaria per l’attività della collagenosi efficace, dopo di che il fegato digerito deve essere ulteriormente delicatamente e meccanicamente separati utilizzando forcipe tra il capsula epatica e tessuti parenchimatosi. Infine, tessuto connettivo viene rimosso dal filtro e successiva centrifugazione separa epatociti vitali dalle cellule non parenchimali sia e non-viventi epatociti con l’uso di densità gradiente buffer40,41 ,42. Nello studio presente, vi mostriamo una tecnica di aspersione di collagenasi modificate in due fasi per isolare epatociti primari da un fegato di topo per l’analisi della sintesi proteica.
La radiomarcatura di proteine è ampiamente usato per quantificare i livelli di espressione, tassi di fatturato e determinare la distribuzione biologica delle proteine43 grazie all’elevata sensibilità di rilevazione di radioattività44. Tuttavia, l’uso di isotopi radioattivi richiede circostanze e delle procedure di ricerca altamente controllata45. Metodi alternativi non radioattivo sono stati sviluppati e sempre più hanno guadagnato in popolarità. La reazione di legatura chemo-selettive con un metodo di rilevazione della proteina tetrametilrodamina (TAMRA) è uno di loro e si basa sulla reazione tra un’azide e alchino gruppi46, che può essere utilizzata per analizzare gli eventi cellulari come chemo-selettive rilevamento di sintesi proteica nascente e sottoclassi delle glicoproteine per volta con un gruppo di azide. Per la sintesi proteica nascente, L-Azidohomoalanine (L-AHA, un amminoacido per volta azide) può essere incorporato nelle proteine metabolicamente e rilevato utilizzando il TAMRA proteina rilevamento metodo47. Usando questo test in epatociti primari del topo, indichiamo che il tasso di sintesi proteica nascente è strettamente legato alla disponibilità di ATP da mitocondriale e l’attivazione di AMPK (Figura 1).
In sintesi, l’utilizzo di epatociti primari del topo è fondamentale per indagare il metabolismo proteico ed energetico e quantificare la sintesi proteica nascente è prezioso per ottenere approfondimenti il ruolo fisiologico delle vie rilevanti per lo sviluppo e cura delle malattie relative dell’epatocita.
Protocol
Representative Results
Discussion
Anche se parecchie linee cellulari immortalizzate epatiche sono state proposte e utilizzati per indagare le funzioni epatiche49,50,51,52, queste cellule mancano generalmente importante e fondamentale funzioni degli epatociti normali, quali l’espressione di albumina (Figura 3). È ampiamente riconosciuto, pertanto, che utilizzando epatociti primari è un’opzione imp…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo la d. ssa Joonbae Seo e Vivian Hwa per il loro contributo scientifico e la discussione. Questo lavoro è stato supportato dal National Institute of Health (NIH) (R01DK107530). T.N. è stato sostenuto da PRESTO dalla Japan Science and Technology Agency. Una parte di questo studio è stata sostenuta da una sovvenzione dal NIH (P30DK078392) per il digestivo malattia Research Core Center di Cincinnati.
Materials
| HEPES buffer | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| D-glucose | Fisher Scientific | D16-500 | |
| Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-tetraacetic acid | AmericanBio | AB00505-00025 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240-062 | |
| HBSS (10X) no calcium, magnesium, phenol red | Gibco | 14185-052 | |
| Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2.2H2O) | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Density gradient buffer | GE Healthcare | 17-0891-02 | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) low glucose, pyruvate | Gibco | 11885-084 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30910.03 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) (1X) | Gibco | 1897141 | |
| Williams medium E, no glutamine | Gibco | 12551-032 | |
| L-alanyl-L-glutamine dipeptide supplement | Gibco | 35050-061 | |
| Collagenase Type X | Wako Pure Chemical Industries | 039-17864 | |
| Perfusion pump | Cole-Parmer | Masterflex L/S | Equipment |
| IV administration set | EXELINT | 29081 | Equipment |
| A water bath | REVSCI | RS-PB-200 | Equipment |
| Tube heater | Fisher Scientific | Isotemp | Equipment |
| Ethanol | Decon Lab, Inc | 0-39613 | |
| Isoflurane | PHOENIX | 10250 | |
| Autoclaved Cotton Tips | Fisherbrand | 23-400-124 | |
| 100 mm Petri Dish | TPP | 93100 | |
| Connector (Male Luer Lock Ring) | Cole-Parmer instrument | EW-4551807 | |
| 24G catheters | TERUMO | Surflo 24Gx3/4' | |
| 100 μm Filter (CELL STRAINERS) | VWR | 10199-658 | |
| 15 ml conical-bottom centrifuge tubes | VWR | 89039-666 | |
| 50 ml conical-bottom centrifuge tubes | VWR | 89039-658 | |
| Chemoselective ligation reaction PROTEIN ANALYSIS DETECTION KIT, TAMRA ALKYNE | Invitrogen | C33370 | |
| AHA (L-azidohomoalanine) | Invitrogen | C10102 | |
| DMEM (methionine free) | Gibco | 21013024 | |
| L-Cystine Dihydrochloride | SIGMA | C2526 | |
| Laemmli sample buffer | BioRad | 161-0737 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | SIGMA | P9599 | |
| SDS solution (20%) | BioRad | 161-0418 | |
| Tris-HCL (1M) | American Bioanalytical | AB14044-01000 | |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail | SIGMA | P5726 | |
| Protein concentration measuring Kit (Bovin Serum Albumin-BSA) | BioRad | 500-0207 | |
| 6-well tissue culture plate | TPP | 92006 | |
| Digital Heatblock | VWR | 12621-092 | Equipment |
| Multi-Rotator | Grant-bio | PTR-60 | Equipment |
| Ultrasonic Sonicator | Cole-Parmer | GE130PB | Equipment |
| Standard Heavy-Duty Vortex Mixer | VWR | 97043-566 | Equipment |
| A variable mode laser scanner | GE Healthcare Life Science | FLA 9500 | Equipment |
| Coomassie-dye reagent | Thermo Scientific | 24594 | |
| Inverted microscope | Olympus | CKX53 | Equipment |
| Western Blotting apparatus | BioRad | 1658004 | Equipment |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | Equipment |
| Automated cell counter | BioRad | TC20 | Equipment |
| FluorChem R system | proteinsimple | – | Equipment |
| p-Ampka (T172) antibody | Cell signaling | 2535 | |
| Total-AMPK antibody | Cell signaling | 5832 | |
| Albumin antibody | Cell signaling | 4929 | |
| beta actin antibody | Santa Cruz | sc-130656 | |
| Fine scissors and forceps |
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